Xây dựng quy trình định lượng đồng thời azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trong thuốc xịt mũi Nozevtin bằng kỹ thuật HPLC

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

5
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Azelastin là một thuốc kháng histamin thế hệ hai có đặc tính chống dị ứng và giãn phế quản, thường sử dụng dưới dạng muối hydroclorid trong các dạng thành phẩm thuốc như dung dịch nhỏ mắt, nhỏ mũi, xịt mũi. Bài viết trình bày việc xây dựng quy trình định lượng đồng thời azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trong thuốc xịt mũi Nozevtin bằng kỹ thuật HPLC.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng quy trình định lượng đồng thời azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trong thuốc xịt mũi Nozevtin bằng kỹ thuật HPLC

Xây dựng quy trình định lượng đồng thời azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trong thuốc xịt mũi Nozevtin bằng kỹ thuật HPLC Ngô Minh Thúy, Nguyễn Mai Hương Lê Đình Chi, Tống Thị Thanh Vượng* Trường Đại học Dược Hà Nội Summary A simple HPLC method using UV-Vis detector was developed for assay of azelastine hydrochloride and benzalkonium chloride in Nozevtin nasal sprays. The chromatographic separation was done in a Vertisep GES C18 column (250 x 4.6 mm, 5 µm) using acetonitrile – 10 mM potassium phosphate solution pH 3.5 (75 : 25, v/v) as mobile phase. Flow rate of mobile phase was maintained at 1.1 ml per minute, detection set at 290 nm for azelastine hydrochloride and 210 nm for benzalkonium chloride, injection volume was 20 l. The method was fully validated according to the guideline of ICH and was proved as precise (RSD ≤ 1.2% in repeatability study and RSD ≤ 1.4% in intermediate precision study), accurate (recovery rates from 98.5 to 99.6% for azelastine hydrochloride and from 98.1 to 101.9% for benzalkonium chloride in recovery study), specific and having suitable linear range (from 52.5 to 157.5 µg/ml for azelastine hydrochloride and from 62.5 to 187.5 µg/ml for benzalkonium chloride) for the intended application Keywords: Azelastine hydrochloride, benzalkonium chloride, nasal sprays, HPLC. Đặt vấn đề về nguyên liệu cũng như chế phẩm chứa Azelastin là một thuốc kháng histamin thế hệ azelastin. USP43 sử dụng cột cyano (L10 theo hai có đặc tính chống dị ứng và giãn phế quản, xếp loại pha tĩnh của USP) để định lượng thường sử dụng dưới dạng muối hydroclorid azelastin hydroclorid trong dung dịch nhỏ mắt [1] trong các dạng thành phẩm thuốc như dung và định lượng tạp trong nguyên liệu azelastin dịch nhỏ mắt, nhỏ mũi, xịt mũi. Benzalkonium hydroclorid [2], ngoài ra, azelastin và tạp liên clorid là một chất bảo quản kháng vi sinh vật quan cũng được phân tích trên cột C18 [3]. được sử dụng phổ biến trong các thành phẩm Benzalkonium clorid cũng đã được phân tích thuốc, nhất là các chế phẩm cần vô khuẩn hoặc bằng HPLC sử dụng cột cyano [4,5] hoặc cột đặc có dạng bào chế thuận lợi cho vi sinh vật phát triển (VD: Dung dịch, hỗn dịch...). Hiện nay, biệt Acclaim Surfactant Plus [6] cũng như bằng Dược điển Việt Nam V chưa có chuyên luận điện di mao quản [5]. Cột cyano cũng đã được sử dụng để phân tích đồng thời azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trong dung Chịu trách nhiệm: Tống Thị Thanh Vượng dịch nhỏ mắt [7]. Tuy nhiên, so với các loại cột Email: ttvuong1980@gmail.com sắc ký pha đảo thông dụng luôn sẵn có tại các Ngày nhận: 10/02/2022 phòng kiểm nghiệm dược như cột C18, C8 thì Ngày phản biện: 14/3/2022 cột cyano là loại cột có tần xuất sử dụng thấp Ngày duyệt bài: 24/3/2022 hơn, vì vậy, xây dựng được phương pháp phân TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022 59
tích đồng thời azelastin hydroclorid và Đối tượng nghiên cứu benzalkonium clorid trên một loại cột sắc ký Dung dịch xịt mũi Nozevtin (hàm lượng trên thông dụng hơn trong kiểm nghiệm sẽ có ý nhãn: Azelastin hydroclorid 15 mg/15 ml, nghĩa thực tế lớn, cho phép các cơ sở kiểm benzalkonium clorid 1,875 mg/15 ml, tá dược nghiệm có thêm lựa chọn về kỹ thuật trong phân khác: Acid citric, dinatri hydrophosphat, dinatri tích azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid edetat, surcalose, hypromellose 2900, natri cũng như tận dụng tốt hơn cơ sở vật chất sẵn clorid, nước tinh khiết). có, trong đó có cột sắc ký. Trong nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu này, một phương pháp HPLC đơn giản sử dụng Điều kiện sắc ký cột C18 thông dụng đã được phát triển để định Các điều kiện sắc ký sau đây được sử dụng lượng azelastin hydroclorid và benzalkonium để định lượng azelastin hydroclorid và clorid trong dung dịch xịt mũi. benzalkonium clorid: Cột sắc ký Vertisep GES Nguyên liệu và phương pháp C18 duy trì ở nhiệt độ phòng trong quá trình chạy Chất đối chiếu, trang thiết bị, dung môi và sắc ký; detector PDA lấy sắc đồ ở 290 nm để hóa chất định lượng azelastin hydroclorid và ở 210 nm để Chất đối chiếu định lượng benzalkonium clorid; tốc độ dòng Các chất chuẩn (của Viện Kiểm nghiệm pha động: 1,1 ml/phút; thể tích tiêm mẫu: 20 l. Thuốc Trung ương): Azelastin hydroclorid (SKS: Pha động là hỗn hợp acetonitril – dung dịch kali AH0020216, hàm lượng 99,4%), benzalkonium dihydrophotphat 10 mM, pH 3,5 (75 : 25, v/v). clorid (SKS: C0220327.02, hàm lượng 96,7%). Chuẩn bị mẫu Trang thiết bị Dung dịch chuẩn: Để phân tích thường quy, - Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC chuẩn bị các dung dịch chuẩn azelastin Agilent 1200 trang bị detector DAD (Agilent, Mỹ). hydroclorid nồng độ 100 g/ml và dung dịch - Cột sắc ký Vertisep GES C18 (250 mm x chuẩn benzalkonium clorid nồng độ 125 g/ml 4,6 mm; 5 µm) (Vertical, Thái Lan). trong nước cất. Để thẩm định phương pháp, - Cân phân tích A&D GR200 (d = 0,0001 g) chuẩn bị các dung dịch chuẩn azelastin (A&D, Nhật Bản). hydroclorid và dung dịch chuẩn benzalkonium - Các thiết bị phụ trợ: Máy đo pH, máy lắc clorid có nồng độ chính xác thích hợp trong siêu âm, bộ lọc chân không để lọc dung môi cho nước cất. HPLC. Dung dịch thử định lượng azelastin - Dụng cụ thủy tinh các loại (bình định mức, hydroclorid: Pha loãng chính xác 1,0 ml dung cốc có mỏ, pipet, ống đong, bình cầu nút mài), dịch chế phẩm bằng nước cất thành 10 ml. autopipet, ống ly tâm, phễu lọc, giấy lọc, màng Dung dịch này có nồng độ azelastin hydroclorid lọc 0,45 µm. xấp xỉ 100 g/ml. Dung môi và hóa chất Dung dịch thử định lượng benzalkonium - Dung môi tinh khiết cho HPLC: Acetonitril clorid: Sử dụng trực tiếp dung dịch chế phẩm. (Hãng Merck, Đức) Dung dịch này có nồng độ benzalkonium clorid - Hóa chất tinh khiết phân tích: Kali xấp xỉ 125 g/ml. dihydrophotphat, acid phosphoric (Hãng Merck, Dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị dung dịch Đức) trong nước cất chứa các thành phần tá dược - Nước cất 2 lần. trong công thức bào chế của dung dịch xịt mũi 60 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022
Nozevtin nhưng không chứa azelastin của detector để ghi sắc ký đồ, tỷ lệ thành phần hydroclorid và benzalkonium clorid. và pH của pha động được khảo sát để lựa chọn Dung dịch tự tạo đánh giá độ đúng: Chuẩn bị điều kiện chính thức phù hợp nêu ở phần các dung dịch trong nền mẫu trắng có nồng độ Phương pháp nghiên cứu. azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid Bước sóng ghi sắc ký đồ cho từng chất phân chính xác tương ứng với khoảng 80%, 100% và tích được chọn dựa trên phổ hấp thụ UV-Vis 120% nồng độ làm việc của từng chất (tương cũng như nồng độ trong mẫu. Azelastin ứng khoảng 80, 100 và 120 g/ml với azelastin hydroclorid có cực đại hấp thụ UV ở bước sóng hydroclorid và 100, 125 và 150 g/ml với 290 nm (hình 1B), do đó detector được đặt ở benzalkonium clorid). 290 nm để ghi sắc ký đồ định lượng chất này. Kết quả và bàn luận Benzalkonium clorid có cực đại hấp thụ UV ở Xây dựng phương pháp bước sóng 263 nm (hình 1D và 1G). Tuy nhiên, Phương pháp sắc ký để phân tích azelastin do độ hấp thụ UV của benzalkonium clorid nhỏ hydroclorid và benzalkonium clorid được khảo và hàm lượng trong mẫu dung dịch xịt mũi thấp sát phân tích trên cột Vertisep GES C18 sử nên sắc ký đồ được lấy ở bước sóng 210 nm để dụng pha động là hỗn hợp acetonitrile – dung đảm bảo độ nhạy. dịch kali dihydrophotphat 10 mM. Bước sóng A B C D TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022 61
E G Hình 1. Độ tinh khiết của pic azelastin hydroclorid (A), benzalkonium clorid (C: pic 1, E: pic 2) và phổ hấp thụ UV-Vis của azelastin hydroclorid (B), benzalkonium clorid (D: pic 1, G: pic 2) Hình dạng pic sắc ký của azelastin được pic thứ nhất của benzalkonium clorid không tách khảo sát phân tích trên cột Vertisep GES C18 được khỏi một pic phụ trong nền mẫu chế phẩm sử dụng pha động là hỗn hợp acetonitrile – (hình 3C). Pic này chỉ tách hoàn toàn khỏi pic dung dịch kali dihydrophotphat 10 mM ở một số thứ nhất của benzalkonium clorid với độ phân tỷ lệ và pH khác nhau. Khảo sát pH của pha giải lớn hơn 1,5 khi tỷ lệ acetonitrile trong pha động trong khoảng 3,0 – 5,0 với tỷ lệ động giảm xuống 75% (hình 3D). Độ phân giải acetonitrile – dung dịch kali dihydrophotphat cải thiện không đáng kể khi giảm tỷ lệ 10 mM duy trì ở 80 : 20 (tt/tt), độ cân xứng của acetonitrile trong pha động xuống dưới 75%, pic benzalkonium clorid không bị ảnh hưởng trong khi thời gian phân tích dài hơn do thời nhiều khi pH thay đổi (hình 2). Trong khi đó, pic gian lưu của cả azelastin hydroclorid và azelastin hydroclorid cân xứng nhất ở pH 3,5 benzalkonium clorid tăng lên. Do vậy, hỗn hợp (hình 2, hình 3A và 3B). Do vậy, pH 3,5 được acetonitrile – dung dịch kali dihydrophotphat chọn cho pha động. Khi tỷ lệ acetonitrile trong 10 mM, pH 3,5 (75 : 25) được dùng làm pha pha động tăng, thời gian lưu của azelastin động và các điều kiện phân tích chính thức hydroclorid và benzalkonium clorid giảm, giúp được lựa chọn như ở phần phương pháp giảm thời gian phân tích. Tuy nhiên, khi tỷ lệ nghiên cứu. acetonitrile trong pha động là 80% hay cao hơn, 62 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022
Hình 2. Ảnh hưởng của pH đến độ cân xứng pic của các chất phân tích AZH A AZH B BAC 1 C BAC 2 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022 63
BAC 1 D BAC 2 Hình 3. Một số sắc ký đồ trong quá trình phát triển phương pháp (pic azelastin hydroclorid: A - ở pH = 3,0, B - ở pH = 3,5; pic benzalkonium clorid với pha động acetonitril – dung dịch kali dihydrophotphat 10 mM, pH 3,5: C: tỷ lệ 80 - 20 (tt/tt), D: tỷ lệ 75 - 25 (tt/tt) Thẩm định quy trình phân tích benzalkonium clorid, đồng thời, độ đúng, độ lặp Quy trình phân tích đã được thẩm định đầy lại khi thẩm định cho kết quả đáp ứng được đủ theo hướng dẫn Q2R1 của ICH [8]. Kết quả mức quy định cho phép của AOAC International [9]. thẩm định (bảng 1) cho thấy quy trình đã xây Do đó, quy trình thích hợp để định lượng dựng có độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính phù 2 chất này trong dung dịch xịt mũi. hợp với cả azelastin hydroclorid và Bảng 1. Tóm tắt kết quả thẩm định quy trình phân tích Đối tượng phân tích Benzalkonium clorid Chỉ tiêu thẩm định Azelastin hydroclorid Tổng diện tích Pic 1 Pic 2 2 pic  Sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp: Pic của azelastin hydroclorid và 2 pic của benzalkonium clorid được tách hoàn toàn khỏi nhau, thứ tự rửa giải: Azelastin ra trước, sau đó là 2 pic của benzalkonium clorid (hình 4C - 4G)  Sắc ký đồ mẫu thử để định lượng azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid đều xuất hiện pic với thời gian lưu tương ứng của từng chất như Độ đặc hiệu trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn hỗn hợp, được tách hoàn toàn khỏi các pic khác. Sắc ký đồ mẫu trắng không xuất hiện pic tại thời điểm tương ứng với thời gian lưu của azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn hỗn hợp (hình 4).  Các pic của azelastin (hình 1A), benzalkonium clorid (hình 1C - 1E) đều có độ tinh khiết tốt. Phù hợp hệ thống (n = 6) Thời gian lưu (phút) 3,115 ± 0,012, 8,450 ± 0,053 14,708 ± 0,134 RSD = 0,4% RSD = 0,6% RSD = 0,9% Diện tích pic (mAU.s) 2040,6 ± 6,3, 1969,4 ± 9,2 1029,7 ± 7,8 2999,1 ± 15,4 RSD = 0,3% RSD = 0,5% RSD = 0,8% RSD = 0,5% Khoảng tuyến tính: (Định lượng bằng tổng diện tích 2 pic) Khoảng nồng độ (µg/ml) 52,5 – 157,5 62,5 – 187,5 Phương trình hồi quy y = 19,105x + 7,86 y = 22,503x + 5,96 Hệ số tương quan r = 0,9991 r = 0,9988 64 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022
Độ lặp lại: Trong ngày (n = 6) RSD = 0,3% RSD = 1,2% Khác ngày (2 ngày, RSD = 1,4% RSD = 1,0% n = 12) Độ đúng: Mức 1 (79,1 µg/ml): Mức 1 (100,3 µg/ml): Tỷ lệ thu hồi 98,5 – 99,7 % Đánh giá ở 3 mức nồng độ Tỷ lệ thu hồi 98,4 – (RSD = 0,6%) (mức 1: 80% nồng độ định 99,6 % (RSD = lượng, mức 2: 100% nồng 0,6%) độ định lượng, mức 3: Mức 2 (98,9 µg/ml): Mức 2 (125,4 µg/ml): Tỷ lệ thu hồi 98,8 – 100,4 % 120% nồng độ định lượng Tỷ lệ thu hồi 99,3 – (RSD = 0,8%) của mỗi chất), mỗi nồng độ 100,8 % (RSD = 3 lần, xác định tỷ lệ (%) thu 0,8%) hồi so với lượng thêm vào) Mức 3 (118,7 µg/ml): Mức 3 (150,5 µg/ml): Tỷ lệ thu hồi 99,1 – 100,7 % Tỷ lệ thu hồi 99,0 – (RSD = 0,8%) 100,6 % (RSD = 0,8%) Giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) LOD: 1,2 LOD: 4,0 trong dung dịch tiêm sắc ký LOQ: 15,0 LOQ: 50,0 (g/ml) A 210 nm B 290 nm C D 290 nm AZH 210 nm AZH BAC 1 BAC 2 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022 65
AZH E 210 nm AZH G 290 nm BAC 1 BAC 2 Hình 4. Một số sắc ký đồ đại diện (A, B: mẫu trắng; C, D: chuẩn hỗn hợp; E, G: mẫu thử; sắc ký đồ lấy ở 290 nm để định lượng azelastin hydroclorid (AZH), ở 210 nm để định lượng benzalkonium clorid (BAC). Ứng dụng quy trình phép (khoảng 90 – 110% so với hàm lượng trên Quy trình đã được áp dụng để định lượng nhãn với dược chất như azelastin hydroclorid và azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid 80 – 120% so với hàm lượng trong công thức trong dung dịch xịt mũi Nozevtin. Kết quả định bào chế với chất bảo quản như benzalkonium lượng (bảng 2) cho thấy hàm lượng cả hai chất clorid). đều nằm trong khoảng dao động phổ biến cho Bảng 2. Kết quả định lượng azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid trong dung dịch xịt mũi Nozevtin STT Chất phân tích Hàm lượng (%) so với trên nhãn (TB ± SD, n = 3) 1 Azelastin hydroclorid 107,8 ± 0,5 2 Benzalkonium clorid 100,6 ± 1,0 Như vậy, kết quả thu được từ thẩm định clorid với gốc alkyl mạch thẳng có độ dài khác phương pháp và ứng dụng phân tích trên mẫu nhau, trong đó chủ yếu là hai chất có gốc alkyl thực cho thấy phương pháp đã xây dựng trong C12 (12 carbon) và C14, một số trường hợp có nghiên cứu này thích hợp để định lượng thêm thành phần gốc alkyl C16. Do vậy, khi azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid phân tích benzalkonium clorid bằng HPLC trong chế phẩm thuốc xịt mũi. thường cho ít nhất 2 pic tách riêng và tổng Bàn luận lượng benzalkonium clorid sẽ được tính trên Kết quả thu được của nghiên cứu này cho tổng diện tích pic các chất thành phần này [5,7]. thấy phương pháp định lượng hai chất này trên Về khả năng định lượng đồng thời trên cùng cột C18 là khả thi, đáng tin cậy, đáp ứng đầy đủ một dung dịch mẫu thử cả hai chất azelastin các yêu cầu về thẩm định phương pháp hiện hydroclorid và benzalkonium clorid, trở ngại hành [8,9]. Với benzalkonium clorid, về bản chất chính là chênh lệch nồng độ hai chất trong chế đây là hỗn hợp một số alkylbenzyldimethylamoni phẩm thuốc cũng như mức độ hấp thụ UV-Vis. 66 TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022
Trong trường hợp chế phẩm Nozevtin, nồng độ Chemistry, 2019, pp. 9489723. azelastin hydroclorid cao gấp 8 lần 4. J. Dudkiewicz Wilczynska, J. Tautt, benzalkonium clorid, thêm vào đó azelastin I. Roman (2004), “Application of the HPLC hydroclorid hấp thụ UV-Vis tốt hơn method for benzalkonium chloride determination benzalkonium clorid, dẫn đến cần sử dụng hai in aerosol preparations”, Journal of bước sóng khác nhau và chuẩn bị hai dung dịch Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 34 (5), thử khác nhau để định lượng hai chất này trong pp. 909-920. chế phẩm, dù vẫn có thể sử dụng chung cùng 5. S. J. Prince, H. McLaury, L.V. Allen, Ph. một dung dịch chuẩn hỗn hợp với nồng độ phù McLaury (1999), “Analysis of benzalkonium hợp. Trong trường hợp các mẫu có tỷ lệ hàm chloride and its homologs: HPLC versus HPCE”, lượng, nồng độ hai chất phù hợp, hoàn toàn có Journal of Pharmaceutical and Biomedical thể định lượng đồng thời cả hai chất chỉ trong Analysis, 19 (6), pp. 877-882. một dung dịch thử duy nhất, không cần chuẩn bị 6. X. Huang, Q. Xu, J. Rohrer (2016), Rapid dung dịch thử riêng cho từng chất. determination of benzalkonium chloride in a Kết luận cosmetic, Application Update 190, Thermo Sử dụng kỹ thuật HPLC-UV với điều kiện Fisher. đơn giản trên cột C18 thông dụng, quy trình 7. M. E. M. Hassouna, M. M. Abdelrahman, phân tích được xây dựng đã cho phép phân tích M. A. Mohamed (2017), “Simultaneous azelastin hydroclorid và benzalkonium clorid determination of azelastin hydrochloride and trong dung dịch xịt mũi với độ đặc hiệu, độ đúng benzalkonium chloride by RP-HPLC method in phù hợp. Quy trình đã được ứng dụng để định their ophthalmic solution”, Journal of Forensic lượng hai thành phần này trong chế phẩm Sciences & Criminal Investigation, 11 (3), pp. thương mại lưu hành trên thị trường. 555565. Tài liệu tham khảo 8. International Council for Harmonization of 1. United States Pharmacopeial Convention Technical Requirements for Pharmaceuticals for (2020), Azelastine hydrochloride ophthalmic Human Use (2005), ICH Harmonised Tripartite solution, USP43-NF39. Guideline - Validation of Analytical Procedures: 2. United States Pharmacopeial Convention Text and Methodology Q2 (R1). (2020), Azelastine hydrochloride ophthalmic 9. AOAC International (2012), Appendix F: solution, USP43-NF39. Guidelines for Standard Method Performance 3. L. M. da Costa, H. O. de Almeida Leite, N. Requirements, AOAC Official Methods of M. Kassab, A. K. Singh (2019), “Green Analysis. analytical methods for the separation of seven antihistamines: Application in separation of azelastine and related impurities in nasal solution”, International Journal of Analytical TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC SỐ 44 - THÁNG 3/2022 67