Xây dựng quy trình định lượng các flavonoid và acid clorogenic trong Nữ lang (Valeriana hardwickii) bằng UHPLC-MS

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CÁC FLAVONOID<br /> VÀ ACID CLOROGENIC TRONG NỮ LANG (VALERIANA HARDWICKII)<br /> BẰNG UHPLC-MS<br /> Huỳnh Lời*, Nguyễn Thùy Vi*, Trần Hùng**<br /> <br /> TÓMTẮT<br /> Mở đầu: Nữ lang (Valeriana hardwickii Wall. Caprifoliaceae) đã được dùng từ lâu trong y học cổ<br /> truyền để điều trị mất ngủ, chống co giật, chống mệt mỏi và rối loạn chu kỳ kinh nguyệt. Ngoài ra, dược<br /> liệu này còn dùng ngoài để điều trị côn trùng đốt và các bệnh ngoài da. Cho tới nay, các công trình nghiên<br /> cứu về Nữ lang chủ yếu là phân tích các thành phần bay hơi. Ngoài ra, các thành phần khác được phân lập<br /> như các iridoid, flavonoid, triterpen. Về định tính, định lượng, chưa có nhiều tài liệu công bố.<br /> Mục tiêu: Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xây dựng quy trình định lượng các flavonoid có trong<br /> Nữ lang bao gồm linarin, neobudofficid, rhoifolin và acid clorogenic bằng phương pháp UHPLC-MS.<br /> Phương pháp xây dựng giúp cho việc kiểm nghiệm và xây dựng tiêu chuẩn cho Dược Điển Việt Nam.<br /> Nguyên liệu và phương pháp: Nguyên liệu là cây Nữ lang (V. hardwickii) thu hái mọc hoang tại<br /> Cổng Trời (vùng Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt vào tháng 4/2015. Nguyên liệu được định danh bằng<br /> cách so sánh về mô tả hình thái thực vật với các thông tin trên các tài liệu tham khảo thực vật học chuyên<br /> ngành. Mẫu Valeriana officinalis được thu thập tại vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Cộng hòa<br /> Áo đuợc thu vào tháng 4 năm 2015. Hệ dung môi và điều kiện MS được tối ưu hóa. Phương pháp được<br /> đánh giá với tính tương thích hệ thống, tuyến tính, độ chính xác, độ đúng, LOD và LOQ theo hướng dẫn<br /> của ICH.<br /> Kết quả: Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic 0,1% (A) – a. formic 0,1% trong acetonitril (B),<br /> gradient từ 90% A đến 5% A, thời gian phân tích 14 phút, tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ cột là<br /> 30oC và thể tích tiêm mẫu là 3 ml. Điều kiện phân tích khối phổ được thiết lập với thông số capillary voltage<br /> ở 0,8 kV; cone voltage là 15 eV, nhiệt độ của mao quản được duy trì ở 350 ºC. Tốc độ khí khử dung môi<br /> (desolvation gas) là 300 L/h. Phổ khối của các chất phân tích được ghi nhận ở chế độ ion dương (positive).<br /> Sắc kí đồ của các chất phân tích được theo dõi ở cả hai chế độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z 100-<br /> 1000) và SIR (single ion recording). Chế độ SIR của acid clorogenic ở m/z 355,31; rhoifolin ở m/z 579,52;<br /> neobudofficid ở m/z 739,69; và linarin ở m/z 593,54. Tính tương thích hệ thống đạt với thông số thời gian<br /> lưu và diện tích đỉnh các pic nhỏ hơn 2%. Tính tuyến tính với R2 ~ 0,999 và khoảng tuyến tính các hợp chất<br /> có nồng độ 0,7-120 mg/ml. Kết quả cho thấy có sự lặp lại trong phương pháp phân tích bằng UHPLC-MS<br /> với RSD% < 5%. Tỷ lệ phục hồi 99-106%. Giới hạn phát hiện là của a. clorogenic, rhoifolin, neobudofficid,<br /> linarin lần lượt là 0,029; 0,0010; 0,00020; 0,015 mg/ml. Acid clorogenic có trong các bộ phận của V.<br /> hardwickii bao gồm lá là 1,76%, trong thân là 8,23% và trong rễ là 1,68%, hàm lượng các flavonoid trong<br /> lá V. hardwickii bao gồm rhoifolin là 0,86%, neobudofficid là 0,19% và linarin là 1,95%. Acid clorogenic<br /> trong rễ và lá của V. officinalis cũng được định lượng với hàm lượng lần lượt là 5,3% và 1,45%.<br /> Kết luận: Phương pháp UHPLC-MS đã được xây dựng và được đánh giá theo hướng dẫn của ICH.<br /> Các điều kiện phân tích đã được thiết lập bao gồm các điều kiện về phổ khối, tính tương thích hệ thống tính<br /> <br /> *<br /> Trung Tâm Khoa Học Công Nghệ Dược Sài Gòn (SAPHARCEN), Đại học Y Dược Thành phố. Hồ Chí Minh<br /> **<br /> Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: PGS. TS. Trần Hùng ĐT: 02838295641 Email: tranhung@uphcm.edu.vn<br /> <br /> <br /> 12 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng. Hàm lượng các hợp chất đã được định lượng bao gồm acid clorogenic,<br /> rhoifolin, neobudofficid, và linarin trong V. hardwickii và acid clorogenic trong V. officinalis.<br /> Từ khóa: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS<br /> ABSTRACT<br /> QUANTITATIVE ANALYSIS OF FLAVONOIDS AND CHLOROGENIC ACID IN VALERIANA<br /> HARDWICKII BY UHPLC-MS<br /> Huynh Loi, Nguyen Thuy Vi, Tran Hung<br /> * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Supplement of Vol. 23 - No 2- 2019: 12 – 23<br /> <br /> Background and objectives: V. hardwickii, “Nữ lang in Vietnamese”, are used in Vietnam as a<br /> traditional medicine with anti-convulsant, sedative, anti-fatigue, and anti-dysmenorrheal properties. The<br /> topical uses of aerial parts are the treatment of insect bites and various skin diseases. Volatile compounds<br /> were reported. Flavonoids, iridoids, terpenoids are also isolated from Valeriana hardwickii. The aim of this<br /> study was to develop the UHPLC-MS method for quantitative analysis of flavonoids including linarin,<br /> neobudofficide, rhoifolin and chlorogenic acid from Valeriana hardwickii.<br /> Material and method: Nữ lang (Valeriana hardwickii) was collected in Cổng Trời (Bidoup - núi Bà),<br /> Đà Lạt in April 2015. V. officinalis was colleced in Botanic Garden of Vetmeduni – Vienna in April 2015.<br /> The mobile phase and MS conditon were optimized. The analytical method was validated for system<br /> suitability, linearity, precision, accuracy, limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ)<br /> according to International Council on Harmonization (ICH) Guidelines.<br /> Results: The method was developed using mobile phase including formic acid 0.1% (A) – formic acid<br /> 0.1% in acetonitril (B), gradient from 90% A to 5% A, 14 min run time, 0.7 ml/min flow rate, 30oC<br /> column temperature, 3 ml injection volume. MS condition were set as 0.8 kV capillary voltage; 15 eV cone<br /> voltage, 350 ºC capillary temperature, 300 L/h desolvation gas, ESI+-MS mode, full scan at m/z 100-1000,<br /> SIR (single ion recording) mode. Chromatogram was recorded at m/z 355.31 for chlorogenic acid; at m/z<br /> 579.52 for rhoifolin; at m/z 739.69 for neobudofficid; and at 593.54 for linarin. System is suitable for<br /> analysis with RSD of retension time and peak area below 2%. The method was found to be linear within the<br /> ranges of 0.7-120 mg/ml and R2 ~ 0,999. The precision was determined with RSD < 5%. The LOD was<br /> 0.029; 0.0010; 0.00020; and 0.015 mg/ml for chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin<br /> respectively. The recovery ranged 99-106%. The content of chlorogenic acid is 1.76%, 8.23% and 1.68% in<br /> leaves, stems and roots, respectively. The content of flavonoids in leaves including rhoifolin, neobudofficid,<br /> and linarin is 0.86%, 0.19% and 1.95%, respectively. Acid clorogenic from the roots and leaves of V.<br /> officinalis was also determined with the content of 5.3% and 1.45%, respectively.<br /> Conclusions: The UHPLC-MS method was successfully developed and validated. The MS condition<br /> was optimized. System suitability, linearity, range, precision, recovery was determined. The content of<br /> chlorogenic acid, rhoifolin, neobudofficid, and linarin in Valeriana hardwickii was also determined.<br /> Chlorogenic acid in V. officinalis was successful quantitative.<br /> Key words: Valeriana hardwickii, Nữ lang, UHPLC-MS<br /> ĐẶTVẤNĐỀ xếp vào họ Caprifoliaceae (họ Cơm cháy)(21,22).<br /> Ở châu Á, chi Valeriana có các loài V.<br /> Chi Valeriana trước đây thuộc họ<br /> pseudofficinalis, V. fauriei, V. jatamansi, V.<br /> Valerianaceae (họ Nữ lang) và hiện nay được<br /> hardwickii, Nardostachys jatamansi(2,3,18,19). Ở<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 13<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> nước ta có 2 loài: V. hardwickii (Nữ lang) và V. nước, cao ethanol 45% và cao DCM có tác<br /> jatamansi (Sì to)(22). Thành phần hóa học chi dụng an thần, giải lo âu(1) . Thử nghiệm trên<br /> Valeriana yếu chứa tinh dầu, iridoid dòng tế bào NB18TG2, linarin và<br /> (valepotriat), triterpenoid, flavonoid, acid isovaleroxy valtrat hydrin được phân lập<br /> phenol, lignan, alkaloid. Ngoài ra còn có từ V. hardwickii không có độc tính trên<br /> amino acid (arginin, GABA, glutamin, dòng tế bào này(14) . Theo y học cổ truyền,<br /> tyrosin), acid béo, cholin và các chất vô cơ Nữ lang có vị ngọt, đắng, tính bình, tác<br /> khác(10). Trên thế giới V. hardwickii mọc ở Ấn động vào 2 kinh: tâm, can. Cây có tác dụng<br /> Độ, Trung Quốc, Mianma, Malaysia, ninh tâm, an thần, hoạt huyết, thông<br /> Indonesia. Ở nuớc ta, Nữ lang (V. hardwickii) kinh (8) . Hoạt chất từ thân rễ dùng làm<br /> mọc ở Ô Quý Hồ, Tả Giàng Phình, núi Hàm thuốc thần kinh tim, chống co thắt; cả cây<br /> Rồng, Xà Xén, Sapa, Hà Giang (Đồng Văn, dùng làm thuốc chữa phong thấp, đau dạ<br /> Mèo Vạc), Quảng Nam (Trà My: Ngọc Linh), dày, điều kinh, sốt ở trẻ em(23) . Ở Ấn Độ,<br /> Kon Tum (Đắk Tô: Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà thân rễ của V. hardwickii được dùng như<br /> Lạt)(8). Cho đến nay, nghiên cứu hoá học trên thân rễ V. officinalis để chữa hysteria, động<br /> loài V. hardwickii không nhiều. Năm 1989, Đỗ kinh, chứng múa giật, chứng loạn thần<br /> Ngọc Thanh và cộng sự đã phân lập được 2 kinh, chấn thương thời chiến, chứng loạn<br /> thành phần từ V. hardwickii ký hiệu là N1, N2 thần kinh chức năng. Thân rễ cũng dùng để<br /> và chưa xác định được cấu trúc(9). Thành phần làm hương liệu. Ở Trung Quốc, toàn cây và<br /> chính trong tinh dầu V. hardwickii var. thân rễ được dùng trị thần kinh suy nhược<br /> arnottiana là valeracetat và hàm lượng tinh dầu và mất ngủ; có nơi dùng trị kinh nguyệt<br /> là 0,3%(20). Tinh dầu V. hardwickii mọc ở không đều, đòn ngã tổn thương và phong<br /> Hymalaya thành phần chính là methyl thấp đau xương(22). Ở Pakistan, Miến Điện<br /> linoleate(16). Tinh dầu trong Valeriana hardwickii và Srilanka, V. hardwickii được sử dụng để<br /> ở Việt nam có thành phần chủ yếu là bornyl làm gia vị cũng như làm thuốc. Nữ lang<br /> acetat(13). Về phân lập, có 2 công trình nghiên được dùng làm thuốc toát mồ hôi, phòng<br /> cứu trên cây này. Epoxysesquithujen được bệnh phát lại có định kỳ, chất kích thích,<br /> phân lập trong tinh dầu V. hardwickii var. thuốc bổ não, thuốc chống động kinh, thuốc<br /> hardwickii(6). Các chất sitosterol, daucosterol, tẩy giun, thuốc an thần, lợi tiểu, thuốc kích<br /> syzalterin, 6-methylapigenin, 5-hydroxy-7,4'- thích tình dục, thuốc điều kinh, chống co<br /> dimethoxyflavon, genkwanin, acacetin, thắt, trị tiêu chảy(1). Nữ lang V. hardwickii<br /> apigenin, quercetin, tricin, farrerol, được dùng với liều 10 g hãm với 100 ml<br /> sosakuranetin; 5,3',4'-trihydroxy-7- nước sôi, để nguội uống trong ngày hoặc<br /> methoxyflavanon, linarin, neobudofficid, nghiền dược liệu thành bột uống với liều 1-4<br /> neodiosmin, rhoifolin, valeclorin, isovaleroxy g/ ngày, có thể thái nhỏ dược liệu, ngâm cồn<br /> valtrat hydrin, acid oleanolic, acid ursolic, 60% với tỷ lệ 1/5, ngày dùng 2-10 g pha<br /> bornyl ferulat, bornyl caffeat cũng được phân loãng, ngoài ra còn dùng dạng cao mềm,<br /> lập từ V. hardwickii(5,12). Cho đến nay, ít có công ngày dùng 1-4 g(8). Cho đến nay, công trình<br /> trình nghiên cứu về tác dụng sinh học của V. nghiên cứu về phân tích định lượng các<br /> hardwickii. Cao chiết thân rễ V. hardwickii gây thành phần trong Valeriana hardwickii chưa<br /> ra sự ức chế phụ thuộc nồng độ sự co thắt tự đuợc công bố. Công trình nghiên cứu này là<br /> phát hay sự co thắt gây bởi kali trên ruột chay lần đầu tiên công bố về định lượng các<br /> thỏ, do đó thể hiện tác dụng chống co thắt(1). flavonoid, acid clorogenic trong V. hardwickii<br /> Các cao chiết từ V. hardwickii bao gồm cao bằng UHPLC-MS.<br /> <br /> <br /> 14 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> NGUYÊNLIỆU-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU acetonitril ở các tỷ lệ sao cho sự tách và độ cân<br /> Nguyênliệu đối của đỉnh đạt yêu cầu định lượng.<br /> Các điều kiện sắc ký được khảo sát trên hai<br /> Nguyên liệu là cây Nữ lang (V. hardwickii)<br /> kỹ thuật rửa giải đẳng dòng (isocratic) và<br /> thu hái mọc hoang tại Cổng Trời (vùng<br /> chương trình dung môi (gradient) để chọn<br /> Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt. Nguyên<br /> điều kiện sắc ký có sự phân tách các pic.<br /> liệu được định danh bằng cách so sánh về<br /> mô tả hình thái thực vật với các thông tin Khảo sát điều kiện MS<br /> trên các tài liệu tham khảo thực vật học Điều kiện MS được điều chỉnh bằng thủ<br /> chuyên ngành(8). Mẫu Nữ lang V. hardwickii công sao cho ion hóa tốt nhất. Các thông số<br /> được thu hái 4/2015 và được lưu tại Bộ môn được thăm dò bao gồm điện thế cone (cone<br /> Dược liệu, Khoa dược, Đại học Y Dược TP. voltage), điện thế mao quả (capillary voltage),<br /> Hồ Chí Minh số lưu mẫu 01-BMDL. nhiệt độ của mao quản, phương thức chọn ion<br /> Mẫu Valeriana officinalis được thu thập tại (positive hay negative).<br /> vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Khảo sát tính tương thích hệ thống<br /> Cộng hòa Áo đuợc thu vào tháng 4 năm 2015. Tiến hành: tiêm 6 lần liên tiếp mẫu đối<br /> Mẫu được lưu tại Viện thực vật ứng dụng và chiếu có cùng nồng độ, cùng điều kiện.<br /> dược liệu (Applied Botany and<br /> Yêu cầu: RSD của thời gian lưu; diện tích<br /> Pharmacognosy) thuộc trường Vetmeduni với<br /> pic cần định lượng phải ≤ 2%; hệ số bất đối<br /> số lưu IAB2012-VAL01.<br /> (AF) từ 0,5-1,5 và độ phân giải giữa các pic cần<br /> Dung môi, hóa chất định lượng Rs ≥ 1,5(4,7).<br /> Acid formic, acetonitril được cung cấp bời Tính đặc hiệu<br /> Merck (Đức). Acid clorogenic được cung cấp<br /> Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu đối chiếu,<br /> bởi Merck (Đức), rhoifolin, neobudofficid và<br /> mẫu thử và mẫu thử thêm chất đối chiếu.<br /> linarin là các hợp chất đối chiếu phân lập<br /> trong nghiên cứu trước đây(12), độ tinh khiết Sắc ký đồ mẫu trắng không có các tín hiệu<br /> HPLC lần lượt là 97,2%, 99,2% và 98,4%. tại thời gian lưu của các pic cần định lượng<br /> Trang thiết bị nghiên cứu trong sắc ký đồ của mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ<br /> Hệ UHPLC Waters® model Acquity® H- của mẫu thử có các pic có thời gian lưu tương<br /> class với đầu dò MS QDa (REF186006511), cột ứng với sắc ký đồ của mẫu đối chiếu. Khi thêm<br /> Cortes® C18 (50 × 4,6 mm, 2,7 µm). Phần mềm một lượng chất đối chiếu vào mẫu thử thì có sự<br /> Empower 3. tăng về diện tích pic hoặc tỷ số diện tích pic<br /> Phương pháp nghiên cứu được chuẩn hóa so với mẫu thử ban đầu.<br /> Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu Tính tuyến tính<br /> Khảo sát lần lượt các dung môi là MeOH Pha các hợp chất cần định lượng trong<br /> với nồng độ khác nhau, điều kiện nhiệt độ, MeOH để có dung dịch với nồng độ tăng dần.<br /> thời gian chiết và số lần chiết sao cho các điều Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn.<br /> kiện chiết cho hiệu suất chiết cao nhất.<br /> Kết quả được đánh giá bằng cách tính<br /> Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải đường hồi qui dựa vào phương pháp bình<br /> Khảo sát trên hai dung môi là acid formic phương tối thiểu, phương trình ŷ= ax.<br /> 0,1% trong MeOH và acid formic 0,1% trong<br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 15<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> Yêu cầu: có sự tương quan tuyến tính giữa Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định<br /> diện tích pic (hoặc tỷ số diện tích pic chuẩn lượng (LOQ)<br /> Hai giới hạn này được tính trên tỷ lệ tín<br /> hóa) với nồng độ chất đối chiếu ở khoảng<br /> hiệu (S) với tín hiệu nhiễu đường nền (N).<br /> nồng độ khảo sát, hệ số R2 ≥ 0,995.<br /> LOD và LOQ được tính toán theo tỷ lệ<br /> Độ lặp lại S/N=3/1 và 10/1 theo thứ tự dựa theo kết<br /> Thực hiện định lượng trên 6 dịch chiết quả thực nghiệm.<br /> mẫu thử khác nhau. Độ lặp lại được đánh giá Áp dụng quy trình định lượng<br /> dựa vào RSD của hàm lượng các chất phân Sau khi xây dựng quy trình định lượng,<br /> tích có trong bột lá Nữ lang. Mỗi mẫu định quy trình được áp dụng để định lượng các<br /> lượng 2 lần, lấy kết quả trung bình . (7)<br /> thành phần có trong thân và rễ của Nữ lang<br /> Độ đúng (V. hardwickii) và trong rễ và lá của V.<br /> Độ đúng là tỷ lệ phục hồi giữa nồng độ officinalis.<br /> chất đối chiếu tìm thấy so với lượng chất đối KẾTQUẢ<br /> chiếu thêm vào. Thêm vào mẫu thử dược liệu<br /> Khảo sát điều kiện chuẩn bị mẫu<br /> một lượng chất đối chiếu 10%, 20%, 30% so với<br /> Khảo sát dung môi chiết<br /> hàm lượng chất phân tích có trong mẫu thử,<br /> tiến hành định lượng 3 nồng độ, mỗi nồng độ Dung môi chiết đuợc khảo sát với phần<br /> thực hiện trên 3 mẫu. trăm MeOH khác nhau. Kết quả cho thấy<br /> <br /> Yêu cầu: tỷ lệ phục hồi trong khoảng 90 – MeOH 40% cho hiệu suất chiết cao nhất, vì<br /> <br /> 107%(11). vậy dung môi MeOH 40% dùng để chiết các<br /> thành phần định lượng từ lá Nữ lang.<br /> Bảng 1: Diện tích đỉnh các polyphenol và dung môi chiết trong khảo sát quy trình định lượng<br /> Hợp chất MeOH 10% MeOH 20% MeOH 40% MeOH 60% MeOH 80% MeOH 100%<br /> Acid clorogenic 3061530 2721360 3401700 3571785 3061530 3231615<br /> Rhoifoolin 210245 194555 209199 173635 215475 171899<br /> Neobudofficid 16917 18646 18590 15244 16359 18962<br /> Linarin 454553 341823 363642 338187 316369 356369<br /> <br /> Khảo sát số lần chiết Khảo sát thời gian chiết<br /> Kết quả khảo sát số lần chiết cho thấy chiết Thời gian chiết 30 phút được chọn để<br /> 2 lần được chọn để chiết các hợp chất cần định chiết vì cho diện tích đỉnh cao hơn so với<br /> lượng trong lá Nữ lang. chiết 15 phút và cũng gần tương đương với<br /> Bảng 2: Diện tích đỉnh các polyphenol và số lần chiết 45 phút.<br /> chiết trong khảo sát qui trình định lượng<br /> Bảng 3: Diện tích đỉnh các polyphenol và thời gian<br /> Tỷ lệ % Tỷ lệ %<br /> Hợp chất Lần 1 Lần 2 Lần 3 chiết chiết chiết trong khảo sát quy trình định lượng<br /> lần 2 lần 3 Hợp chất 15 phút 30 phút 45 phút<br /> Acid Acid 3401120 3571176 3407922<br /> 3402031 187110 34020 5,16 0,94 clorogenic<br /> clorogenic<br /> Rhoifoolin 2092002 125520 29288 5,59 1,30 Rhoifoolin 2092110 2133952 2194202<br /> Neobudofficid 18605 1302 205 6,48 1,02 Neobudofficid 18701 18906 18988<br /> Linarin 364110 14564 10923 3,74 2,80 Linarin 365210 373244 376166<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 16 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Khảo sát nhiệt độ chiết Hệ dung môi bao gồm: nước acid formic<br /> Nhiệt độ chiết đuợc khảo sát ở 30oC, 40oC 0,1% (A) – a. formic 0,1% trong acetonitril<br /> và 50oC. Kết quả cho thấy nhiệt độ 40oC cho (B). Chương trình rửa giải gradient thể hiện<br /> hiệu quả chiết cao hơn 30oC và cũng tương ở Bảng 5.<br /> đương với 50oC. Vậy, nhiệt độ 40oC thích hợp Tốc độ dòng là 0,7 ml/phút và nhiệt độ<br /> cho quy trình chiết. cột là 30oC và thể tích tiêm mẫu là 3 ml.<br /> Bảng 4: Diện tích đỉnh các polyphenol và nhiệt độ Bảng 5: Chương trình rửa giải của quy trình<br /> chiết trong khảo sát quy trình định lượng định lượng<br /> o o o<br /> Hợp chất 30 C 40 C 50 C Thời gian Pha động<br /> Acid clorogenic 3401800 3571890 3575292 0-2 phút 90% A<br /> Rhoifoolin 2092528 2094621 2098806 2-3 phút 90% 78% A<br /> Neobudofficid 18705 19078.84 19452.93 3-5 phút 78%  75% A<br /> Linarin 365283 381355.5 383181.9 5-7 phút 75% A<br /> Sau khi khảo sát dung môi chiết, số lần 7-9 phút 75%  5% A<br /> 9-14phút 5% A<br /> chiết, thời gian chiết và nhiệt độ chiết. Quy<br /> Khảo sát điều kiện MS<br /> trình chiết được thiết lập như sau:<br /> Điều kiện phân tích khối phổ được thiết<br /> Cân chính xác khoảng 100 mg bột lá Nữ<br /> lập với thông số capillary voltage ở 0,8 kV;<br /> lang cho vào ống nghiệm thủy tinh có nắp,<br /> cone voltage là 15 eV, nhiệt độ của mao<br /> thêm 10 ml MeOH 40%, siêu âm (mức năng<br /> quản được duy trì ở 350oC. Tốc độ khí khử<br /> lượng 100%) ở nhiệt độ 40 oC trong vòng 30<br /> dung môi (desolvation gas) là 300 L/h. Phổ<br /> phút, lọc, bã được chiết lần 2 với 10 ml MeOH<br /> khối của các chất phân tích được ghi nhận ở<br /> 40%, gộp dịch lọc, cho dịch lọc thu được vào<br /> chế độ ion dương (positive). Sắc kí đồ của<br /> bình định mức 25 ml, bổ sung dung môi cho<br /> các chất phân tích được theo dõi ở cả hai chế<br /> đủ thể tích, lọc qua màng lọc PTTE 0,22 µm<br /> độ TIC (total ion current) (MS scan) (m/z<br /> trước khi phân tích bằng UHPLC.<br /> 100-1000) và SIR (single ion recording). Chế<br /> Khảo sát pha động và kỹ thuật rửa giải độ SIR của acid clorogenic ở m/z 355,31;<br /> Sau khi khảo sát các điều kiện sắc ký, rhoifolin ở m/z 579,52; neobudofficid ở m/z<br /> chương trình rửa giải được xây dựng như sau: 739,69; và linarin ở m/z 593,54.<br /> Khảo sát tính tương thích hệ thống<br /> Bảng 6: Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của quy trình định lượng<br /> STB N<br /> Thành phần tR (phút) k’ α Rs As<br /> (µV × s) (biểu kiến)<br /> Acid clorogenic TB 1,989 3787040 7817<br /> 3,3 1,13<br /> (30 mg/ml) RSD% 0,04 0,73<br /> Rhoifolin TB 5,829 3182400 106680<br /> 11,7 1,04 2,86 1,12<br /> (18,75 mg/ml) RSD% 0,02 0,73<br /> Neobudofficid TB 7,11 728291 160595<br /> 14,5 1,10<br /> 3,75 mg/ml) RSD% 0,07 0,89<br /> Linarin TB 7,846 7998000 84759<br /> 16,1 1,04 2,63 1,13<br /> 30 mg/ml) RSD% 0,05 1,57<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 17<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ ở chế độ SIR và các phổ khối của các hợp chất tương ứng<br /> <br /> <br /> <br /> 18 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Tính đặc hiệu<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ (SIR) trong khảo sát tính đặc hiệu của quy trình định lượng<br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 19<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> Tính tuyến tính<br /> Bảng 7: Mối tương quan giữa nồng độ và diện tích đỉnh của các chất đối chiếu<br /> Acid clorogenic Rhoifolin Neobudofficid Linarin<br /> STB STB STB STB<br /> C (µg/ml) C (µg/ml) C (µg/ml) C (µg/ml)<br /> (µV×s) (µV×s) (µV×s) (µV×s)<br /> 120 14978010 75 11991988 15 2780080 120 31876180<br /> 60 7544520 37,5 6295994 7,5 1425682 60 15998040<br /> 30 3787048 18.75 3182499 3,75 728291 30 7999020<br /> 15 1893524 9,38 1610227 1,88 367899 15 4031245<br /> 7,5 1074029 4,69 829839 0,938 182169 7,5 1908647<br /> Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến Sau khi xét các hệ số hồi quy, phương<br /> tính giữa nồng độ và diện tích đỉnh với trình tuyến tính thể hiện ở Bảng 8.<br /> R2~0,999 và khoảng tuyến tính các chất phân<br /> tích thể hiện ở Bảng 8.<br /> Bảng 8: Phương trình tuyến tính<br /> 2<br /> Hợp chất Phương trình tuyến tính Khoảng tuyến tính (mg/ml) R<br /> Acid clorogenic ŷ = 124100x 7,5 - 120 0,9999<br /> Rhoifolin ŷ = 158817x 4,69 – 75 0,9994<br /> Neobudofficid ŷ = 184350x 0,938 – 15 0,9998<br /> Linarin ŷ = 265886x 7,5 - 120 0,9995<br /> <br /> Độ lặp lại<br /> Bảng 9: Kết quả khảo sát độ lặp lại của quy trình định luợng (n=6)<br /> Hợp chất A. clorogenic rhoifolin neobudofficid linarin<br /> Hàm lượng (%) 1,76±0,03 0,86±0,02 0,19±0,005 1,95±0,096<br /> (khối lượng/khối lượng) (RSD = 1,61) (RSD = 2,07) (RSD = 2,42) (RSD = 4,95)<br /> Kết quả cho thấy có sự lặp lại trong phương Bảng 10: Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của quy<br /> pháp phân tích bằng UHPLC-MS với RSD% < 5%. trình định lượng (n=9)<br /> Như vậy, phương pháp đạt độ lặp lại. Tỷ lệ phục hồi<br /> Tên hợp chất<br /> 10% 20% 30% RSD<br /> Khảo sát độ đúng Acid clorogenic 101,1 99,9 104,5 2,3<br /> Tất cả các đỉnh cần định lượng đều có tỷ Rhoifolin 101,5 99,3 103,2 1,9<br /> Neobudofficid 101,3 102,5 98,2 2,0<br /> lệ phục hồi trong giới hạn từ 97 – 105%.<br /> Linarin 103,4 102,6 97,5 3,2<br /> <br /> Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD) và giới<br /> hạn định lượng (LOQ)<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 3: Sắc ký đồ (SIR) trong khảo sát LOD của quy trình định lượng<br /> <br /> <br /> 20 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> <br /> Kết quả khảo sát LOD và LOQ được trình Bảng 12: Hàm lượng (%) các hợp chất trong lá V.<br /> hardwickii<br /> bày ở Bảng 11. Trong các polyphenol định<br /> A. clorogenic rhoifolin neobudofficid linarin<br /> lượng, neobudofficid có LOD thấp nhất với 1,76±0,03 0,86±0,02 0,19±0,005 1,95±0,096<br /> nồng độ 0,0002 mg/ml. Ghi chú: Hàm lượng được tính bằng% (khối lượng/khối<br /> lượng), n=6<br /> Bảng 11: Kết quả khảo sát LOD và LOQ của quy<br /> Bảng 13: Hàm lượng (%) acid clorogenic trong V.<br /> trình định lượng<br /> hardwickii và V. officinalis<br /> A.<br /> Rhoifolin Neobudofficid Linarin Lá Thân Rễ Lá Rễ<br /> clorogenic<br /> (mg/ml) (mg/ml) (mg/ml) V. V. V. V. V.<br /> (mg/ml)<br /> hardwickii hardwickii hardwickii officinalis officinalis<br /> LOD 0,029 0,0010 0,00020 0,015<br /> 1,76±0,03 8,23±0,13 1,68±0,03 5,30±0,09 1,45±0,02<br /> LOQ 0,097 0,0033 0,00067 0,050<br /> Ghi chú: Hàm lượng được tính bằng % (khối lượng/khối<br /> Hàm lượng các hợp chất phân tích lượng), n=6<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4: Sắc ký đồ (SIR) của acid clorogenic trong V. hardwickii và V. officinalis<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 21<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019<br /> <br /> 2. Bell CD (2007), "Phylogenetic placement and<br /> BÀNLUẬN biogeography of the North American species of<br /> Valerianella (Valerianaceae: Dipsacales) based on<br /> Phương pháp UHPLC với đầu dò MS chloroplast and nuclear DNA". Molecular Phylogenetics<br /> single quadrupole ACQUITY® QDa chưa được and Evolution. 44(3): pp. 929-941.<br /> 3. Bell CD, et al. (2005), "Phylogeny and biogeography of<br /> áp dụng phổ biến. Một vài công trình công bố Valerianaceae (Dipsacales) with special reference to the<br /> South American Valerians". Organisms Diversity &<br /> với đầu dò này bao gồm các phân tích acid<br /> Evolution. 5(2): pp. 147-159.<br /> amin (phenylalanin, tyrosin, tryptophan, 4. Bộ Y Tế (2009), Dược Điển Việt Nam IV. NXB Y Học.<br /> 5. Chai SW, et al. (2015), "Chemical constituents from<br /> kynurenin) trong chuột , phân tích các<br /> (15)<br /> whole plants of Valeriana hardwickii". Zhongguo Zhong<br /> peptid (bleomycin sulfat, tyrothricin, Yao Za Zhi. 40(20): pp. 4007-11.<br /> 6. Chandra SM, et al. (2007), "Epoxysesquithujene, a novel<br /> vancomycin HCl, bacitracin)(17). Đầu dò này sesquiterpenoid from Valeriana hardwickii var.<br /> cũng được dùng để theo dõi phản ứng, xác hardwickii". Fitoterapia. 78(4): pp. 279-282.<br /> 7. Đặng Văn Hòa, et al. (2011), Kiểm nghiệm thuốc. Hà<br /> định các tạp trong thuốc, xác định thuốc trừ Nội: NXB Giáo dục Việt Nam.<br /> 8. Đỗ Huy Bích, et al. (2004), Cây thuốc và động vật làm<br /> sâu, flavonoid trong nuớc ép trái cây, các cao<br /> thuốc ở Việt Nam. Hà Nội: NXB Khoa Học và Kỹ<br /> chiết thấm qua da(24). Lần đầu tiên, phương Thuật.<br /> 9. Đỗ Ngọc Thanh, et al. (1989), "Sơ bộ nghiên cứu quá<br /> pháp này được áp dụng trong định lượng các trình tách, chiết valepotriat từ rễ cây Nữ lang". Tạp chí<br /> thành phần trong Valeriana hardwickii và định Dược học. 2: pp. 19-20,26.<br /> 10. Houghton PJ (1997), Valerian: The Genus Valeriana.<br /> lượng acid clorogenic trong V. officinalis. Medicinal and Aromatic Plants - Industrial Profiles, ed.<br /> Roland Hardman. Vol. 1. Amsterdam - The<br /> Phương pháp được xây dựng với thời gian Netherlands: Harwood Academic, pp.142.<br /> phân tích ngằn (dưới 10 phút). Trong nghiên cứu 11. Huber L, (2007) Regulations, Standards and Guidelines,<br /> in Validation and Qualification in Analytical<br /> này, hệ dung môi được thăm dò sao cho tách Laboratories, Second Edition., CRC Press. p. 9-24.<br /> được acid clorogenic ra khỏi đồng phân của nó, 12. Huynh L, et al. (2016), "Iridoids and flavonoids from<br /> Valeriana hardwickii Wall". Journal of Pharmacognosy and<br /> điều này thể hiện các pic đồng phân này trên sắc Phytochemistry. 5(3): pp. 245.<br /> 13. Huynh L, et al. (2013), "Comparative analysis of the<br /> ký đố (Hình 4), việc thăm dò này tốn nhiều thời<br /> essential oils of Valeriana hardwickii Wall. from Vietnam<br /> gian và thừ với nhiều hệ dung môi. and Valeriana officinalis L. from Austria". Journal of<br /> Essential Oil Research. 25(5): pp. 409-414.<br /> KẾTLUẬN 14. Huỳnh Lời, et al. (2015), "Nghiên cứu về cây Nữ lang<br /> Hardwicke III – Độc tính trên dòng tế bào thần kinh<br /> Phương pháp UHPLC-MS đã được xây của isovaleroxyvaltrat hydrin và linarin phân lập từ<br /> dựng và đánh giá theo hướng dẫn ICH. Hàm Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall.<br /> Valerianaceae) và tác dụng chống oxy hoá của Valeriana<br /> lượng các hợp chất trong V. hardwickii đã được<br /> hardwickii và Valeriana officinalis". Chuyên đề Dược, Y<br /> định lượng với acid clorogenic có trong lá là Học TP. Hồ Chí Minh. Phụ bản 19(3): tr. 574-580.<br /> 1,76%, trong thân là 8,23% và trong rễ là 15. Jaroslav G, et al. (2016), "Quantitative analysis of<br /> phenylalanine, tyrosine, tryptophan and kynurenine in<br /> 1,68%, hàm lượng các flavonoid trong lá bao rat model for tauopathies by ultra-high performance<br /> gồm rhoifolin là 0,86%, neobudofficid là 0,19% liquid chromatography with fluorescence and mass<br /> và linarin là 1,95%. Acid clorogenic trong lá và spectrometry detection". Journal of Pharmaceutical and<br /> Biomedical Analysis. 117: pp. 85-90.<br /> rễ của V. officinalis cũng đuợc định lượng với 16. Jayashankar D, et al. (2011), "Volatile Constituents of<br /> hàm lượng lần lượt là 5,30% và 1,45%. Valeriana hardwickii Wall. Root Oil from Arunachal<br /> Pradesh, Eastern Himalaya". Records of Natural Products.<br /> TÀILIỆUTHAMKHẢO 5(1): pp. 70-73.<br /> 1. Bashir S, et al. (2011), "Antispasmodic and 17. Matthias DH, et al. (2016), "Implementation of a<br /> Antidiarrheal Activities of Valeriana hardwickii Wall. single quad MS detector in routine QC analysis of<br /> Rhizome Are Putatively Mediated through Calcium peptide drugs". Journal of Pharmaceutical Analysis.<br /> Channel Blockade". Evid Based Complement Alternat 6(1): pp. 24-31.<br /> Med. 2011: pp. 304960.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 22 Chuyên Đề Dược<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 23 * Số 2 * 2019 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> 18. Meyer FG (1965), "New species of Valeriana from 23. Võ Văn Chi (2010), Tự điển cây thuốc Việt Nam. Hà<br /> Colombia, Ecuador, and Peru". Brittonia. 17: pp. 112- Nội: NXB Y Học.<br /> 120. 24. Xiaodong B, et al. (2016), "The emergence of low-cost<br /> 19. Meyer FG (1979), "A new species of Valeriana compact mass spectrometry detectors for<br /> (Valerianaceae) from Venezuela". Brittonia. 31(1): pp. chromatographic analysis". TrAC Trends in Analytical<br /> 101-103. Chemistry. 82: pp. 22-34.<br /> 20. Sati S, et al. (2005), "Essential oil composition of<br /> Valeriana hardwickii var. arnottiana from the Himalayas". Ngày nhận bài báo: 18/10/2018<br /> Flavour and fragrance journal. 20: pp. 299-301.<br /> 21. Takhtajan A (2009), Flowering plants. Springer Science & Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2018<br /> Business Media. Ngày bài báo được đăng: 15/03/2019<br /> 22. Võ Văn Chi (2002), Từ điển thực vật thông dụng. Hà Nội:<br /> NXB Khoa Học - Kỹ Thuật.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Chuyên Đề Dược 23<br />