intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Phân lập và xây dựng quy trình định lượng đồng thời emodin và physcion trong rễ cốt khí (Radixpolygoni cuspidati)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST
Báo xấu
7
lượt xem 1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

bài viết trình bày việc phân lập và xây dựng quy trình định lượng đồng thời emodin và physcion trong rễ cốt khí (Radixpolygoni cuspidati). Đối tượng – phương pháp nghiên cứu: Đối tượng là emodin, physcion và dược liệu Cốt khí. Nghiên cứu phân lập emodin và physcion từ cao cồn và xây dựng, thẩm định quy trình định lượng đồng thời emodin và physcion trong Cốt khí bằng phương pháp sắc ký lỏng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập và xây dựng quy trình định lượng đồng thời emodin và physcion trong rễ cốt khí (Radixpolygoni cuspidati)

  1. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 PHÂN LẬP VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI EMODIN VÀ PHYSCION TRONG RỄ CỐT KHÍ (RADIX POLYGONI CUSPIDATI) Nguyễn Hoàng Duy*, Nguyễn Hữu Lạc Thủy** TÓMTẮT Mở đầu: Rễ củ sấy khô của cây Cốt khí (Polygonum cusidatum Sieb. Et Zucc.), họ Rau răm (Polygonaceae) đã có chuyên luận ở DĐVN V. Cao chiết từ dược liệu này đã được chứng minh có khả năng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan. Emodin và physcion là hai trong số các hợp chất anthraquinon của Cốt khí đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học. Tuy nhiên, chuyên luận Cốt khí (rễ) DĐVN V chưa qui định chỉ tiêu và phương pháp xác định hàm lượng hoạt chất trong dược liệu này. Vì vậy, để góp phần kiểm soát chất lượng cho Cốt khí, chúng tôi đã nghiên cứu phân lập emodin, physcion với độ tinh khiết trên 98% và sử dụng hai anthraquinon này để làm chất đối chiếu nội bộ trong việc xây dựng quy trình định lượng đồng thời emodin và physcion của dược liệu Cốt khí bằng phương pháp sắc ký lỏng. Quy trình được thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu theo hướng dẫn của ICH và được ứng dụng để khảo sát một số mẫu dược liệu thu thập trên thị trường. Đối tượng – phương pháp nghiên cứu: Đối tượng là emodin, physcion và dược liệu Cốt khí. Nghiên cứu phân lập emodin và physcion từ cao cồn và xây dựng, thẩm định quy trình định lượng đồng thời emodin và physcion trong Cốt khí bằng phương pháp sắc ký lỏng. Kết quả: Từ 0,5 kg dược liệu, phân lập được emodin 435 mg và physcion 35,6 mg. Độ tinh khiết sắc ký lần lượt là 99,02% và 99,69%. Xây dựng và thẩm định quy trình định lượng đồng thời emodin và physcion trong Cốt khí bằng phương pháp sắc ký lỏng với các điều kiện: cột sắc ký C18 (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động: methanol – acid phosphoric 0,1% (85:15), tốc độ dòng 1 ml/phút, bước sóng phát hiện 254 nm. Quy trình được thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống; độ đặc hiệu; độ chính xác và độ đúng. Khoảng tuyến tính của emodin từ 10 – 100 (ppm) (ŷ = 100842,7X; R2 = 0,9999); physcion từ 4,0 – 40 ppm (y=102177,7X; R2 = 0,9990). Kết luận: Quy trình phân lập emodin và physcion từ cao cồn cho kết quả phân lập ổn định; quy trình định lượng đồng thời emodin và physcion bằng phương pháp sắc ký lỏng đạt các yêu cầu thẩm định, đây là các cơ sở khoa học góp phần cho công tác thiết lập chất đối chiếu từ dược liệu và xây dựng tiêu chuẩn kiểm nghiệm cho Cốt khí và các sản phẩm từ Cốt khí. Từ khóa: Cốt khí, emodin, physcion, Polygonum cuspidatum, sắc ký lỏng ABSTRACT ISOLATION AND SIMULTANEOUS QUANTITATIVE DETERMINATION OF EMODIN AND PHYSCION FROM RADIX POLYGONI CUSPIDATI BY HPLC METHOD Nguyen Hoang Duy, Nguyen Huu Lac Thuy * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 2 - 2020: 82 - 90 Background: Radix Polygoni cuspidate has already its monograph in Vietnamese pharmacopoeia 5th edition. Antioxidant and hepatoprotective effects have been proven. Emodin and physcion are two of anthraquinone compounds in this herb which have shown many therapeutic activities. However, the monograph of this medicinal *Trung tâm Kiểm nghiệm Vĩnh Long ** Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Hữu Lạc Thủy ĐT: 0915517890 Email: nguyenhuulacthuy@ump.edu.vn 82 B – Khoa học Dược
  2. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu herb has not specified criteria and methods to determine content of active ingredients like emodin and physcion. Therefore, in order to contribute to control quality of this medicinal herb, emodin and physcion are isolated with purity of over 98% and are used as working standards in simultaneous quantitative determination of these two substances in medicinal materials by high performance liquid chromatography. The procedure is fully validated according to ICH guidelines and then applied to survey a number of samples collected on market. Objectives: The main objective of this study was to isolate pure emodin and physcion as reference materials for the development of simultaneous quantitative determination of emodin and physcion from radix Polygoni cuspidate by HPLC method. Methods: Isolate emodin and physcion from ethanol fraction. Finding out chromatographic conditions for suitable HPLC parameters. The HPLC method was validated according to the ICH guidelines. Results: Emodin (435 mg) and physcion (35.6 mg) were isolated from 0.5 kg power of radix with their impurity by HPLC is 99.02% and 99.69%, respectively. Suitable chromatographic conditions for separation and simultaneous quantitication of emodin and physcion from radix Polygoni cuspidate were developed: column Phenomenex Luna C18 (250 x 4.6 mm; 5 μm); mobile phase is a mixture of methanol - 0.1% phosphoric acid (85:15), flow rate 1 mL/min; wavelength of detection at 254 nm. This procedure was validated for system suitability; selectivity, accuracy and precison. Linear correlations are from the range of 10 – 100 (ppm) (ŷ = 100842.7x; R2 = 0.9999) for emodin and 4,0 – 40 ppm (ŷ = 102177.7x; R2 = 0.9990) for physcion. Conclusions: The isolation process of emodin and physcion from ethanol fraction is stable. Simultaneous quantitative determination of emodin and physcion by HPLC was successfully developed and validated. These are the scientific basis contributing to the establishment of reference materials from medicinal herbs and the development the quality control of radix Polygoni cuspidate as well as products from this material. Keywords: Emodin, physcion, Polygonum cuspidatum and HPLC ĐẶTVẤNĐỀ chất đối chiếu phòng thí nghiệm (working standard) trong nghiên cứu xây dựng quy Rễ củ sấy khô radix Polygoni cuspidati của cây trình định lượng đồng thời emodin và Cốt khí (Polygonum cusidatum Sieb. Et Zucc.), họ physcion trong Cốt khí bằng phương pháp Rau răm (Polygonaceae) đã có chuyên luận ở sắc ký lỏng. Quy trình được thẩm định đầy DĐVN V. Cao chiết từ dược liệu Cốt khí đã đủ các chỉ tiêu theo hướng dẫn của ICH và được nhóm nghiên cứu chứng minh có khả được ứng dụng khảo sát một số mẫu Cốt khí năng chống oxy hóa, bảo vệ tế bào gan(1). thu thập trên thị trường. Emodin và physcion là 2 trong số các anthraquinon của Cốt khí, đã được chứng ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU minh có tác dụng sinh học về tính kháng viêm, Đối tượng nghiên cứu kháng ung thư, kháng virus (2-4). Emodin, physcion, nguyên liệu rễ Cốt khí. Tuy nhiên, ngoài các chỉ tiêu cơ bản của Nguyên vật liệu chuyên luận về dược liệu, DĐVN V chưa qui Nguyên liệu Cốt khí (rễ) được thu mua tại định chỉ tiêu và phương pháp xác định hàm trại dược liệu Minh Tâm (An Giang) và một số lượng hoạt chất cho dược liệu này. Vì vậy, để cơ sở buôn bán dược liệu trên địa bàn quận 5, phát triển phương pháp định lượng và góp TP. Hồ Chí Minh. phần trong công tác kiểm soát chất lượng dược liệu Cốt khí, chúng tôi đã nghiên cứu Nguyên liệu được đánh giá chất lượng phân lập emodin, physcion với độ tinh khiết theo cướng dẫn của DĐVN V, chuyên luận trên 98% và sử dụng 2 anthraquinon này làm Cốt khí Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc B – Khoa học Dược 83
  3. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Polygonaceae, được xay thành bột (cỡ rây Khảo sát các điều kiện để tách và định lượng 1400) dành cho chiết xuất và bảo quản trong lọ đồng thời emodin và physcion bằng sắc ký lỏng thủy tinh chống ẩm. Độ ẩm: 8,3%. Thực hiện các thử nghiệm khảo sát sự tách Chất đối chiếu trên cột (C8 và C18), pha động (methanol, Emodin và physcion độ tinh khiết sắc ký acetonitril, điều chỉnh pH bằng acid formic, lần lượt 99,02 và 99,69 (%) do nhóm nghiên acetic và phosphoric), lựa chọn các điều kiện cứu phân lập, chứng minh cấu trúc và xác sắc ký đạt tính phù hợp hệ thống và có thông định độ tinh khiết sắc ký. số đạt yêu cầu, đặc biệt là độ phân giải giữa pic cần phân tích với các pic lân cận. Thiết bị chính Hệ thống Hitachi – Chromaster, đầu dò Khảo sát tính phù hợp hệ thống PDA 5430, cột C18 Purospher® STAR Tiêm lặp lại 6 lần mẫu đối chiếu và mẫu thử, endcapped (250 × 4,6 mm; 5 μm); cân phân quy trình đạt yêu cầu khi RSD% của thời gian lưu, tích Mettler toledo XS 205 (d 0,01 mg), hệ diện tích pic ≤ 2%, hệ số bất đối (0,8 ≤ T ≤1,5), hệ số thống DSC Q20 TA (đo tại Viện Kiểm nghiệm phân giải Rs ≥1,2; số đĩa lý thuyết >2000. TP. Hồ Chí Minh), hệ thống NMR Bruker 500 MHz (đo tại Viện Hóa học Hà Nội). Thẩm định quy trình Độ đặc hiệu được thực hiện trên mẫu Dung môi - hóa chất trắng, mẫu đối chiếu, mẫu thử và mẫu thử Dùng cho phân tích sắc ký gồm acid thêm chất đối chiếu. Khoảng tuyến tính được phosphoric (PA), acetonitril và methanol dùng khảo sát trên 6 dung dịch emodin và physcion cho sắc ký lỏng (Merck); dùng cho chiết xuất – nồng độ tăng dần; xác định sự tương quan phân lập: n-hexan, cloroform, ethyl acetat, giữa tín hiệu diện tích pic và nồng độ dung ethanol và methanol đạt tiêu chuẩn phân tích dịch qua hệ số (R² > 0,995). Độ chính xác: thực (Chemsol), bản mỏng silica gel F254 và silica gel hiện trên ít nhất 12 mẫu thử riêng biệt (độ lặp 40 – 63 (μm) dùng cho sắc ký cột (Merck). lại và độ chính xác trung gian); xử lý thống kê Phương pháp nghiên cứu kết quả định lượng với yêu cầu độ lặp lại Phân lập emdodin và physcion của hàm lượng emodin và physcion phải có Chiết cao cồn toàn phần từ 0,5 kg bột RSD% ≤ 2%. Độ đúng được đánh giá qua thử dược liệu được nạp vào bình chiết và chiết nghiệm thử thêm chuẩn, thực hiện trên ít nhất bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với dung 9 mẫu thử riêng biệt tại 3 nồng độ trong môi cồn 96%. Dịch chiết được thu hồi dung khoảng tuyến tính đã xác định, tỷ lệ phục hồi môi đến khi thu được cao toàn phần, cao trong khoảng 95 – 102% (n = 9; RSD ≤ 2%). chiết này là mẫu thử cho thử nghiệm phân KẾTQUẢ lập chất tinh khiết. Việc phân lập được tiến Phân lập emodin và physcion hành bằng phương pháp kết tinh trong dung môi hoặc phương pháp sắc ký cột tùy Từ 0,5 kg nguyên liệu, chiết được 87,5 g cao vào tính chất của mẫu. chiết cồn toàn phần. Trong quá trình thu hồi dung môi, hỗn hợp dạng kết tủa xuất hiện. Tách Các hợp chất sau khi phân lập được đánh giá riêng phần cao đặc và phần kết tủa A. Chọn kết tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng, tủa A cho thử nghiệm phân lập tiếp theo. DSC và sắc ký lỏng. Xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ nghiệm (UV, IR, MS và NMR) Phân tán phần tủa A với lượng vừa đủ và so sánh dữ liệu với tài liệu tham khảo, định methanol, siêu âm khoảng 30 phút. Lọc để riêng hướng phân lập emodin và physcion. phần tủa A-1 (khối lượng 6,75 g); phần dịch lọc 84 B – Khoa học Dược
  4. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu được thu hồi dung môi đến cao phân đoạn A-2. acid formic (5:5:0,1) và hệ toluen – diethyl ether – Kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng, thành phần ethanol (7:2,5:0,5). Hệ số Rf của mẫu CK-1 tương kết tủa A-1 và cao A-2 tương tự nhau, gồm 2 vết ứng 0,18; 0,57 và 0,75. Hệ số Rf của mẫu CK-2 chính (Rf1 0,50 và Rf2 0,80). Tuy nhiên vết Rf1 0,50 tương ứng 0,48; 0,67 và 0,83 của vết CK-2. của kết tủa A-1 có hàm lượng lớn so với vết này Độ tinh khiết xác định bằng DSC: cân bằng trong cao A-2. Dự kiến phân lập vết Rf1 0,50 từ tại 40oC, gia nhiệt 10oC/phút đến 350oC; hàm kết tủa A-1 bằng phương pháp kết tinh lại trong lượng CK-1 là 99,82% và CK-2 là 99,94%. dung môi và vết Rf1 0,80 từ cao phân đoạn A-2 Trên sắc ký đồ sắc ký lỏng, pic CK-1 và CK-2 bằng phương pháp sắc ký cột. tinh khiết tại thời gian lưu và có độ tinh khiết sắc Kết tủa A-1 được hòa tan trong n-hexan, ký tương ứng CK-1 là 99,02% và CK-2 là 99,69% loại bỏ phần dịch n-hexan. Thực hiện nhiều tính trên tổng phần trăm diện tích pic trên sắc ký lần, lấy phần kết tủa hòa tan và kết tinh lại đồ tại bước sóng 254 nm. Các điều kiện sắc ký: trong ethyl acetat. Kết tinh có hình kim, màu cột C18 (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động là hỗn hợp cam, được đặt tên CK-1. Lọc kết tinh bằng methanol – acid phosphoric 0,1% (85:15), tốc độ phễu thủy tinh xốp, rửa sản phẩm bằng dòng 1 ml/phút. methanol lạnh. Khối lượng kết tinh CK-1 thu Xác định các đặc tính và cấu trúc của CK-1 và được sau quá trình tinh chế là 435 mg. CK-2 Cao phân đoạn A-2 được dùng làm mẫu thử Tính chất để phân lập hợp chất tinh khiết còn lại bằng Các kết tinh thu được dạng tinh thể hình phương pháp sắc ký cột. Pha tĩnh là silica gel 40 kim, có màu vàng (CK-2) đến cam (CK-1). Các – 63 (μm), rửa giải bằng dung môi n-hexan – tinh thể này tan trong cloroform, ethyl acetat, ethyl acetat, điều chỉnh tăng dần độ phân cực methanol và dung dịch kiềm, không tan trong bằng dung môi ethyl acetat đến tỷ lệ (85:15). Các nước. Phản ứng dương tính với thuốc thử phân đoạn được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng. Borntranger. Phân đoạn A2-2 tương ứng với tỷ lệ n-hexan – ethyl acetat (90:10) và A2-3 tương ứng với tỷ lệ Dữ liệu phổ nghiệm của CK-1 (85:15) có 1 vết trên sắc ký đồ. Gộp các phân Phổ UV–Vis (methanol; nm): 224; 254; 264; đoạn này, để dung môi bay hơi chậm đến khi 284 và 1 cực đại 440 vùng Vis. Phổ IR (KBr; xuất hiện kết tinh, tiếp tục giữ không cho bay hơi cm1): 3480; 3056; 2924; 2854; 1673; 1622; 1563; dung môi đến khi kết tinh được hoàn toàn. Kết 1477; 1225 và 766. Phổ MS/APCI(-): m/z 269,28 tinh dạng tinh thể hinh kim tương tự CK-1 [M-H]-, dự đoán CK-1 có M 270,28; phù hợp nhưng khác CK-1, kết tinh này có màu vàng. với công thức phân tử C15H10O5. Được đặt tên CK-2. Lọc kết tinh bằng phễu thủy tinh xốp, rửa sản phẩm bằng methanol lạnh. Phổ 1H-NMR, δ (500 MHz, DMSO, ppm): Khối lượng kết tinh thu được sau quá trình tinh 12,05 (1H, s, 8-OH); 11,98 (1H, s, 1-OH); 7,45 chế là 35,6 mg. (1H, d, 1H-4); 7,13 (1H, s, H-5); 7,09 (1H, d, H- 2); 6,57 (1H, d, H-7); 2,40 (3H, s, 3-CH3). Kiểm tra độ tinh khiết của CK-1 và CK-2 Sắc ký đồ sắc ký lớp mỏng, mẫu thử CK-1 và Phổ 13C-NMR, δ (125 MHz, DMSO, ppm): CK-2 hòa tan trong methanol đều cho 1 vết dưới 189,6 (C-9); 181,3 (C-10); 165,6 (C-6); 164,4 ánh sáng thường, thuốc thử kalihydroxyd 5%, (C-1); 161,4 (C-8); 148,2 (C-3); 135,0 (C-10a); đèn tử ngoại bước sóng 254 và 365 (nm). Các hệ 132,7 (C-4a); 124,1 (C-4); 120,4 (C-2); 113,3 dung môi gồm hệ n-hexan – ethyl acetat – acid (C-9a); 108,8 (C-5); 108,9 (C-8a); 107,9 (C-7); formic (8:2:0,1); hệ ether dầu hỏa – ethyl acetat – 21,5 (3-CH3). B – Khoa học Dược 85
  5. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Dữ liệu phổ nghiệm của CK-2 Phổ 13C-NMR, δ (125 MHz, CDCl3, ppm): Phổ UV–Vis (methanol; nm): 224; 254; 190,8 (C-9); 182,0 (C-10); 166,6 (C-3); 165,2 (C-1); 264; 287 và 1 cực đại 434 vùng Vis. Phổ IR 162,5 (C-8); 148,5 (C-3); 135,3 (C-10a); 133,2 (C- (KBr; cm-1): 3446, 3056; 2923; 2851; 1676; 1630; 4a); 124,5 (C-4); 121,3 (C-2); 113,7 (C-9a); 110,3 (C- 1562; 1478; 1034 và 757. Phổ MS/APCI(+): m/z 5); 108,2 (C-8a); 106,8 (C-7); 56,1 (6-OCH3); 22,1 285,27 [M+H]+, dự đoán CK-2 có M 284,27; phù (3-CH3). hợp với công thức phân tử C16H12O5. Dữ liệu phổ NMR của CK-1 và CK-2 phù Phổ 1H-NMR, δ (500 MHz, CDCl3, ppm): hợp với dữ liệu phổ của emodin và physcion khi 12,30 (1H, s, 8-OH); 12,10 (1H, s, 1-OH), 7,62 đối chiếu với các tài liệu(4-7). (1H, d, H-4); 7,36 (1H, d, H-5); 7,08 (1H, d, H-2); Như vậy, nhận định CK-1 là emodin và 6,68 (1H, d, H-7); 3,94 (3H, s, 6-OCH3); 2,45 CK-2 là physcion. (3H, s, 3-CH3). Hình 1. Cấu trúc hóa học của physcion (trái) và emodin (phải) Kết quả thẩm định quy trình methanol với nồng độ tương ứng 50 và 18 (μg/ml). Kết quả đánh giá tính phù hợp hệ Tính phù hợp hệ thống thống được trình bày ở Bảng 1 minh chứng Được thực hiện trên mẫu hỗn hợp đối quy trình đạt tính phù hợp hệ thống. chiếu emodin và physcion, được hòa tan trong Bảng 1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống (n = 6) Pic tR (phút) S (μV x giây) Rs As N Emodin 8,4 (RSD 0,90%) 5099378 (RSD 1,72%) 9,2 20,3 1,2 11194 Physcion 17,5 (RSD 1,22%) 1797257 (RSD 1,69%) 20,3 - 1,1 14950 Pic tR (phút) S (μV x giây) Rs As N Pic Độ đặc hiệu R2 = 0,9999; đối với physcion từ 4,0 – 40,0 ppm (y = 102063,7X; R2 = 0,9990) (Hình 3). Kết quả khảo sát tính đặc hiệu sắc ký đồ mẫu trắng không có tín hiệu pic tại thời gian lưu của Độ chính xác pic emodin (8,5 phút) và physcion (17,8 phút) Thực hiện trên 12 mẫu thử. trong mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ mẫu thử có 2 tín Bảng 2. Kết quả khảo sát độ lặp lại (n = 6) hiệu pic tương ứng với sắc ký đồ mẫu đối chiếu. Mẫu Diện tích pic (µV x giây) Hàm lượng (%) Sắc ký đồ mẫu thử thêm chất đối chiếu có tín Emodin Physcion Emodin Physcion hiệu diện tích của 2 pic emodin và physcion tăng 1 3573954 1261265 0,763 0,289 lên so với mẫu thử. Kết luận: quy trình đạt yêu 2 3589882 1270472 0,766 0,291 cầu về độ đặc hiệu (Hình 2). 3 3582312 1271526 0,764 0,291 4 3631768 1292704 0,775 0,296 Khoảng tuyến tính 5 3589088 1270657 0,766 0,291 Kết quả xử lý thống kê cho thấy tín hiệu 6 3647541 1293157 0,779 0,297 diện tích pic của emodin tương quan với nồng Trung bình 0,769 0,293 độ khảo sát từ 10,0 – 100,0 (ppm) với phương RSD% 0,85 1,05 trình hồi qui ŷ = 100861,7X; hệ số tương quan Kết quả khảo sát cho thấy hàm lượng của 86 B – Khoa học Dược
  6. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu emodin 0,763% (RSD 1,42%) và phsycion 3 3592933 1276955 0,767 0,293 0,291% (RSD 1,62%), tính trên nguyên liệu khô 4 3584739 1273396 0,765 0,292 5 3516025 1252903 0,750 0,287 (Bảng 2 và Bảng 3). 6 3620457 1292119 0,772 0,296 Bảng 3. Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian (n=6) Trung bình 0,759 0,290 1 3515030 1243204 0,750 0,285 RSD% 1,42 1,62 2 3503601 1242988 0,747 0,285 A. Sắc ký đồ mẫu trắng B. Sắc ký đồ mẫu đối chiếu C. Sắc ký đồ mẫu thử D. Sắc ký đồ mẫu thử thêm chất đối chiếu Hình 2. Sắc ký đồ chứng minh độ đặc hiệu của quy trình định lượng đồng thời emodin và physcion trong Cốt khí trên cột C18, pha động methanol – acid phosphoric 0,1% (85:15), tốc độ dòng 1 mL/p, bước sóng phát hiện 254 nm Hình 3. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ các chất phân tích B – Khoa học Dược 87
  7. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Độ đúng (n = 9) 102,5% (RSD 0,90%) (Bảng 4). Theo phương pháp thử thêm chuẩn ở các Kết quả thẩm định cho thấy quy trình định tỷ lệ khoảng 80; 100 và 120 (%) nồng độ chuẩn lượng đồng thời emodin và physcion trong so với nồng độ thử. Mỗi nồng độ thực hiện dược liệu Cốt khí đạt các yêu cầu của một quy trên 3 mẫu độc lập, tỷ lệ phục hồi của pic trình phân tích định lượng. emodin 98,7% (RSD 1,26%); pic physcion Bảng 4. Kết quả khảo sát tỷ lệ phục hồi của pic emodin và physcion (n = 9) Lượng dược liệu Lượng đối chiếu thêm Diện tích pic Lượng chất đối chiếu % so với thử % thu hồi (mg) vào (mg) (µV x giây) tìm lại (mg) Emodin Trung bình (n = 9) 100,5 RSD (n = 9) 1,6 250,4 1,24 5938545 1,257 101,4 80 252,1 1,24 5992002 1,272 102,6 250,5 1,24 5907276 1,241 100,1 248,5 1,55 6494522 1,551 100,1 100 249,3 1,55 6499816 1,548 99,9 250,0 1,55 6425388 1,505 97,1 249,6 1,86 7191702 1,896 101,9 120 251,9 1,86 7189761 1,876 100,9 252,2 1,86 7185371 1,874 100,8 Physcion Trung bình (n = 9) 101,4 RSD (n = 9) 1,5 250,4 0,48 2149705 0,490 102,1 80 252,1 0,48 2154478 0,487 101,5 250,5 0,48 2155461 0,493 102,7 248,5 0,60 2330796 0,592 98,7 100 249,3 0,60 2350777 0,601 100,2 250,0 0,60 2351591 0,599 99,8 249,6 0,72 2613088 0,741 102,9 120 251,9 0,72 2625982 0,741 102,9 252,2 0,72 2611929 0,733 101,8 Quy trình hoàn chỉnh Điều kiện sắc ký Dung dịch đối chiếu Cột C18 (250 x 4,6 mm; 5μm), pha động gồm Cân chính xác 10 mg emodin và 4 mg methanol – acid phosphoric 0,1% (85:15), tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 10 μl, phát hiện tại physcion cho vào bình định mức 10 ml, hòa bước sóng 254 nm. tan và điền đầy bằng methanol. Pha loãng Hàm lượng % emodin hoặc physcion trong để được hỗn hợp dung dịch đối chiếu có dược liệu được tính theo công thức: nồng độ emodin và physcion lần lượt khoảng 35 và 14 (μg/mL). Dung dịch thử Trong đó: Cân 250 mg dược liệu cho vào bình định mức 50 ml, thêm 40 ml methanol, siêu âm trong X: hàm lượng % emodin hoặc physcion trong dược liệu. 15 phút, bổ sung đến vạch với cùng dung môi. Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 μm thu được ST: diện tích pic emodin/physcion/mẫu thử dung dịch mẫu thử. SC: diện tích pic emodin/physcion đối chiếu. 88 B – Khoa học Dược
  8. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu CC: nồng độ chất đối chiếu (mg/ml) m chiết từ dược liệu nhưng tín hiệu của các pic (mg): khối lượng cân dược liệu (mg). cần phân tích hoàn toàn phù hợp với cả cột a: độ ẩm của dược liệu (%) C8 và C18; pha động có thể phối hợp hoặc acetonitril hoặc methanol vì sắc ký đồ không Quy trình được ứng dụng khảo sát hàm có sự khác biệt đáng kể. Tuy nhiên, cần điều lượng emodin và physcion trong 05 mẫu dược chỉnh pH về pH acid mới cải thiện thông số liệu Cốt khí thu thập trên thị trường (Bảng 5). bất đối (As) đặc biêt với pic physcion. Điều Bảng 5. Kết quả khảo sát hàm lượng emodin và này cũng phù hợp vì cả 2 hợp chất này đều physcion trên 5 mẫu thu thập kém phân cực, cần ion hóa hoàn toàn với tác Hàm lượng (%) Mẫu Độ ẩm (%) nhân là acid phosphoric, tính acid mạnh hơn Emodin Physcion 1 8,27 0,78 0,31 acid formic và acetic. Các thử nghiệm cũng đã 2 7,48 0,99 0,19 so sánh ảnh hưởng của acid phosphoric, 3 6,93 0,88 0,16 formic và acetic. 4 8,54 0,64 0,16 Hàm lượng emodin trong các mẫu khảo sát 5 9,43 0,77 0,28 dao động từ 0,64 - 0,99 (%); physcion từ 0,16 - 0,31 BÀNLUẬN (%). Các kết quả này đáng quan tâm khi hàm Phân lập CK-1 bằng phương pháp kết tủa lượng emodin trong Cốt khí (rễ) Việt nam cao và kết tinh lại trong dung môi phù hợp với độ hơn so với yêu cầu chuyên luận Cốt khí của tan của emodin, công trình này cung cấp một Dược điển Trung Quốc (emodin > 0,6%). quy trình có thể được thực hiện tại tất cả các KẾTLUẬN phòng thí nghiệm hóa hợp chất tự nhiên. Các Công trình này đã nghiên cứu và đề nghị bước thực hiện đơn giản, dung môi thông quy trình phân lập emodin và physcion từ cao dụng và quan trọng là rút ngắn thời gian so cồn toàn phần Cốt khí đạt yêu cầu về thực với các công trình đã công bố. Hợp chất tiễn, hiệu quả khoa học cao. Các chất phân lập emodin được phân lập trực tiếp từ cao cồn mà được đạt yêu cầu chất đối chiếu với độ tinh không phải qua bước tách phân đoạn và sắc khiết > 99% và đã xác định đầy đủ các đặc tính ký cột như tài liệu(2), đây là điểm nổi bật của cùng với dữ liệu phổ của đối tượng nghiên nghiên cứu này. cứu. Trong các nghiên cứu sắp tới, chúng tôi Việc phân lập CK-2 vẫn phải thực hiện tiến hành các thủ tục để thiết lập emodin và bằng kỹ thuật sắc ký cột cổ điển vì hàm physcion như chất đối chiếu. lượng chất này thấp, tuy nhiên nếu mẫu ban Bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng đầu (kết tủa A) đã được tách CK-1, cùng với cao với đầu dò PDA, chúng tôi đã xây dựng và sự khác biệt lớn về độ phân cực của 2 hợp thẩm định đạt yêu cầu quy trình định lượng chất này và việc điều chỉnh dung môi rửa đồng thời emodin và physcion trong dược liệu giải khéo léo là 3 yếu tố giúp cho việc phân lập Cốt khí. Quy trình sử dụng các trang thiết bị, CK-2 thành công hơn các công trình trước đây. dung môi, hóa chất thông dụng và các bước xử Các sản phẩm phân lập được có độ tinh khiết lý mẫu đơn giản nên có thể được ứng dụng vào sắc ký > 99%, dữ liệu phổ học và đặc tính của thực tế công tác kiểm nghiệm dược liệu Cốt khí CK-1 và CK-2 hoàn toàn phù hợp với cấu trúc và các sản phẩm từ dược liệu này. của emodin và physcion. TÀILIỆUTHAMKHẢO Quy trình định lượng đồng thời emodin và 1. Huỳnh Thị Như Thuý, Võ Thị Bạch Huệ, Nguyễn Hữu Lạc Thuỷ (2018). Sàng lọc và xây dựng quy trình định lượng physcion bằng phương pháp sắc ký lỏng, các polyphenol từ một số dược liệu hướng tác dụng chống oxy bước khảo sát cho thấy dù mẫu thử là dịch hoá, bảo vệ gan. Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 22(S1):221-228. B – Khoa học Dược 89
  9. Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 2. Su HY, Cherng SH, Chen CC, et al (1995). Emodin inhibits the 6. Meselhy R (2003). Constituents from Moghat, the Roots of mutagenicity and DNA adducts induced by 1-nitropyrene. Glossostemon bruguieri (Desf.). Molecules, 8:614-621. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of 7. Chu X, Sun A, Liu R (2005). Preparative isolation and Mutagenesis, 329(2):205-212. purification of five compounds from the Chinese medicinal 3. Ding Y, Zhao L, Mei H, et al (2008). Exploration of emodin to herb Polygonum cuspidatum Sieb. Et Zucc by high-speed counter treat alpha-naphthylisothiocyanate-induced cholestatic current chromatography. Journal Chromatography A, 1097:33-39. hepatitis via anti-inflammatory pathway. European Journal of Pharmacology, 590(1-3):377-386. 4. Edwards HGM, Newton EM, Wynn-Williams D (2003). Ngày nhận bài: 16/10/2019 Molecular spectroscopic studies of lichen substances 1: parietin Ngày phản biện nhận xét bài báo: 26/10/2019 and emodin. Journal of Molecular Structure, 648(1):49-59. 5. Mai Thị Yến, Võ Văn Lẹo (2011). Khảo sát thành phần hóa học Ngày bài báo được đăng: 20/03/2020 của Cốt khí củ Polygonum cuspidatum. Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, Chuyên đề Dược, 15(S2):508-601. 90 B – Khoa học Dược
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2