Xây dựng quy trình kỹ thuật phát hiện đột biến gen KCNJ5 trên bệnh nhân cường aldosteron nguyên phát do adenoma tuyến thượng thận

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 2 * 2017<br /> <br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN<br /> KCNJ5 TRÊN BỆNH NHÂN CƯỜNG ALDOSTERON NGUYÊN PHÁT<br /> DO ADENOMA TUYẾN THƯỢNG THẬN<br /> Đỗ Đức Minh*, Trần Viết Thắng**, Mai Phương Thảo***<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Cường aldosterone nguyên phát là bệnh lý hàng đầu gây ra tăng huyết áp thứ phát với<br /> nguyên nhân chủ yếu là do adenoma tuyến thượng thận sản xuất aldosterone (APA: aldosterone<br /> producing adenoma). Cơ chế phân tử của cường aldosterone nguyên phát được cho là có liên quan đến<br /> đột biến gen KCNJ5. Nghiên cứu này nhằm thiết lập và ứng dụng quy trình kỹ thuật giải trình tự<br /> chuỗi DNA nhằm xác định các đột biến của gen KCNJ5 trên quần thể bệnh nhân APA Việt Nam.<br /> Đối tượng và phương pháp: Chúng tôi thiết kế các cặp mồi đặc hiệu khuếch đại 2 exon 2, 3 và<br /> vùng tiếp giáp exon-intron của gen KCNJ5. DNA được tách chiết từ mô tươi bệnh phẩm u tuyến<br /> thượng thận của bệnh nhân được chẩn đoán APA. Các mẫu DNA này sau đó được khuếch đại và giải<br /> trình tự bằng kỹ thuật Sanger.<br /> Kết quả: Chúng tôi đã khuếch đại thành công được 2 exon 2, 3 và vùng tiếp giáp exon-intron của gen<br /> KCNJ5. Kết quả giải trình tự cho thấy đột biến L168R ở 2 trong số 3 bệnh nhân được chẩn đoán APA.<br /> Kết luận: Kỹ thuật giải trình tự DNA phát hiện được đột biến trên gen KCNJ5 từ đó giúp tăng<br /> cường hiểu biết về sinh lý bệnh của bệnh lý APA.<br /> Từ khóa: cường aldosteron nguyên phát, adenoma tuyến thượng thận, gen KCNJ5, đột biến gen,<br /> PCR, giải trình tự DNA<br /> ABSTRACT<br /> TECHNICAL PROTOCOL TO IDENTIFY KCNJ5 SOMATIC MUTATION IN ADRENAL<br /> ALDOSTERONE-PRODUCING ADENOMA<br /> Do Duc Minh, Tran Viet Thang, Mai Phuong Thao<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement of Vol. 21 - No 2 - 2017: 84 - 89<br /> <br /> Objectives: Primary hyperaldosteronism is the most common cause of secondary hypertension<br /> and usually the consequence of adrenal aldosterone-producing adenoma (APA). Recently, molecular<br /> mechanism of APA has been shown to be associated with mutation in KCNJ5 gene. We conduct this<br /> study to set up a DNA sequencing procedure to investigate the mutation of KCNJ5 gene in<br /> Vietnamese APA patients.<br /> Material - Methods: Primers for amplification of exon 2,3 and the exon-intron boundaries of<br /> KCNJ5 gene were designed. Genomic DNA was extracted from fresh adrenal tissue of APA patients.<br /> These DNA were respectively amplified and sequenced by Sanger technique.<br /> Results: The whole coding site and the exon-intron boundaries of KCNJ5 gene were successfully<br /> amplified. After sequencing, 2 out of 3 patients with APA carry L168R somatic mutation.<br /> Conclusion: DNA sequencing can detect somatic mutation in KCNJ5 gene. This information can<br /> cast more light in the pathophysiology of APA.<br /> <br /> *Trung tâm Y sinh học phân tử, **Bộ môn Nội tiết, ***Bộ môn Sinh lý học, Đại học Y Dược TP.HCM<br /> Tác giả liên lạc: TS.BS. Đỗ Đức Minh ĐT: 0932999989 Email: mdt14284@yahoo.com<br /> 84 Chuyên Đề Nội Khoa<br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 2 * 2017 Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Keywords: primary aldosteronism, adrenal adenoma, KCNJ5 gene, somatic mutation, PCR,<br /> DNA sequencing<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ bệnh sinh của bệnh lý này mà còn rất cần<br /> <br /> Cường aldosterone nguyên phát là bệnh thiết cho việc đánh giá và tiên lượng bệnh vì<br /> lý hàng đầu gây ra tăng huyết áp thứ phát nhóm bệnh nhân có đột biến gen KCNJ5 có<br /> với tỷ lệ khoảng 6-10% trên tổng số bệnh khuynh hướng trẻ hơn, có nồng độ<br /> nhân tăng huyết áp và lên tới 20% ở nhóm aldosterone cao hơn và có cải thiện tim<br /> bệnh tăng huyết áp kháng trị(4, 7). Nguyên mạch tốt hơn sau điều trị phẫu thuật(6).<br /> nhân thường gặp của cường aldosterone là<br /> ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU<br /> do adenoma tuyến thượng thận sản xuất<br /> aldosterone (APA: adrenal aldosterone- Đối tượng nghiên cứu<br /> producing adenoma) hoặc tăng sản tuyến Chúng tôi tiến hành khảo sát đột biến<br /> thượng thận hai bên (bilateral adrenal gen KCNJ5 cho 3 bệnh nhân được chẩn đoán<br /> hyperplasia). Cơ chế phân tử của cường adenoma tuyến thượng thận sản xuất<br /> aldosterone nguyên phát vẫn chưa được aldosterone. Các bệnh nhân này đều có biểu<br /> hiểu biết rõ ràng và cho đến gần đây, một số hiện lâm sàng của tình trạng tăng huyết áp,<br /> nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến gen hạ kali máu, có nồng độ aldosterone máu<br /> KCNJ5 có liên quan mật thiết với nhóm tăng cao và không bị ức chế khi làm test tải<br /> bệnh APA(3). muối, nồng độ renin máu thấp và có khối u<br /> Gene KCNJ5nằm trên nhiễm sắc thể số số thượng thận 1 bên trên phim CT scan.<br /> 11, mã hóa cho kênh ion Kali Kir 3.4, đột Phương pháp nghiên cứu<br /> biến gen này làm cho kênh kali bị mất tính<br /> Tách chiết Genomic DNA<br /> chọn lọc, các tế bào vùng cầu của vỏ thượng<br /> thận bị khử cực liên tục dẫn đến việc sản Bệnh phẩm mô tươi khối u tuyến thượng<br /> xuất quá mức aldosterone(3). Tỷ lệ đột biến thận được thu nhận từ quá trình phẫu thuật<br /> gene KCNJ5 trên nhóm bệnh nhân APA thay của bệnh nhân. Sau đó mẫu mô tươi được<br /> đổi khá lớn tùy theo chủng tộc, tần suất dao cắt nhỏ và tách chiết DNA bằng bộ kit<br /> động từ khoảng 40% ở bệnh nhân Châu Âu QIAamp DNA Kit (Qiagen, Mỹ), theo hướng<br /> và lên tới 70% ở nhóm bệnh nhân Nhật Bản dẫn sử dụng của nhà sản xuất.<br /> và Trung Quốc(1,2,6,8).<br /> Việc xây dựng quy trình kỹ thuật xác<br /> định đột biến gene KCNJ5 trên nhóm bệnh<br /> nhân APA không những giúp làm rõ cơ chế<br /> Thiết kế mồi<br /> Bảng 1. Các cặp mồi dùng để khuếch đại và giải trình tự exon 2 và 3 của gen KCNJ5<br /> Tên mồi Trình tự chuỗi (5’-3’) Đoạn gen khuếch đại<br /> KCNJ5-2F CCTTCCATCTTGTGTTCTAG<br /> Exon 2 và vùng lân cận (1073 bp)<br /> KCNJ5-2R TGCCTAAGTCTGAAGTGTAG<br /> KCNJ5-3F1 GATGGATAGATGGATGGATG<br /> Exon 3 và vùng lân cận (617 bp)<br /> KCNJ5-3R TTAGCCAGCACCTACAAGAG<br /> KCNJ5-3F2 TGCTGTTTTCAGGAACGGAG<br /> Exon 2 và vùng lân cận (1167 bp)<br /> KCNJ5-3R TTAGCCAGCACCTACAAGAG<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Nội Tiết 85<br /> Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 21 * Số 2 * 2017<br /> <br /> <br /> Gen KCNJ5 bao gồm 3 exon, trong đó theo hai chiều xuôi và ngược với các mồi<br /> exon 1 không tham gia mã hóa protein, vì trong Bảng 1. Sản phẩm sau đó được kết tủa<br /> vậy chúng tôi chỉ tiến hành giải trình tự bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di<br /> exon 2, 3 và các vùng lân cận. Các đoạn mồi<br /> formanide, biến tính ở 95C trước khi làm<br /> được thiết kế dựa trên trình tử DNA của gen<br /> lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc bằng<br /> KCNJ5 mang mã số NG_023406.2 trong kho<br /> dữ liệu của NCBI và được tổng hợp bởi công máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7<br /> ty Integrated DNA Technologies, Hoa Kỳ. polymer và capillary 50 cm (Applied<br /> Thông tin các đoạn mồi được trình bày như Biosystems, Mỹ). Kết quả giải trình tự DNA<br /> bảng 1. được phân tích bằng phần mềm CLC Main<br /> Thực hiện PCR Workbench.<br /> Mỗi tube PCR có thể tích 25 l chứa các KẾT QUẢNGHIÊN CỨU<br /> thành phần: PCR buffer, dNTP (250 M cho<br /> mỗi loại), 2 mồi xuôi và ngược (0,5 M cho Thiết lập kỹ thuật giải trình tự DNA<br /> mỗi loại), 1,25U TaKaRa TaqTM HotStart gen KCNJ5<br /> Polymerase (Takara, Nhật Bản) và 50-100 ng Theo thiết kế ban đầu, 2 cặp mồi KCNJ5-<br /> genomic DNA. Chu trình luân nhiệt cho 2F, KCNJ5-2R và KCNJ5-3F1, KCNJ5-3R sẽ<br /> PCR được thực hiện trên máy khuếch đại thành công exon 2 và 3 của gene<br /> Mastercycler@Pro S (Eppendorf, Đức) bao<br /> KCNJ5 và vùng intron lân cận. Kết quả là<br /> gồm giai đoạn biến tính ban đầu ở 980C<br /> trong 3 phút, theo sau bằng 40 chu kỳ gồm exon 2 được khuếch đại thành công với kích<br /> biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn mồi ở thước sản phẩm PCR như mong đợi, trong<br /> 540C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở khi đó do cặp mồi KCNJ5-3F1, KCNJ5-3R<br /> 720C trong 1,5 phút và kết thúc bằng giai bắt cặp không đặc hiệu hình thành sản<br /> đoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút. phẩm PCR với kích thước không phù hợp<br /> Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di với dự đoán ban đầu (