Xây dựng quy trình định lượng đồng thời physalin B và D trong lá thù lù cạnh (Physalis angulata L.) bằng phương pháp HPLC-PDA

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

9
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Cây thù lù cạnh hay cây tầm bóp - Physalis angulata L., thuộc họ Cà – Solanaceae. Bài viết trình bày xây dựng quy trình định lượng đồng thời physalin B và D trong lá thù lù cạnh (Physalis angulata L.) bằng phương pháp HPLC-PDA.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời physalin B và D trong lá thù lù cạnh (Physalis angulata L.) bằng phương pháp HPLC-PDA

Xây dựng quy trình định lượng đồng thời physalin B và D trong lá thù lù cạnh (Physalis angulata L.) bằng phương pháp HPLC-PDA Trần Hoàng Lâm1,2, Nguyễn Thị Ngọc Vân1* 1 Trường Đại học Y Dược Cần Thơ 2 Trường Đại học Kiên Giang Summary In Vietnam, Physalis angulata L. has been widely used as a traditional medicine to treat fever, anti-inflammatory, and expectorant. Currently, there have been studies on the content of chemical composition especially physalin with anti-diabetic, anti-inflammatory, antibacterial, anti-cancer: Determination and validation simultaneous physalin B and physalin D in Physalis angulata L. by chorpmatography using PDA detector and applying to the sample in Mekong Delta. Leaves collected from Kien Giang, the method was validated under AOAC guidance. Chromatography condition: Agilent C18 column (250 mm x 4.6 mm; 5 µm) with a gradient mode using acetinitrile – methanol – water as mobile phase. The recovery of method ranged 94.21 – 105.93 % and RSD is from 1.20 – 2.31 %, the LOD and LOQ were in the range 0.4 – 2.0 µg/mL, respectively. The results of the study showed that the proposed HPLC-PDA methods precise and accurate, the method was helpful for identification and quantification of the physalin in Mekong Delta. Keywords: Physalin B, physalin D, physalis angulata, HPLC-PDA. Đặt vấn đề withaminimin, đặc biệt là physalin có hoạt tính Cây thù lù cạnh hay cây tầm bóp - Physalis chống tiểu đường, chống viêm, kháng khuẩn, angulata L., thuộc họ Cà – Solanaceae [2, 11]. đặc biệt là chống ung thư [9]. Tại Việt Nam hiện Trong kho tàng cây thuốc Việt Nam, cây thù lù nay, việc sử dụng cây thù lù cạnh trong điều trị cạnh đã được sử dụng rộng rãi như là loại thuốc bệnh ngày càng được quan tâm nhiều hơn truyền thống từ nhiều thế kỷ trước cho đến hiện nhưng các công trình nghiên cứu về thù lù cạnh nay để điều trị cảm sốt, kháng viêm, tiêu đờm [1]. còn khá ít và chủ yếu là khảo sát thành phần Trên thế giới đã có những công trình nghiên cứu hóa học, phân lập và đánh giá tác dụng dược lý, về thành phần hóa học, tính chất dược lý và hoạt tính sinh học của cây thù lù cạnh được thu có rất ít nghiên cứu về việc kiểm soát chất thập ở Peru, Brazil, Nigeria, Samoa, Mexico, lượng dược liệu thù lù cạnh [3, 6, 8]. Do đó, việc Bolivia, Ấn Độ, Indonesia, Vương quốc Tonga, nghiên cứu quy trình định lượng physalin có Kenya. Đã chứng minh sự hiện diện của các trong cây thù lù cạnh là một việc làm cấp thiết. hoạt chất tự nhiên như alkaloid, acid phenolic, Nguyên liệu và phương pháp flavonoid, steroid thực vật như withanolid, nghiên cứu Nguyên liệu Lá của cây thù lù cạnh thu hái tại Thành phố Chịu trách nhiệm: Nguyễn Thị Ngọc Vân Rạch Giá, Tỉnh Kiên Giang. Lá được phơi khô Email: nguyenthingocvanct@gmail.com loại bỏ tạp, xay, rây qua cỡ rây 0,3 mm và Ngày nhận: 08/12/2021 được kiểm tra dựa trên các chỉ tiêu kiểm Ngày phản biện: 13/12/2021 nghiệm dược liệu của Dược điển Việt Nam V, Ngày duyệt bài: 25/01/2022 với hàm ẩm đạt (< 10 %). 34 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 40 - THÁNG 1/2022
Chất đối chiếu, hóa chất, dung môi, chuẩn gốc physalin B và 1 mL chuẩn gốc thiết bị physalin D vào bình định mức 20 mL, bổ sung Chất đối chiếu dung môi đến vạch, lắc đều kĩ, thu được dung - Chất chuẩn physalin B (hàm lượng ≥ 98,0 %) dịch chuẩn gốc physalin D nồng độ 50 µg/mL. của Chemface. - Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 0,5 g mẫu - Chất chuẩn physalin D (hàm lượng ≥ 98,0 %) thử chiết 4 lần, mỗi lần với 5 mL MeOH, siêu âm của Chemface. trong 15 phút. Gộp dịch chiết, đem 5 mL dịch Hóa chất chiết cho vào ống ly tâm 15 mL (1) đi thổi khô - Methanol, acetonitrile, nước cất đạt chuẩn dung môi đến cắn. Cho vào cắn 4 mL hỗn hợp HPLC (Hãng Merck). NaCl, MgSO4 khan nước : acetonitril (1:1), vortex 2 phút, ly tâm (Fisher). Primary Secondary Amine (PSA), 5000 vòng/3 phút. Tiến hành loại tạp phân cực Graphitized Carbon Black (GCB) (Sigma – bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng, cho 1,2 g Aldrich). MgSO4 và 0,3 g NaCl vào ống ly tâm chứa dịch Thiết bị chiết, hút lớp trên cho vào ống ly tâm 15 mL (2). Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Thêm vào ống (1) 2 mL acetonitril, lắc chiết lần Shimadzu (LC 20AD) gồm hệ thống tiêm mẫu tự 2, vortex 2 phút, ly tâm 5000 vòng/3 phút, hút động, bơm, lò cột và trang bị đầu dò PDA, cột hết lớp trên cho vào ống (2). Đem ống (2) thổi Agilent C18 (250 mm x 4,6 mm; 5 µm). khô đến cắn sau đó hòa tan bằng 1 mL Thiết bị phân tích được hiệu chuẩn định kỳ acetonitril. Tiếp tục làm sạch với 50 mg PSA và theo tiêu chuẩn ISO/IEC 17025. 7,5 mg GCB. Cuối cùng lọc vào vial và tiêm vào Phương pháp nghiên cứu hệ thống sắc ký. Chuẩn bị mẫu phân tích - Mẫu trắng: Dung môi pha động/dung môi - Chuẩn gốc physalin B: Cân chính xác hòa tan mẫu. khoảng 5 mg chất chuẩn physalin B cho vào - Mẫu blank lá: Mẫu lá không còn hoạt chất bình định mức 5 mL, bổ sung vừa đủ methanol, được sấy khô và bảo quản như mẫu thử. siêu âm 10 phút, thu được dung dịch chuẩn gốc Điều kiện sắc ký physalin B nồng độ 1000 µg/mL. - Cột sắc ký: Agilent C18 (4,6 x 250 mm; - Chuẩn gốc physalin D: Cân chính xác 5 µm). khoảng 5 mg chất chuẩn physalin D cho vào - Tốc độ dòng: 1 mL/phút. bình định mức 5 mL, bổ sung vừa đủ methanol, - Thể tích tiêm: 20 µL. siêu âm 10 phút, được dung dịch chuẩn gốc - Nhiệt độ cột: 30 oC. physalin D nồng độ 1000 µg/mL. - Bước sóng phát hiện: 225 nm. - Hỗn hợp chuẩn gốc: Hút chính xác 1 mL Bảng 1. Điều kiện sắc ký Kênh A (%) Kênh B (%) Kênh D (%) Thời gian (phút) (Acetonitril) (Methanol) (Nước) 0,01 0 10 90 1,5 0 10 90 2,0 22 10 68 Chương trình 13,0 35 10 55 gradient 14,0 40 10 50 26,0 55 10 35 27,0 80 10 10 28,0 80 10 10 29,0 0 10 90 35,0 0 10 90 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 40 - THÁNG 1/2022 35
Thẩm định quy trình phân tích Kết quả nghiên cứu Thẩm định quy trình phân tích theo hướng Kết quả thẩm định quy trình phân tích dẫn của AOAC bao gồm các chỉ tiêu: tính tương Tính tương thích hệ thống thích hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần mẫu hỗn hợp giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng chuẩn physalin B và physalin D nồng độ (LOQ), độ chính xác và độ đúng [4]. 20 µg/mL với điều kiện HPLC đã chọn. Kết quả Ứng dụng cho thấy RSD % của thời gian lưu và diện tích Định lượng quy trình đã thẩm định để xác đỉnh của hai chất đều nhỏ hơn 2 %, các hệ số định hàm lượng physalin B và physalin D có khác như hệ số bất đối (0,8 ≤ As ≤ 1,5), độ phân trong 8 mẫu lá thu thập ở 4 tỉnh vùng Đồng bằng giải (Rs ≥ 1,5), hệ số dung lượng (1 < k’ < 8), số sông Cửu Long. đĩa lý thuyết (N > 2000) đều đạt yêu cầu theo AOAC. Bảng 2. Kết quả tính tương thích hệ thống trên hỗn hợp chuẩn physalin B và physalin D Thời gian Diện tích Hệ số bất Độ phân Hệ số dung Số đĩa lý lưu (tR) đỉnh (S) đối (As) giải (Rs) lượng (k’) thuyết (N) TB 15,446 309.916 1,163 -- 5,781 28.115 Physalin D SD 0,01 1.394 0,007 -- 0,004 301 RSD % 0,07 0,45 0,62 -- 0,073 1,07 TB 19,296 639.863 1,0 10,365 7,471 42.471 Physalin B SD 0,009 3.179 0,006 0,057 0,004 587 RSD % 0,05 0,5 0,6 0,55 0,05 1,38 Độ đặc hiệu (i) (h) (g) (f) (e) (d) (c) (b) (a) Hình 1. Sắc ký đồ đánh giá tính đặc hiệu (a) Mẫu chuẩn physalin D; (b) Mẫu chuẩn physalin B; (c) Mẫu hỗn hợp chuẩn; (d) Dung môi pha động; (e) Dung môi chiết; (f) Dung môi hòa tan; (g) Mẫu blank lá; (h) Mẫu thử; (i) Mẫu thử thêm chuẩn. 36 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 40 - THÁNG 1/2022
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn, mẫu blank phương pháp có tính đặc hiệu đạt yêu cầu. lá, mẫu dung môi hòa tan, mẫu dung môi pha Tính tuyến tính động, mẫu dung môi chiết, mẫu thử, mẫu thử Tiến hành phân tích 7 mẫu chuẩn hỗn hợp có thêm chuẩn. Kết quả phân tích được trình bày nồng độ từ 2 – 50 µg/mL đối với physalin B và trong hình 1 cho thấy ở sắc ký đồ mẫu blank lá, nồng độ từ 10 – 250 µg/mL đối với physalin D mẫu dung môi chiết, mẫu dung môi pha mẫu, với điều kiện HPLC đã chọn. Xây dựng phương mẫu dung môi pha động không xuất hiện pic trình hồi quy thể hiện mối tương quan giữa nồng trùng thời gian lưu với các chất cần phân tích so độ và diện tích pic của physalin D và physalin B. với sắc ký đồ của hỗn hợp các chất chuẩn. Sắc LOD và LOQ ký đồ của mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn có LOD và LOQ được xác định dựa vào giá trị xuất hiện các pic có thời gian lưu trùng với các số tín hiệu/ nhiễu (S/N) tại nồng độ thấp nhất mà chất phân tích trong mẫu chuẩn. Như vậy S/N lần lượt 3 và 10. Bảng 3. Kết quả thẩm định tính tuyến tính, LOD và LOQ Chất phân tích Phương trình hồi quy R2 LOD (µg/mL) LOQ (µg/mL) Physalin D y = 5014,6x – 3167,1 0,9998 0,4 1,35 Physalin B y = 9921,4x – 471,62 0,9997 0,5 2,0 Kết quả thẩm định cho thấy trong khoảng hợp chuẩn physalin B và physalin D tương ứng nồng độ 2 – 250 µg/mL có sự tương quan tuyến lần lượt với ba mức nồng độ thấp là 15 µg/mL tính giữa nồng độ và diện tích pic của các chất và 20 µg/mL, nồng độ trung bình là 30 µg/mL và phân tích với hệ số tương quan R2 > 0,995. 40 µg/mL, nồng độ cao là 45 µg/mL và LOD và LOQ của hai chất cần phân tích giá trị 60 µg/mL. Độ đúng được xác định dựa trên % tương đối thấp (0,4 – 2,0 µg/mL). lượng chất thu hồi so với lượng chuẩn đã thêm Độ đúng và độ chính xác vào. Ở mỗi nồng độ được phân tích lặp lại 6 lần Thêm vào mẫu trắng một lượng xác định hỗn mỗi ngày, trong 3 ngày liên tiếp. Bảng 4. Kết quả thẩm định độ đúng và độ chính xác Độ chính xác Độ thu hồi (%) Chất (30 µg/mL) (n = 6) phân tích Nồng độ Trong ngày Liên ngày Nồng độ thấp Nồng độ cao trung bình RSD % RSD % Physalin D 105,93 105,36 102,43 1,52 1,92 Physalin B 94,21 102,55 104,08 1,76 1,50 Độ thu hồi trong khoảng 94,21 – 105,93 %. cạnh ở bốn tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long RSD % của các phân tích trong ngày và liên Quy trình phân tích sau khi thẩm định đạt yêu ngày đều thấp. Như vậy, phương pháp đã xây cầu được ứng dụng để định lượng physalin D dựng có độ thu hồi và độ chính xác đạt yêu cầu và physalin B có trong cây thù lù cạnh (Physalis theo quy định AOAC. angulata L.) ở Đồng bằng sông Cửu Long. Kết Ứng dụng quy trình định lượng các quả phân tích được trình bày ở bảng 5. physalin B và physalin D trong cây thù lù TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 40 - THÁNG 1/2022 37
Bảng 5. Kết quả định lượng physalin B và physalin D trong lá thù lù cạnh STT Nơi thu mẫu Physalin D (%)* Physalin B (%)* 1 Tịnh Biên (An Giang) 0,617 -- 2 Thới Bình (Cà Mau) 0,679 0,0003 3 TP. Cà Mau (Cà Mau) 0,824 -- 4 Châu Thành A (Hậu Giang) 0,121 -- 5 Châu Thành (Kiên Giang) 0,770 0,0007 6 Giồng Riềng (Kiên Giang) 0,673 -- 7 Rạch Giá (Kiên Giang) 1,187 -- 8 Vĩnh Thuận (Kiên Giang) 0,865 -- * g/100g dược liệu khô Bàn luận Huyện Châu Thành, Tỉnh Đồng Tháp đã phát Dược liệu là một nền mẫu phức tạp nên việc hiện thành phần physalin B và G bằng kỹ thuật lựa chọn quy trình xử lý mẫu và thiết bị phân NMR. So sánh với nghiên cứu của chúng tôi, ghi tích phải đòi hỏi có khả năng làm sạch mẫu, nhận hàm lượng physalin D đáng kể [8], đây phân tích đồng thời các chất phân tích với độ cũng là tính mới của công trình nghiên cứu. nhạy và độ đặc hiệu cao. Dịch chiết được loại Phương pháp đã ứng dụng định lượng tạp phân cực bằng phương pháp chiết lỏng – physalin D và physalin B trên 8 mẫu lá cây thù lù lỏng và làm sạch mẫu bằng PSA và GCB. Kết cạnh (Physalis angulata L.) thu hái ở 4 tỉnh quả cho thấy phương pháp xử lý mẫu tuy đơn thuộc Đồng bằng sông Cửu Long. Hàm lượng giản nhưng cho hiệu suất thu hồi khá cao, độ physalin D trong lá cây thu hái ở Thành phố lặp lại ổn định. Rạch Giá, Tỉnh Kiên Giang là 1,187 % cao đáng Trên thế giới, có nhiều nghiên cứu về các kể so với các mẫu thu ở nơi khác. Bên cạnh đó, physalin B và physalin D trong cây thù lù cạnh physalin B chỉ phát hiện được trong hai mẫu lá với nhiều kỹ thuật phân tích khác nhau như: Sắc thu ở Thới Bình (Cà Mau) và Châu Thành (Kiên ký cột [12]; Sắc ký lỏng hiệu suất trung bình Giang) với hàm lượng thấp, chỉ từ 0,0003 – (MPLC) [10]; Sắc ký lỏng hiệu năng cao 0,0007 %. (HPLC) [5, 7]. Đa số các nghiên cứu tập trung Kết luận phân lập hợp chất physalin ở các phân đoạn Nghiên cứu đã xác định được đồng thời hàm khác nhau và đánh giá các hoạt tính sinh học. lượng physalin D và physalin B trong các mẫu lá Hiện tại, còn rất ít nghiên cứu định lượng đồng thù lù cạnh bằng phương pháp sắc ký lỏng đầu thời các physalin có trong cây thù lù cạnh. Vì dò DAD. Quy trình xử lý mẫu đơn giản nhưng thế, nghiên cứu này lựa chọn HPLC-PDA là nhưng cho hiệu suất thu hồi tốt, độ lặp lại ổn phương pháp định lượng phổ biến, thường quy, định. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có độ chính xác cao để phân tích đồng thời có độ chọn lọc cao, khoảng tuyến tính với hệ số physalin B và physalin D trong cây thù lù cạnh. tương quan cao, giá trị giới hạn định lượng nhỏ Phương pháp đã xây dựng có khả năng định (1,35 µg/mL với physalin D và 2,0 µg/mL với tính và định lượng được đồng thời 2 chất nghiên physalin B); khoảng tuyến tính rộng (từ 2 – cứu với LOD và LOQ trong khoảng từ 0,4 – 50 µg/mL với physalin B và 10 – 250 µg/mL với 2,0 µg/mL. Nghiên cứu của tác giả Tôn Nữ Liên physalin D); độ đúng dao động trong khoảng Hương và CS. trên cây thù lù cạnh thu hái ở 94,21 – 105,93 %; độ lặp lại với giá trị RSD % 38 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 40 - THÁNG 1/2022
nhỏ (1,50 – 1,92 %), đáp ứng yêu cầu đối với 7. Manuela Oliveira de Souza et al. (2013), phương pháp phân tích theo AOAC. Phương "Osmotic priming effects on emergence of pháp đã ứng dụng định lượng physalin D và Physalis angulata and the influence of abiotic physalin B có trong cây thù lù cạnh (Physalis stresses on physalin content", South African angulata L.) ở 4 tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long. Journal of Botany, 88, pp. 191-197. Tài liệu tham khảo 8. Ton Nu Lien Huong et al. (2016), 1. Đỗ Huy Bích và CS. (2006), Cây thuốc "Chemical constituents of Physalis angulata L. và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập II, NXB. (family solanaceae)", Can Tho University Khoa học và Kỹ thuật, tr. 792-793. Journal of Science, 2016 (02), pp. 46-49. 2. Võ Văn Chi (2005), Cây rau, trái đậu 9. Elsa Rengifo - Salgado and Gabriel dùng để ăn và trị bệnh, NXB. Khoa học và Kỹ Vargas - Arana (2013), "Physalis angulata L. thuật, TP. Hồ Chí Minh, tr. 308-309. (Bolsa Mullaca): A review of its traditional uses, 3. Đỗ Thanh Tuân (2017), "Nghiên cứu tài chemistry and pharmacology", Boletín nguyên cây thuốc các huyện ven biển của Tỉnh Latinoamericano y del Caribe de Plantas Thái Bình và đề xuất biện pháp bảo tồn, phát Medicinales y Aromáticas, 12 (5), pp. 431-445. triển bền vững", Luận án Tiến sĩ sinh học, Học 10. Milena B. P. Soares et al. (2003), viện Khoa học và Công nghệ. "Inhibition of macrophage activation and 4. AOAC (2011), Standard Format and lipopolysaccaride - induced death by seco - Guidance for AOAC Standard Method steroids purified from Physalis angulata L.", Performance Requirement (SMPR) Documents. European Journal of Pharmacology, 459 (1), tr. 5. J. C. C. Arruda et al. (2021), "Physalin 107-112. pool from Physalis angulata L. leaves and 11. Armen Takhtajan (2009), Flowering physalin D inhibit P2X7 receptor function in vitro plants, Springer Science & Business Media, pp. and acute lung injury in vivo", Biomed. 533 - 535. Pharmacother., 142, pp. 112006. 12. Yan-Jun Yang et al. (2018), "Physalin B 6. Le Canh Viet Cuong et al. (2020), "The suppresses inflammatory response to anti-microbial activities of secosteroids isolated lipopolysaccharide in RAW264. 7 cells by from Physalis angulata", Vietnam Journal of inhibiting NF-κB signaling", Journal of Chemistry, 58 (3), pp. 321-326. Chemistry, 2018, pp. 1-6. TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 40 - THÁNG 1/2022 39