intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE

Nghiên cứu định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: Ni Ni | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

120
lượt xem
7
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết tiến hành nghiên cứu xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha động sử dụng acetonitril - đệm KH2PO4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 340 nm và tốc độ dòng 0,8 ml/phút.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu định lượng đồng thời curcumin và piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CURCUMIN VÀ<br /> PIPERIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br /> Phạm Thị Phương*; Nguyễn Quỳnh Ngọc*; Phạm Thị Thanh Hương*<br /> Đào Văn Đôn*; Nguyễn Thị Thanh Phương**<br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời curcumin và<br /> piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha động sử dụng acetonitril đệm KH2PO4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 340 nm<br /> và tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Cả 2 chất đã được tách hoàn toàn trong thời gian 10 phút. Giới hạn<br /> định lượng của curcumin và piperin là 0,06 và 0,08 µg/ml. Diện tích pic và nồng độ các chất có<br /> mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ 1. Phương pháp có độ chính xác cao,<br /> độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Tỷ lệ thu hồi cả 2 chất từ 93 - 100%. Phương pháp này được sử<br /> dụng để định lượng curcumin và piperin trong chế phẩm chứa curcumin và piperin.<br /> * Từ khóa: Curcumin; Piperin; HPLC; Định lượng.<br /> <br /> SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF CURCUMIN AND<br /> PIPERINE IN SUPPLEMENT BY HPLC<br /> SUMMARY<br /> A HPLC method for the simultaneous quantification of curcumin and piperine in supplements<br /> was validated. Using acetonitrile and buffer KH2PO4 50 mM (60/40, v/v) as the mobile phase,<br /> Gemini C18 (250 x 4.6 nm, 5 µm) column, UV detection at 340 nm and flow at 0.8 ml/min, curcumin<br /> and piperine were separated satisfactorily within 10 minutes. The quantitation limits of curcumin<br /> and piperine were 0.6 µg/ml and 0.8 µg/ml. The calibration curve of each analyte had a correlation<br /> coefficient close to 1. The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were<br /> 93 - 100% for both curcumin and piperine.<br /> * Key words: Curcumin, Piperine, HPLC; Quantification.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Curcumin là hoạt chất chính của Nghệ<br /> vàng (Curcuma longa L.) [1]. Curcumin có<br /> tác dụng sinh học ưu việt như: ức chế sự<br /> phát triển của khối u, tăng khả năng miễn<br /> dịch, chất chống oxy hóa mạnh, chữa một<br /> <br /> số bệnh tiêu hóa, gan mật, kháng khuẩn,<br /> chống viêm… Curcumin rất kém tan trong<br /> nước (độ tan 0,001%) và sinh khả dụng đạt<br /> 2 - 3%. Các nghiên cứu cho thấy: piperin<br /> làm tăng sinh khả dụng của curcumin lên<br /> <br /> * Học viện Quân y<br /> ** Trung tâm Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 13/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/07/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 28/07/2014<br /> <br /> 7<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> 20 lần [2, 3]. Hiện nay, trên thị trường Việt<br /> Nam đã xuất hiện những sản phẩm kết hợp<br /> curcumin và piperin (tỷ lệ khoảng 100:1)<br /> nhưng vẫn chưa có phương pháp định<br /> lượng đồng thời 2 chất trên. Vì vậy, chúng<br /> tôi thực hiện nghiên cứu nhằm: Xây dựng<br /> quy trình định lượng đồng thời curcumin<br /> và piperin bằng phương pháp HPLC.<br /> NGUYÊN VẶT LIỆU VÀ<br /> PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên<br /> cứu.<br /> * Hóa chất, nguyên liệu:<br /> - Chất chuẩn: curcumin chuẩn (96,3%,<br /> Himedia Laboratories, Ấn Độ), piperin<br /> chuẩn (99,0%, Sigma- Aldrich).<br /> - Mẫu thử: chế phẩm chứa curcumin và<br /> piperin.<br /> - Methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn<br /> HPLC (Merck).<br /> - Dung môi, hóa chất khác: KH2PO4,<br /> H3PO4, nước cất… đạt tiêu chuẩn tinh khiết<br /> phân tích.<br /> * Thiết bị và dụng cụ phân tích:<br /> - Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D,<br /> 4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có<br /> buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc<br /> ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).<br /> - Cân phân tích Sartorius độ chính xác<br /> ± 0,1 mg, máy lắc siêu âm, máy đo pH,<br /> các dụng cụ thủy tinh, bình định mức,<br /> pipet có độ chính xác phù hợp.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> - Khảo sát quy trình định lượng.<br /> + Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu<br /> [5, 6], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý<br /> mẫu như sau:<br /> <br /> 8<br /> <br /> Cân chính xác lượng bột tương đương<br /> với khoảng 50 mg curcumin, thêm khoảng<br /> 40 ml MeOH, lắc đều. Chiết siêu âm trong<br /> 20 phút. Để nguội, chuyển toàn bộ dịch<br /> chiết vào bình định mức 50 ml. Thêm<br /> MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc lấy<br /> dịch lọc. Lấy 1 ml dịch lọc đem bốc hơi ở<br /> nhiệt độ phòng tới cắn. Hòa tan cắn trong<br /> 10 ml pha động. Lọc qua màng lọc 0,45 µl<br /> trước khi phân tích bằng HPLC.<br /> + Điều kiện sắc ký [5, 6]:<br /> Cố định các điều kiện: cột Gemini C18<br /> (250 x 4,6 mm, 5 µm); detector PDA;<br /> thể tích bơm mẫu 50 µl; tốc độ dòng<br /> 0,8 ml/phút. Khảo sát pha động với hệ dung<br /> môi MeOH:nước và đệm KH2PO4:ACN.<br /> - Thẩm định quy trình định lượng.<br /> Thẩm định quy trình định lượng theo<br /> hướng dẫn của Bộ Y tế [4] gồm các chỉ<br /> tiêu: tính tương thích của hệ thống sắc<br /> ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng<br /> độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn<br /> định lượng, độ chính xác, độ đúng.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Khảo sát quy trình định lƣợng.<br /> Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo<br /> sát điều kiện sắc ký và ghi sắc ký đồ.<br /> Phân tích kết quả và lựa chọn được điều<br /> kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời<br /> curcumin và piperin như sau: cột sắc ký:<br /> cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm),<br /> detector PDA, ghi phổ ở 340 nm. Pha<br /> động: hỗn hợp dung môi acetonitril và<br /> dung dịch đệm KH2PO4 50 mM (điều chỉnh<br /> đến pH = 3,5 bằng axít phosphoric) tỷ lệ<br /> 60:40 (v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể<br /> tích bơm mẫu 50 µl, thời gian phân tích:<br /> 10 phút.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> 2. Thẩm định quy trình định lƣợng.<br /> - Tính tương thích hệ thống sắc ký:<br /> Tiến hành sắc ký 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp các chất curcumin và piperin<br /> đều có nồng độ 10 µg/ml theo điều kiện đã lựa chọn. Kết quả về thời gian lưu và diện<br /> tích pic được trình bày trong bảng 1.<br /> Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.<br /> STT<br /> <br /> tR (phút)<br /> <br /> Spic(µV.s)<br /> <br /> tR (phút)<br /> <br /> Spic(µV.s)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 8,155<br /> <br /> 523508<br /> <br /> 8,931<br /> <br /> 1374756<br /> <br /> 2<br /> <br /> 8,156<br /> <br /> 526881<br /> <br /> 8.973<br /> <br /> 1375616<br /> <br /> 3<br /> <br /> 8,149<br /> <br /> 534524<br /> <br /> 8,948<br /> <br /> 1372662<br /> <br /> 4<br /> <br /> 8,154<br /> <br /> 523406<br /> <br /> 8,961<br /> <br /> 1378233<br /> <br /> 5<br /> <br /> 8,144<br /> <br /> 521094<br /> <br /> 8,950<br /> <br /> 1375421<br /> <br /> 6<br /> <br /> 8,143<br /> <br /> 520245<br /> <br /> 8,950<br /> <br /> 1375634<br /> <br /> X<br /> <br /> 8,150<br /> <br /> 524943<br /> <br /> 8,950<br /> <br /> 1375387<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 0,07<br /> <br /> 0,99<br /> <br /> 0,15<br /> <br /> 0,13<br /> <br /> Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic của cả 2 chất đều < 2%,<br /> chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân tích 2 chất<br /> trên trong các mẫu.<br /> - Độ chọn lọc - đặc hiệu:<br /> Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp của curcumin, piperin đều có nồng độ 10 µg/ml,<br /> mẫu trắng và mẫu thử.<br /> <br /> (a)<br /> <br /> PI<br /> CUR<br /> <br /> (b)<br /> <br /> (c)<br /> CUR<br /> PI<br /> <br /> Hình 1: Sắc ký đồ của curcumin và<br /> piperin trong mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thử (c).<br /> <br /> 9<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của curcumin và<br /> piperin không xuất hiện các pic như ở mẫu chuẩn. Các pic của chất phân tích trong<br /> mẫu thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt và độ<br /> đặc hiệu cao.<br /> - Khoảng nồng độ tuyến tính:<br /> Pha một dãy dung dịch chuẩn curcumin có nồng độ khoảng 10 - 200 µg/ml, piperin<br /> có nồng độ khoảng 0,5 - 10 µg/ml và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn.<br /> Bảng 2: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của curcumin<br /> và piperin.<br /> (µg/ml)<br /> <br /> Diện tích pic (μV.s)<br /> <br /> 610060<br /> <br /> 3120758<br /> <br /> 6203550<br /> <br /> Phương trình hồi quy: y = 59798 x + 976,88<br /> Piperin.<br /> <br /> 9380402<br /> <br /> 12407214<br /> <br /> R² = 0,9999<br /> <br /> Nồng độ (µg/ml)<br /> <br /> 0,52<br /> <br /> 1,04<br /> <br /> 2,08<br /> <br /> 5,2<br /> <br /> 10,4<br /> <br /> Diện tích pic (μV.s)<br /> <br /> 29006<br /> <br /> 52082<br /> <br /> 96523<br /> <br /> 219847<br /> <br /> 452053<br /> <br /> Phương trình hồi quy: y = 42572 x + 6084,1; R² = 0,9994<br /> <br /> Hình 2: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của curcumin.<br /> <br /> Hình 3: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của piperin.<br /> Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ piperin<br /> và curcumin trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ~ 1.<br /> - Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới:<br /> Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn<br /> phát hiện và giới hạn định lượng của curcumin và piperin. Tiến hành pha thử 4 - 5<br /> nồng độ quanh điểm dự kiến. Kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của curcumin là<br /> 0,01 µg/ml và piperin là 0,02 µg/ml; giới hạn định lượng dưới của curcumin là 0,04 µg/ml<br /> và piperin là 0,08 µg/ml.<br /> <br /> 10<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br /> <br /> - Độ chính xác:<br /> Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB và nghiền thành bột mịn.<br /> Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin (tiến hành lặp lại<br /> 6 lần). Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký, kết quả được thể hiện trong bảng 3.<br /> Bảng 3: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPLC.<br /> <br /> (mg)<br /> <br /> DiÖn tÝch pic<br /> (μV.s)<br /> <br /> Hµm l-îng t×m thÊy<br /> (mg/viên)<br /> <br /> DiÖn tÝch pic (μV.s)<br /> <br /> Hµm l-îng t×m thÊy<br /> (mg/viên)<br /> <br /> 1<br /> <br /> 125,6<br /> <br /> 5205871<br /> <br /> 171,86<br /> <br /> 23014<br /> <br /> 1,34<br /> <br /> 2<br /> <br /> 124,8<br /> <br /> 5058579<br /> <br /> 168,94<br /> <br /> 22635<br /> <br /> 1,31<br /> <br /> 3<br /> <br /> 125,6<br /> <br /> 5247484<br /> <br /> 175,25<br /> <br /> 22887<br /> <br /> 1,33<br /> <br /> 4<br /> <br /> 124,9<br /> <br /> 4996609<br /> <br /> 166,87<br /> <br /> 22761<br /> <br /> 1,32<br /> <br /> 5<br /> <br /> 125,1<br /> <br /> 5064267<br /> <br /> 169,13<br /> <br /> 221295<br /> <br /> 1,27<br /> <br /> X<br /> <br /> 169,89<br /> <br /> RSD (%)<br /> <br /> 1,85<br /> <br /> 1,31<br /> 1,89<br /> <br /> Độ lệch chuẩn tương đối đều < 2%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác tốt,<br /> đáp ứng yêu cầu phân tích.<br /> - Độ đúng:<br /> Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB, và nghiền thành bột mịn.<br /> Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin với 6 lần cân<br /> khác nhau. Thêm 100 µl dung dịch chất chuẩn piperin có nồng độ 1.000 µg/ml, và 10 mg<br /> chuẩn curcumin, trộn đều, để khô tự nhiên. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký.<br /> Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp HPLC.<br /> C h Ê t<br /> <br /> Curcumin<br /> <br /> pepirin<br /> <br /> STT<br /> <br /> l - î n g<br /> <br /> 1<br /> <br /> 10<br /> <br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> <br /> mg)<br /> <br /> L - î n g<br /> <br /> (mg)<br /> <br /> T û<br /> <br /> 9,58<br /> <br /> 95,8<br /> <br /> 10,1<br /> <br /> 9,41<br /> <br /> 93,2<br /> <br /> 10,2<br /> <br /> 10,12<br /> <br /> 99,2<br /> <br /> 10<br /> <br /> 9,67<br /> <br /> 96,7<br /> <br /> 5<br /> <br /> 9,9<br /> <br /> 9,42<br /> <br /> 95,2<br /> <br /> 6<br /> <br /> 10,3<br /> <br /> 10,12<br /> <br /> 98,3<br /> <br /> 1<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,097<br /> <br /> 97<br /> <br /> 2<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,095<br /> <br /> 95<br /> <br /> 3<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,093<br /> <br /> 93<br /> <br /> 4<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,094<br /> <br /> 94<br /> <br /> 5<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,097<br /> <br /> 97<br /> <br /> 6<br /> <br /> 0,1<br /> <br /> 0,095<br /> <br /> 95<br /> <br /> (%)<br /> <br /> X = 96,41<br /> SD = 2,1<br /> RSD = 2,2%<br /> <br /> X = 95<br /> SD = 1,6<br /> RSD = 1,7%<br /> <br /> Tỷ lệ thu hồi của curcumin và piperin từ 93 - 99% nằm trong giới hạn cho phép<br /> (92% - 100%) với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao.<br /> <br /> 11<br /> <br />
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2