TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br />
<br />
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG ĐỒNG THỜI CURCUMIN VÀ<br />
PIPERIN BẰNG PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO<br />
Phạm Thị Phương*; Nguyễn Quỳnh Ngọc*; Phạm Thị Thanh Hương*<br />
Đào Văn Đôn*; Nguyễn Thị Thanh Phương**<br />
TÓM TẮT<br />
Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời curcumin và<br />
piperin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Pha động sử dụng acetonitril đệm KH2PO4 50 mM, cột phân tích Gemini C18 (250 x 4,6 nm, 5 mm), detector UV tại 340 nm<br />
và tốc độ dòng 0,8 ml/phút. Cả 2 chất đã được tách hoàn toàn trong thời gian 10 phút. Giới hạn<br />
định lượng của curcumin và piperin là 0,06 và 0,08 µg/ml. Diện tích pic và nồng độ các chất có<br />
mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan ~ 1. Phương pháp có độ chính xác cao,<br />
độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Tỷ lệ thu hồi cả 2 chất từ 93 - 100%. Phương pháp này được sử<br />
dụng để định lượng curcumin và piperin trong chế phẩm chứa curcumin và piperin.<br />
* Từ khóa: Curcumin; Piperin; HPLC; Định lượng.<br />
<br />
SIMULTANEOUS QUANTIFICATION OF CURCUMIN AND<br />
PIPERINE IN SUPPLEMENT BY HPLC<br />
SUMMARY<br />
A HPLC method for the simultaneous quantification of curcumin and piperine in supplements<br />
was validated. Using acetonitrile and buffer KH2PO4 50 mM (60/40, v/v) as the mobile phase,<br />
Gemini C18 (250 x 4.6 nm, 5 µm) column, UV detection at 340 nm and flow at 0.8 ml/min, curcumin<br />
and piperine were separated satisfactorily within 10 minutes. The quantitation limits of curcumin<br />
and piperine were 0.6 µg/ml and 0.8 µg/ml. The calibration curve of each analyte had a correlation<br />
coefficient close to 1. The precisions were all less than 2%. The recovery rates of extraction were<br />
93 - 100% for both curcumin and piperine.<br />
* Key words: Curcumin, Piperine, HPLC; Quantification.<br />
<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Curcumin là hoạt chất chính của Nghệ<br />
vàng (Curcuma longa L.) [1]. Curcumin có<br />
tác dụng sinh học ưu việt như: ức chế sự<br />
phát triển của khối u, tăng khả năng miễn<br />
dịch, chất chống oxy hóa mạnh, chữa một<br />
<br />
số bệnh tiêu hóa, gan mật, kháng khuẩn,<br />
chống viêm… Curcumin rất kém tan trong<br />
nước (độ tan 0,001%) và sinh khả dụng đạt<br />
2 - 3%. Các nghiên cứu cho thấy: piperin<br />
làm tăng sinh khả dụng của curcumin lên<br />
<br />
* Học viện Quân y<br />
** Trung tâm Kiểm nghiệm Dược - Mỹ phẩm Hà Nội<br />
Người phản hồi (Corresponding): Đào Văn Đôn (daovandon@gmail.com)<br />
Ngày nhận bài: 13/06/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/07/2014<br />
Ngày bài báo được đăng: 28/07/2014<br />
<br />
7<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br />
<br />
20 lần [2, 3]. Hiện nay, trên thị trường Việt<br />
Nam đã xuất hiện những sản phẩm kết hợp<br />
curcumin và piperin (tỷ lệ khoảng 100:1)<br />
nhưng vẫn chưa có phương pháp định<br />
lượng đồng thời 2 chất trên. Vì vậy, chúng<br />
tôi thực hiện nghiên cứu nhằm: Xây dựng<br />
quy trình định lượng đồng thời curcumin<br />
và piperin bằng phương pháp HPLC.<br />
NGUYÊN VẶT LIỆU VÀ<br />
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br />
1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên<br />
cứu.<br />
* Hóa chất, nguyên liệu:<br />
- Chất chuẩn: curcumin chuẩn (96,3%,<br />
Himedia Laboratories, Ấn Độ), piperin<br />
chuẩn (99,0%, Sigma- Aldrich).<br />
- Mẫu thử: chế phẩm chứa curcumin và<br />
piperin.<br />
- Methanol, acetonitril đạt tiêu chuẩn<br />
HPLC (Merck).<br />
- Dung môi, hóa chất khác: KH2PO4,<br />
H3PO4, nước cất… đạt tiêu chuẩn tinh khiết<br />
phân tích.<br />
* Thiết bị và dụng cụ phân tích:<br />
- Hệ thống HPLC Alliance Waters 2695D,<br />
4 kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có<br />
buồng gia nhiệt cột, detector PDA, cột sắc<br />
ký Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm).<br />
- Cân phân tích Sartorius độ chính xác<br />
± 0,1 mg, máy lắc siêu âm, máy đo pH,<br />
các dụng cụ thủy tinh, bình định mức,<br />
pipet có độ chính xác phù hợp.<br />
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
- Khảo sát quy trình định lượng.<br />
+ Xử lý mẫu: qua tham khảo tài liệu<br />
[5, 6], chúng tôi lựa chọn quy trình xử lý<br />
mẫu như sau:<br />
<br />
8<br />
<br />
Cân chính xác lượng bột tương đương<br />
với khoảng 50 mg curcumin, thêm khoảng<br />
40 ml MeOH, lắc đều. Chiết siêu âm trong<br />
20 phút. Để nguội, chuyển toàn bộ dịch<br />
chiết vào bình định mức 50 ml. Thêm<br />
MeOH vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc lấy<br />
dịch lọc. Lấy 1 ml dịch lọc đem bốc hơi ở<br />
nhiệt độ phòng tới cắn. Hòa tan cắn trong<br />
10 ml pha động. Lọc qua màng lọc 0,45 µl<br />
trước khi phân tích bằng HPLC.<br />
+ Điều kiện sắc ký [5, 6]:<br />
Cố định các điều kiện: cột Gemini C18<br />
(250 x 4,6 mm, 5 µm); detector PDA;<br />
thể tích bơm mẫu 50 µl; tốc độ dòng<br />
0,8 ml/phút. Khảo sát pha động với hệ dung<br />
môi MeOH:nước và đệm KH2PO4:ACN.<br />
- Thẩm định quy trình định lượng.<br />
Thẩm định quy trình định lượng theo<br />
hướng dẫn của Bộ Y tế [4] gồm các chỉ<br />
tiêu: tính tương thích của hệ thống sắc<br />
ký, độ chọn lọc - đặc hiệu, khoảng nồng<br />
độ tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn<br />
định lượng, độ chính xác, độ đúng.<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br />
BÀN LUẬN<br />
1. Khảo sát quy trình định lƣợng.<br />
Chúng tôi tiến hành xử lý mẫu và khảo<br />
sát điều kiện sắc ký và ghi sắc ký đồ.<br />
Phân tích kết quả và lựa chọn được điều<br />
kiện sắc ký HPLC để định lượng đồng thời<br />
curcumin và piperin như sau: cột sắc ký:<br />
cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm, 5 µm),<br />
detector PDA, ghi phổ ở 340 nm. Pha<br />
động: hỗn hợp dung môi acetonitril và<br />
dung dịch đệm KH2PO4 50 mM (điều chỉnh<br />
đến pH = 3,5 bằng axít phosphoric) tỷ lệ<br />
60:40 (v/v), tốc độ dòng 0,8 ml/phút, thể<br />
tích bơm mẫu 50 µl, thời gian phân tích:<br />
10 phút.<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br />
<br />
2. Thẩm định quy trình định lƣợng.<br />
- Tính tương thích hệ thống sắc ký:<br />
Tiến hành sắc ký 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp các chất curcumin và piperin<br />
đều có nồng độ 10 µg/ml theo điều kiện đã lựa chọn. Kết quả về thời gian lưu và diện<br />
tích pic được trình bày trong bảng 1.<br />
Bảng 1: Kết quả thẩm định tính thích hợp của hệ thống sắc ký.<br />
STT<br />
<br />
tR (phút)<br />
<br />
Spic(µV.s)<br />
<br />
tR (phút)<br />
<br />
Spic(µV.s)<br />
<br />
1<br />
<br />
8,155<br />
<br />
523508<br />
<br />
8,931<br />
<br />
1374756<br />
<br />
2<br />
<br />
8,156<br />
<br />
526881<br />
<br />
8.973<br />
<br />
1375616<br />
<br />
3<br />
<br />
8,149<br />
<br />
534524<br />
<br />
8,948<br />
<br />
1372662<br />
<br />
4<br />
<br />
8,154<br />
<br />
523406<br />
<br />
8,961<br />
<br />
1378233<br />
<br />
5<br />
<br />
8,144<br />
<br />
521094<br />
<br />
8,950<br />
<br />
1375421<br />
<br />
6<br />
<br />
8,143<br />
<br />
520245<br />
<br />
8,950<br />
<br />
1375634<br />
<br />
X<br />
<br />
8,150<br />
<br />
524943<br />
<br />
8,950<br />
<br />
1375387<br />
<br />
RSD (%)<br />
<br />
0,07<br />
<br />
0,99<br />
<br />
0,15<br />
<br />
0,13<br />
<br />
Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic của cả 2 chất đều < 2%,<br />
chứng tỏ hệ thống sắc ký có tính thích hợp cao, có thể ứng dụng để phân tích 2 chất<br />
trên trong các mẫu.<br />
- Độ chọn lọc - đặc hiệu:<br />
Tiến hành phân tích mẫu chuẩn hỗn hợp của curcumin, piperin đều có nồng độ 10 µg/ml,<br />
mẫu trắng và mẫu thử.<br />
<br />
(a)<br />
<br />
PI<br />
CUR<br />
<br />
(b)<br />
<br />
(c)<br />
CUR<br />
PI<br />
<br />
Hình 1: Sắc ký đồ của curcumin và<br />
piperin trong mẫu trắng (a), mẫu chuẩn (b) và mẫu thử (c).<br />
<br />
9<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br />
<br />
Trên sắc ký đồ mẫu trắng, tại vị trí tương ứng với thời gian lưu của curcumin và<br />
piperin không xuất hiện các pic như ở mẫu chuẩn. Các pic của chất phân tích trong<br />
mẫu thử tách hoàn toàn khỏi pic tạp. Như vậy, phương pháp có tính chọn lọc tốt và độ<br />
đặc hiệu cao.<br />
- Khoảng nồng độ tuyến tính:<br />
Pha một dãy dung dịch chuẩn curcumin có nồng độ khoảng 10 - 200 µg/ml, piperin<br />
có nồng độ khoảng 0,5 - 10 µg/ml và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã lựa chọn.<br />
Bảng 2: Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic của curcumin<br />
và piperin.<br />
(µg/ml)<br />
<br />
Diện tích pic (μV.s)<br />
<br />
610060<br />
<br />
3120758<br />
<br />
6203550<br />
<br />
Phương trình hồi quy: y = 59798 x + 976,88<br />
Piperin.<br />
<br />
9380402<br />
<br />
12407214<br />
<br />
R² = 0,9999<br />
<br />
Nồng độ (µg/ml)<br />
<br />
0,52<br />
<br />
1,04<br />
<br />
2,08<br />
<br />
5,2<br />
<br />
10,4<br />
<br />
Diện tích pic (μV.s)<br />
<br />
29006<br />
<br />
52082<br />
<br />
96523<br />
<br />
219847<br />
<br />
452053<br />
<br />
Phương trình hồi quy: y = 42572 x + 6084,1; R² = 0,9994<br />
<br />
Hình 2: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của curcumin.<br />
<br />
Hình 3: Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích pic và nồng độ của piperin.<br />
Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ piperin<br />
và curcumin trong khoảng khảo sát với hệ số tương quan R2 ~ 1.<br />
- Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dưới:<br />
Dựa vào độ nhiễu đường nền của mẫu trắng và đường chuẩn để ngoại suy giới hạn<br />
phát hiện và giới hạn định lượng của curcumin và piperin. Tiến hành pha thử 4 - 5<br />
nồng độ quanh điểm dự kiến. Kết quả cho thấy: giới hạn phát hiện của curcumin là<br />
0,01 µg/ml và piperin là 0,02 µg/ml; giới hạn định lượng dưới của curcumin là 0,04 µg/ml<br />
và piperin là 0,08 µg/ml.<br />
<br />
10<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2014<br />
<br />
- Độ chính xác:<br />
Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB và nghiền thành bột mịn.<br />
Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin (tiến hành lặp lại<br />
6 lần). Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký, kết quả được thể hiện trong bảng 3.<br />
Bảng 3: Kết quả xác định độ chính xác của phương pháp HPLC.<br />
<br />
(mg)<br />
<br />
DiÖn tÝch pic<br />
(μV.s)<br />
<br />
Hµm l-îng t×m thÊy<br />
(mg/viên)<br />
<br />
DiÖn tÝch pic (μV.s)<br />
<br />
Hµm l-îng t×m thÊy<br />
(mg/viên)<br />
<br />
1<br />
<br />
125,6<br />
<br />
5205871<br />
<br />
171,86<br />
<br />
23014<br />
<br />
1,34<br />
<br />
2<br />
<br />
124,8<br />
<br />
5058579<br />
<br />
168,94<br />
<br />
22635<br />
<br />
1,31<br />
<br />
3<br />
<br />
125,6<br />
<br />
5247484<br />
<br />
175,25<br />
<br />
22887<br />
<br />
1,33<br />
<br />
4<br />
<br />
124,9<br />
<br />
4996609<br />
<br />
166,87<br />
<br />
22761<br />
<br />
1,32<br />
<br />
5<br />
<br />
125,1<br />
<br />
5064267<br />
<br />
169,13<br />
<br />
221295<br />
<br />
1,27<br />
<br />
X<br />
<br />
169,89<br />
<br />
RSD (%)<br />
<br />
1,85<br />
<br />
1,31<br />
1,89<br />
<br />
Độ lệch chuẩn tương đối đều < 2%, chứng tỏ phương pháp có độ chính xác tốt,<br />
đáp ứng yêu cầu phân tích.<br />
- Độ đúng:<br />
Cân 20 viên của mẫu 1, tính khối lượng trung bình mTB, và nghiền thành bột mịn.<br />
Cân chính xác lượng bột tương đương chứa khoảng 50 mg curcumin với 6 lần cân<br />
khác nhau. Thêm 100 µl dung dịch chất chuẩn piperin có nồng độ 1.000 µg/ml, và 10 mg<br />
chuẩn curcumin, trộn đều, để khô tự nhiên. Xử lý mẫu và tiến hành sắc ký.<br />
Bảng 4: Kết quả xác định độ đúng của phương pháp HPLC.<br />
C h Ê t<br />
<br />
Curcumin<br />
<br />
pepirin<br />
<br />
STT<br />
<br />
l - î n g<br />
<br />
1<br />
<br />
10<br />
<br />
2<br />
3<br />
4<br />
<br />
mg)<br />
<br />
L - î n g<br />
<br />
(mg)<br />
<br />
T û<br />
<br />
9,58<br />
<br />
95,8<br />
<br />
10,1<br />
<br />
9,41<br />
<br />
93,2<br />
<br />
10,2<br />
<br />
10,12<br />
<br />
99,2<br />
<br />
10<br />
<br />
9,67<br />
<br />
96,7<br />
<br />
5<br />
<br />
9,9<br />
<br />
9,42<br />
<br />
95,2<br />
<br />
6<br />
<br />
10,3<br />
<br />
10,12<br />
<br />
98,3<br />
<br />
1<br />
<br />
0,1<br />
<br />
0,097<br />
<br />
97<br />
<br />
2<br />
<br />
0,1<br />
<br />
0,095<br />
<br />
95<br />
<br />
3<br />
<br />
0,1<br />
<br />
0,093<br />
<br />
93<br />
<br />
4<br />
<br />
0,1<br />
<br />
0,094<br />
<br />
94<br />
<br />
5<br />
<br />
0,1<br />
<br />
0,097<br />
<br />
97<br />
<br />
6<br />
<br />
0,1<br />
<br />
0,095<br />
<br />
95<br />
<br />
(%)<br />
<br />
X = 96,41<br />
SD = 2,1<br />
RSD = 2,2%<br />
<br />
X = 95<br />
SD = 1,6<br />
RSD = 1,7%<br />
<br />
Tỷ lệ thu hồi của curcumin và piperin từ 93 - 99% nằm trong giới hạn cho phép<br />
(92% - 100%) với giá trị RSD < 3%, chứng tỏ phương pháp có độ đúng cao.<br />
<br />
11<br />
<br />