Xây dựng quy trình định lượng testosteron trong Lộc nhung (Cornu cervi parvum) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: Nguyễn Thị Thanh Triều | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

65
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm Xây dựng quy trình định lượng testosteron trong Lộc nhung (Cornu cervi parvum) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Qua đó cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá chất lượng Lộc nhung thông qua việc định lượng testosteron bằng HPLC.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình định lượng testosteron trong Lộc nhung (Cornu cervi parvum) bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TESTOSTERON TRONG LỘC NHUNG (Cornu cervi parvum) BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Nguyễn Đức Học*; Phạm Văn Hiển*; Vũ Bình Dương* Lê Minh Hoàng**; Trịnh Thanh Hùng***; Võ Quang Hợp* TÓM TẮT Mục tiêu: xây dựng phương pháp định lượng testosteron trong Lộc nhung (Cornu cervi parvum) bằng HPLC. Đối tượng và phương pháp: mẫu Lộc nhung do Công ty Dược liệu Sơn Lâm cung cấp, thu mua tại Hương Sơn, Hà Tĩnh, đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV. Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng theo hướng dẫn của ICH, Bộ Y tế Việt Nam. Kết quả: xác định được điều kiện sắc ký gồm: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV đo ở 254 nm, dung môi pha động là ACN:H2O chạy theo chương trình gradient, tốc độ dòng 0,8 0 ml/phút, nhiệt độ cột 30 C. Phương pháp đã được thẩm định, bảo đảm các yêu cầu của phương pháp phân tích gồm tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng (LOQ) và giới hạn phát hiện (LOD). Kết luận: đã xây dựng và thẩm định được phương pháp định lượng testosteron trong Lộc nhung bằng phương pháp HPLC, áp dụng quy trình trên để định lượng một số mẫu Lộc nhung trên thị trường. * Từ khóa: Lộc nhung (Cornu cervi parvum); Testosteron; HPLC. Determination of Testosterone from Deer Velvet (Cornu cervi parvum) using HPLC Summary Objectives: Establishment and validation of testosterone from deer velvet (Cornu cervi parvum) using HPLC. Materials and methods: Deer velvet was supported by Sonlam company that was th harvested from Hatinh province, passed requirement of Vietnamese Pharmacopoeia, Ed. 4 . The validation was carried out in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health guideline. Results: The quantification method of testosterone from deer velvet was established and validated completing of selectivity, linerity, presison, accuracy, LOD and LOQ. Conclusions: The quantification method of testosterone from deer velvet was validated fully in accordance with ICH and Vietnam Ministry of Health. * Key words: Cornu cervi parvum; Testosterone; HPLC. * Học viện Quân y ** Đại học Y Dược Cần Thơ *** Bộ Khoa học và Công nghệ Người phản hồi (Corresponding): Vũ Bình Dương (vbduong2978@gmail.com) Ngày nhận bài: 15/07/2016; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 24/08/2016 Ngày bài báo được đăng: 07/09/2016 86 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 ĐẶT VẤN ĐỀ Lộc nhung (Cornu cervi parvum) là vị thuốc quý, được lấy từ sừng non của hươu hoặc nai đực. Lộc nhung có tác dụng tăng cường sinh lực, giảm mệt mỏi, giúp vết thương mau lành, lợi tiểu, tăng nhu động ruột và dạ dày, giúp chuyển hóa tốt protid và gluxit [2]. Đặc biệt, Lộc nhung còn có tác dụng tốt cho nam giới, giúp sinh tinh, bổ huyết, chữa liệt dương, hoạt tinh, mạnh gân cốt, dùng cho mọi trường hợp hư tổn cơ thể [2, 3]. Trong Lộc nhung chứa nhiều thành phần tốt cho sức khoẻ như: các khoáng chất và yếu tố vi lượng, các axit amin và nội tiết tố (testosteron, estron, cortison…) [2, 3]. Trong đó, testosteron có tác dụng tăng cường khả năng sinh tinh, chữa liệt dương... [2, 3]. Tuy nhiên, hoạt chất này trong Lộc nhung vẫn chưa được quan tâm và nghiên cứu nhiều về phương pháp định lượng. Dược điển Việt Nam IV đã có chuyên luận riêng, nhưng các chỉ tiêu chất lượng chỉ dừng lại ở mức định tính [1]. Vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm: Cung cấp cơ sở khoa học để đánh giá chất lượng Lộc nhung thông qua việc định lượng testosteron bằng HPLC. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Nguyên liệu và thiết bị. - Lộc nhung thu mua tại Hương Sơn, Hà Tĩnh, đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (do Công ty Dược liệu Sơn Lâm, Hà Nội cung cấp); một số mẫu Lộc nhung khác thu mua trong khu vực Hà Nội. - Chất chuẩn testosteron (99,5%, Lot. 3580002, SERVA Electrophoresis, Đức). - Các hóa chất, trang thiết bị khác đạt tiêu chuẩn phân tích. 2. Phương pháp nghiên cứu. Định lượng testosteron trong Lộc nhung bằng phương pháp HPLC. Thẩm định phương pháp thực hiện theo chỉ dẫn của ICH và Bộ Y tế Việt Nam gồm: tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, độ đúng, độ chính xác, giới hạn định lượng và giới hạn phát hiện [1, 4]. - Mẫu chuẩn: chuẩn làm việc có nồng độ từ 0,72 - 57,71 µg/ml. - Mẫu thử: khảo sát các phương pháp xử lý mẫu khác nhau: + Phương pháp 1 (không qua cột chiết pha rắn): cân chính xác 10,0 g bột Lộc nhung đã được nghiền nhỏ và rây qua rây 355/180 (bột nửa mịn) vào bình nón có nút mài, chiết siêu âm bằng EtOH 90% trong 2 giờ ở 600C (40 ml x 2 lần). Ly tâm (5.000 vòng/phút × 5 phút) lấy dịch chiết. Gộp dịch chiết 2 lần vào bình định mức 100 ml, bổ sung vừa đủ thể tích. Hút chính xác 20 ml dịch chiết cho vào bình cô quay chân không đến cắn. Hòa tan cắn bằng 1,0 ml MeOH. Lấy 100 µl dịch ở trên, tủa protein bằng 10 µl axít percloric 50%. Sau đó, trung hòa axít bằng 10 µl NaOH 0,3 M. Ly tâm dịch ở tốc độ 12.000 vòng/phút x 10 phút, thu được dịch trong dùng để phân tích HPLC. + Phương pháp 2 (sử dụng cột chiết pha rắn SPE-C18): tiến hành tương tự như phương pháp 1 đến bước cô quay chân không. Hòa tan cắn bằng 2 ml MeOH 25%, chuyển vào cột chiết pha rắn 87 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 SPE đã được hoạt hóa trước (5 ml MeOH 25% × 2 lần, 5 ml nước cất). Rửa loại tạp chất bằng 5 ml nước cất x 2 lần. Rửa giải bằng 2 ml MeOH. Tất cả các bước loại tạp và rửa giải trên được thực hiện với tốc độ 30 - 45 giọt/phút. Đem dịch rửa giải cô dưới áp suất giảm ở 600C tới cắn, hòa tan cắn trong 200 µl MeOH. Ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút thu được dịch trong dùng để phân tích HPLC. - Mẫu trắng: mẫu MeOH được thực hiện đầy đủ theo các bước như phương pháp 1. - Điều kiện sắc ký: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV đo ở 254 nm, dung môi pha động là ACN:H2O chạy theo chương trình gradient hoặc đẳng dòng, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 300C. Thể tích bơm mẫu 10 µl. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 1. Lựa chọn điều kiện sắc ký. Khảo sát với hai điều kiện sắc ký gồm: cột Sunfire C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm), detector UV đo ở bước sóng 254 nm, tốc độ dòng 0,8 ml/phút, nhiệt độ cột 300C. Trong đó dung môi pha động sử dụng ACN (A):H2O (B) với 2 điều kiện khác nhau. Điều kiện (1) chạy đẳng dòng với tỷ lệ 47:53; điều kiện (2) chạy theo chương trình gradient 0 → 20 phút, 30% A → 60% A; 20 → 30 phút, 60% A. 0.040 (a) 10.770 AU 0.030 0.020 0.010 0.000 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 19.00 20.00 18.214 Minutes 0.040 AU 0.030 (b) 0.020 0.010 0.000 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 Minutes (c) 18.323 AU 0.04 0.02 0.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00 15.00 16.00 17.00 18.00 19.00 20.00 Minutes Hình 1: Sắc ký đồ testosteron chuẩn ở điều kiện 1 (a), điều kiện 2 (b) và mẫu Lộc nhung ở điều kiện 2 (c). Từ hình ảnh sắc ký đồ của testosteron ở 2 điều kiện trên cho thấy: ở điều kiện 1, thời gian lưu của testosteron khoảng 10,77 phút, nhưng píc gioãng, không cân đối. Ở điều kiện 2, thời gian lưu của testosteron khoảng 18,3 phút với píc cân đối và khả năng phân tách tốt. 88 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d−îC-2016 Để kiểm tra điều kiện sắc ký có phù hợp với phân tích mẫu thử, tiến hành chạy sắc ký với mẫu thử Lộc nhung (có sử dụng cột chiết SPE) theo điều kiện 2. Kết quả phân tích cho thấy: píc của testosteron trong mẫu thử cân đối, sắc nét, thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của píc testosteron chuẩn và tách khỏi píc tạp. Từ kết quả trên, chúng tôi lựa chọn được điều kiện sắc ký HPLC cho phân tích định lượng testosteron trong Lộc nhung như sau: - Cột sắc ký: Sunfire RP-C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm, 100A0). - Detetor UV đo ở bước sóng 254 nm. - Pha động: ACN:nước cất chạy theo chương trình gradient. - Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút. - Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. - Nhiệt độ cột: 300C. 2. Lựa chọn phương pháp xử lý mẫu. Tiến hành xử lý mẫu theo 2 phương pháp: sử dụng và không sử dụng cột chiết pha rắn như nêu ở phương pháp nghiên cứu. Phân tích sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn được trình bày ở mục 1. Sắc ký đồ của mẫu thử được xử lý theo 2 phương pháp được trình bày trong hình 2. 0.050 0.040 AU 0.030 (a) 18.478 0.020 0.010 0.000 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 Minutes 0.050 0.040 0.020 (b) 18.489 AU 0.030 0.010 0.000 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 Minutes Hình 2: Sắc ký đồ của mẫu thử được xử lý theo phương pháp 1 (a) và phương pháp 2 (b). Kết quả trên sắc ký đồ cho thấy: khi không sử dụng cột chiết pha rắn, mẫu còn nhiều tạp chất, píc testosteron tách không hoàn toàn ra khỏi píc tạp. Trong khi đó, ở mẫu sử dụng cột chiết pha rắn, tạp chất giảm nhiều, píc của testosteron tách rõ ràng ra khỏi píc tạp, ít làm bẩn cột phân tích, góp phần kéo dài tuổi thọ cột. Từ kết quả này, chúng tôi lựa chọn phương pháp xử lý mẫu có sử dụng cột chiết pha rắn SPE-C18. 89 T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè chuyªn ®Ò d¦îC-2016 3. Thẩm định phương pháp phân tích. * Tính tương thích hệ thống, chọn lọc - đặc hiệu: Tiến hành phân tích 5 lần liên tiếp mẫu chuẩn có nồng độ 5,77 µg/ml theo điều kiện sắc ký đã lựa chọn. Kết quả cho thấy: thời gian lưu và diện tích píc thu được lần lượt là 18,32 ± 0,03 phút ( ± SD, RSD = 0,16%) và 326.883 ± 5.289 µAU x s ( ± SD, RSD = 1,62%). Cả thời gian lưu và diện tích píc đều có giá trị RSD < 2%. Đồng thời, số đĩa lý thuyết là 7.429 và hệ số bất đối xứng là 1,06. Kết quả phân tích sắc ký đồ của mẫu trắng, mẫu testosteron chuẩn và mẫu Lộc nhung được ghi ở hình 3, cho thấy phương pháp phân tích tương thích với hệ thống sắc ký. 0.020 0.018 0.016 0.014 0.012 A U 0.010 0.008 0.006 (a) 0.004 0.002 0.000 -0.002 -0.004 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 Minutes 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 0.020 0.018 18.260 0.016 0.014 AU 0.012 0.010 0.008 0.006 (b) 0.004 0.002 0.000 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 Minutes 0.020 0.018 18.323 0.016 0.014 AU 0.012 0.010 (c) 0.008 0.006 0.004 0.002 0.000 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00 30.00 Minutes Hình 3: Sắc ký đồ mẫu trắng (a), testosteron chuẩn (b) và mẫu thử Lộc nhung (c). Kết quả phân tích mẫu trắng, mẫu testosteron chuẩn và mẫu thử Lộc nhung trong cùng điều kiện cho thấy: tại thời điểm xuất hiện píc testosteron trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, không thấy xuất hiện píc trên dung dịch mẫu trắng. Đồng thời, tại thời điểm này xuất hiện đáp ứng píc tương ứng trên dung dịch mẫu thử dịch chiết Lộc nhung. Píc cân đối, sắc nét và tách hoàn toàn ra khỏi các píc tạp, hệ số bất đối xứng gần bằng 1. Như vậy, phương pháp này đảm bảo tính chọn lọc đặc hiệu. 90 * Khoảng tuyến tính: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn testosteron có nồng độ từ 0,72 - 57,71 µg/ml trong MeOH 70%. Phân tích sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn. Đánh giá mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ testosteron. Kết quả cho thấy (bảng 1, hình 4): đường hồi quy thu được là đường thẳng với hệ số tương quan R2 xấp xỉ bằng 1 (0,9999). Hệ số ∆i ở tất cả các nồng độ trong đường chuẩn đều < 15%. Như vậy, có mối tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích píc và nồng độ testosteron trong khoảng nồng độ khảo sát.