Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng nguyên liệu dioscin chiết xuất, phân lập từ cây bảy lá một hoa bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

Chia sẻ: Lang Liêu | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

42
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày quy trình định lượng trên loại cột được sử dụng phổ biến là RP 18 nhằm thẩm định quy trình định tính, định lượng nguyên liệu dioscin chiết xuất, phân lập từ cây bảy lá một hoa bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xây dựng và thẩm định quy trình định tính, định lượng nguyên liệu dioscin chiết xuất, phân lập từ cây bảy lá một hoa bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao

Với điều kiện sắc ký đã chọn, phương pháp có độ lặp một hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng diclofenac lại và độ chính xác trung gian tốt (RSD với 12 mẫu thử natri trong chế phẩm viên đạn. Phương pháp xây dựng có của 2 kiểm nghiệm viên đều nhỏ hơn 2,0%) có thể áp sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa diện tích pic đáp dụng để định lượng các mẫu thành phẩm. ứng và nồng độ hoạt chất, độ lặp lại, độ chính xác trung 3.6. Khoảng xác định gian và độ đúng cao với các điều kiện trang thiết bị, hóa chất thuốc thử phù hợp với đa số các phòng thí nghiệm. Với Trong phần đánh giá độ đúng, độ tuyến tính suy ra các kết quả thu được, chúng tôi áp dụng phương pháp định khoảng xác định của diclofenac natri là từ 40 - 60 µg/ml. lượng đã nghiên cứu cho chế phẩm thuốc đạn Diclovat 50 4. Kết luận và hy vọng có thể áp dụng phương pháp này đối với các Qua khảo sát thực nghiệm, chúng tôi đã xây dựng được viên đạn khác có chứa hoạt chất diclofenac natri. Tài liệu tham khảo 1. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam. Lần xuất bản thứ năm, NXB Y học, Hà Nội. 2. Bộ Y tế (2014), Tài liệu tập huấn chuyên gia thẩm định hồ sơ đăng ký thuốc phần tiêu chuẩn chất lượng. 3. Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương (2010), Đảm bảo chất lượng thuốc và một số phương pháp kiểm nghiệm thuốc (Tài liệu đào tạo nâng cao về kiểm nghiệm thuốc). 4. The British Pharmacopoeia Commission (2018), British Pharmacopoeia, Volume III, pp. 472-473. 5. The U.S. Pharmacopeial Convention (2019), United states Pharmacopoeia 42. SUMMARY An HPLC method for determination of Diclofenac sodium in Diclovat 50 suppository is introduced: The chromatographic conditions are as follows: - Column: Shimadzu Rp18 (250 x 4.6 mm; 5 µm) - Mobiphase: Buffer solution pH 2.5 - Methanol (34 : 66) - Detector UV: 254 nm - Flow rate: 1.0 ml/min - Injection volume: 20 µl The method was validated about the specificity, system suitability, linear range, prescision, accuracy and validation results proved that this method was suitable for determination of Diclofenac natri in suppository. (Ngày nhận bài: 30/11/2019 ; Ngày phản biện: 20/02/2020 ; Ngày duyệt đăng: 17/06/2020) XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH TÍNH, ĐỊNH LƯỢNG NGUYÊN LIỆU DIOSCIN CHIẾT XUẤT, PHÂN LẬP TỪ CÂY BẢY LÁ MỘT HOA BẰNG KỸ THUẬT SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÁI NGUYỄN HÙNG THU ĐỖ THỊ HÀ CAO NGỌC ANH, LÊ QUANG THẢO Trường Đại học Dược Hà Nội Viện Dược liệu Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Từ khóa: Định lượng, dioscin, sắc ký lỏng hiệu năng cao, Bảy lá một hoa. 1. Đặt vấn đề Dioscin là Diosgenin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranosid (C45H72O16). Dioscin có trong thành phần của cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla) [2],[8], một dược liệu được biết đến với các tác dụng dược lý như ức chế enzym tyrosinase và chống bệnh Leishmania [3], cầm máu trong bệnh 6 Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 4.2020; Tập 18.(70)
chảy máu bất thường ở tử cung, kháng khuẩn, ức chế tổn 2.2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu thương ở dạ dày… đặc biệt là tác dụng chống ung thư và 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu ức chế sự phát triển của khối u [4],[9]. Nguyên liệu dioscin được chiết xuất, phân lập và tinh Phương pháp định lượng dioscin đã được đề cập chế từ thân rễ cây Bảy lá một hoa (Paris polyphylla), đến trong một số bài báo, tuy nhiên hệ thống sắc ký SKS: D.012020EC. lỏng siêu hiệu năng UHPLC và cột sắc ký được sử dụng (2,1 x 100 mm, 1,7 μm) là loại hiện ít dùng trong các 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu phòng kiểm nghiệm ở Việt Nam [5],[7]. Vì vậy nhóm 2.2.2.1. Điều kiện sắc ký [1],[5],[7] tác giả đã nghiên cứu quy trình định lượng trên loại cột - Phương pháp phân tích: Kỹ thuật sắc ký lỏng pha đảo. được sử dụng phổ biến là RP 18 (250 × 4,6 mm; 5 µm). - Pha động: Acetonitril - nước (55:45) 2. Thực nghiệm - Cột C18: 250 x 4,6 mm; 5 µm 2.1. Thiết bị, hóa chất, chất chuẩn - Nhiệt độ cột: 35oC 2.1.1. Thiết bị, dụng cụ - Detector UV: 203 nm Sử dụng các thiết bị phân tích của Viện Kiểm nghiệm - Tốc độ dòng: 1,0 ml/min thuốc Trung ương đã được hiệu chuẩn, đáp ứng yêu cầu - Thể tích tiêm: 20 μl của ISO/IEC 17025 và GLP, bao gồm: 2.2.2.2. Phương pháp chuẩn bị mẫu [7] - Cân phân tích MS105 độ chính xác 0,01 mg - Dung môi pha mẫu: Methanol (Mettler, Thụy Sỹ); - Dung dịch chuẩn: Cân và hòa tan chính xác một - Hệ thống máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Water lượng chất chuẩn dioscin trong methanol để thu được ARC; dung dịch có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml, trộn đều. - Cột Phenomenex Luna RP 18 (250 mm × 4,6 mm; - Dung dịch thử: Cân và hòa tan chính xác một lượng 5 µm); mẫu thử dioscin trong methanol để thu được dung dịch - Các dụng cụ cần thiết khác trong quá trình thí có nồng độ khoảng 0,5 mg/ml, trộn đều. nghiệm. - Dung dịch kiểm tra độ phân giải: Hòa tan một lượng 2.1.2. Hóa chất và dung môi chất chuẩn polyphyllin D trong dung dịch chuẩn để thu Dung môi tinh khiết HPLC: Acetonitril (Merck), được dung dịch có nồng độ khoảng 0,5 mg dioscin/ml methanol (Merck), nước cất hai lần. và 0,025 mg polyphyllin D/ml. 2.1.3. Chất chuẩn 3. Kết quả và bàn luận - Chất chuẩn dioscin được cung cấp bởi Chengdu 3.1. Lựa chọn điều kiện sắc ký Herbpurify Co., Ltd., Trung Quốc (SKS: S-048-180530; Sau khi khảo sát một số điều kiện như: thay đổi cột, Hàm lượng: 98,03%; Độ ẩm: 1,45%); tốc độ dòng, pha động, tỷ lệ pha động, chúng tôi đã lựa - Chất chuẩn polyphyllin D được cung cấp bởi chọn được điều kiện sắc ký như đã nêu ở mục 2.2.2.1. Sắc Chengdu Herbpurify Co., Ltd., Trung Quốc (SKS: ký đồ thu được từ dung dịch phân giải, dung dịch chuẩn C-036-181216; Hàm lượng: 98,72%; Độ ẩm: 1,64%). và dung dịch thử thể hiện ở Hình 2, Hình 3 và Hình 4. Hình 1. Sắc ký đồ mẫu trắng (dung môi pha mẫu) Hình 2. Sắc ký đồ dung dịch phân giải Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 4.2020; Tập 18.(70) 7
Hình 3. Sắc ký đồ dung dịch chuẩn Hình 4. Sắc ký đồ dung dịch thử Hình 5. Chồng phổ UV của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử. Kết quả cho thấy pic dioscin có thời gian lưu khoảng - Thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ của dung 8,3 phút, pic nhọn, cân đối (Hình 3, Hình 4); pic dịch thử tương ứng với thời gian lưu của pic dioscin polyphyllin D được tách ra hoàn toàn khỏi pic dioscin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (khoảng 8,3 phút - (Hình 2); Phổ UV của pic chính trên sắc ký đồ thu được Hình 3, Hình 4). từ dung dịch thử trùng với pic chính trên sắc ký đồ thu - Phổ UV của pic chính trên sắc ký đồ của dung dịch được từ dung dịch chuẩn (Hình 5). thử phù hợp với phổ UV của pic dioscin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn (Hình 5). 3.2. Thẩm định phương pháp phân tích [6] - Trên sắc ký đồ của dung dịch kiểm tra độ phân giải, 3.2.1. Độ đặc hiệu pic polyphyllin D tách ra hoàn toàn khỏi pic dioscin - Dung dịch chuẩn: Cân 5,03 mg chất chuẩn dioscin (Hình 2). vào bình định mức 10 ml. Hòa tan và pha loãng với - Trên sắc ký đồ của mẫu trắng (dung môi pha mẫu) methanol vừa đủ đến vạch, trộn đều. không xuất hiện pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của pic dioscin (Hình 1). - Dung dịch thử: Cân 5,02 mg mẫu thử dioscin vào Kết quả cho thấy phương pháp đạt yêu cầu về độ bình định mức 10 ml. Hòa tan và pha loãng với methanol đặc hiệu. vừa đủ đến vạch, trộn đều. 3.2.2. Độ thích hợp của hệ thống sắc ký - Dung dịch kiểm tra độ phân giải: Cân 5,05 mg - Dung dịch chuẩn: Sử dụng dung dịch chuẩn ở phần polyphyllin D chuẩn vào bình định mức 20 ml, hòa tan độ đặc hiệu. và pha loãng với methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. - Dung dịch kiểm tra độ phân giải: Sử dụng dung Hút 0,5 ml dung dịch này vào bình định mức 5 ml, thêm dịch kiểm tra độ phân giải ở phần độ đặc hiệu. dung dịch chuẩn vừa đủ, lắc đều. - Tiêm dung dịch chuẩn lặp lại 6 lần và dung dịch Tiêm vào hệ thống sắc ký lần lượt mẫu trắng kiểm tra độ phân giải, ghi lại các sắc ký đồ và xác định (methanol), dung dịch kiểm tra độ phân giải, dung dịch giá trị thời gian lưu, diện tích pic dioscin, độ phân giải chuẩn và dung dịch thử. Kết quả khảo sát tính đặc hiệu (Rs), hệ số bất đối xứng (T). Kết quả được thể hiện ở như sau: Bảng 1. 8 Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 4.2020; Tập 18.(70)
Bảng 1. Kết quả khảo sát độ thích hợp của hệ thống sắc ký STT Yêu cầu Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s) 1 8,295 2922004 2 8,295 2923136 3 8,296 2923258 4 8,296 2923067 5 8,298 2922726 6 8,298 2922429 Trung bình 8,296 2922770 RSD (%) ≤ 2,0 0,02 0,02 Số đĩa lý thuyết (N) ≥ 3000 5973 Hệ số bất đối xứng (T) 0,8 ≤ T ≤ 1,5 1,0 Độ phân giải (Rs) Rs ≥ 1,5 2,1 Kết quả khảo sát cho thấy giá trị RSD của thời gian lưu và diện tích pic đều bằng 0,02% < 2,0%, số đĩa lý thuyết N = 5973 > 3000, hệ số bất đối xứng T = 1,0, độ phân giải Rs = 2,1 > 1,5. Vậy hệ thống sắc ký phù hợp để định tính, định lượng nguyên liệu dioscin. 3.2.3. Độ tuyến tính Khảo sát trên dãy 05 dung dịch chuẩn dioscin trong dung môi pha mẫu với 05 mức nồng độ từ 50%, 80%, 100%, 120% và 150% so với nồng độ định lượng. Cách chuẩn bị các dung dịch chuẩn và kết quả được thể hiện trong Bảng 2 và Hình 6. Bảng 2. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp % So với nồng Nồng độ dung dịch Nồng độ dung dịch Diện tích pic STT Pha loãng (ml) độ định lượng chuẩn gốc (mg/ml) chuẩn (mg/ml) dioscin (mAU.s) 1 50% 2,5 → 10,0 0,2430 1467747 2 80% 2,0 → 5,0 0,3888 2345702 3 100% 0,9862 mg/ml 2,5 → 5,0 0,4859 2921752 4 120% 3,0 → 5,0 0,5831 3494314 5 150% 7,5 → 10,0 0,7289 4373065 Phương trình hồi qui: y = 5969155 x + 19858,41; Hệ số tương quan: r = 1,0000 Hệ số chắn (intercept): b = 19858,41; % Y = 0,68% (< 2,0%) Hình 6. Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và diện tích pic dioscin Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 4.2020; Tập 18.(70) 9
Kết quả cho thấy với điều kiện sắc ký đã lựa chọn, giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối của 6 mẫu thử được trong khoảng nồng độ đã khảo sát (từ 0,24 mg/ml đến phân tích riêng biệt theo qui trình phân tích ở mục 2.2.2. 0,73 mg/ml) có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa - Độ chính xác trung gian: Độ chính xác trung gian nồng độ dioscin và diện tích pic đáp ứng với hệ số tương được đánh giá dựa trên độ lệch chuẩn tương đối của 12 quan r = 1,0000. mẫu thử được phân tích ở 2 ngày khác nhau và hai kiểm 3.2.4. Độ chính xác của phương pháp nghiệm viên khác nhau. Kết quả khảo sát độ lặp lại và - Độ lặp lại: Độ lặp lại của phương pháp được đánh độ chính xác trung gian được thể hiện ở Bảng 3. Bảng 3. Kết quả khảo sát độ chính xác của phương pháp Kiểm nghiệm viên 1 Kiểm nghiệm viên 2 Thiết bị: HPLC Waters ARC Thiết bị: HPLC Waters ARC Ngày phân tích: 23/8/2020 Ngày phân tích: 24/8/2020 STT Khối lượng cân mẫu chuẩn: 5,03 mg Khối lượng cân mẫu chuẩn: 5,05 mg Diện tích pic TB mẫu chuẩn: 2922770 mAU.s Diện tích pic TB mẫu chuẩn: 2252301 mAU.s Khối lượng Diện tích Hàm lượng Khối lượng Diện tích Hàm lượng mẫu thử (mg) pic thử (mAU.s) (%) mẫu thử (mg) pic thử (mAU.s) (%) 1 4,97 2905852 97,21 5,03 2265887 97,58 2 4,95 2922458 98,16 5,01 2253933 97,45 3 4,93 2904653 97,96 4,98 2240477 97,45 4 5,02 2939888 97,37 5,01 2252455 97,39 5 4,97 2923081 97,79 4,95 2239325 97,99 6 4,93 2940697 99,17 5,01 2266021 97,97 Trung bình = 97,94%; n = 6; RSD = 0,72% Trung bình = 97,64%; n = 6; RSD = 0,28% Kết quả định lượng trung bình = 97,79%; n = 12; RSD = 0,54% Từ Bảng 3 cho thấy độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hòa tan và pha loãng với methanol vừa đủ đến vạch, lắc kết quả định lượng của mỗi kiểm nghiệm viên lần lượt đều. Hút chính xác 2,0 ml, 2,5 ml và 3,0 ml dung dịch là 0,72% và 0,28% đều nhỏ hơn 2,0%, của cả hai kiểm này (tương ứng với 80, 100% và 120% so với nồng độ nghiệm viên là 0,54% < 2,0%. Vậy phương pháp đạt yêu định lượng) vào các bình định mức 5 ml, thêm methanol cầu về độ chính xác (bao gồm độ lặp lại trong ngày và vừa đủ đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45 µm. khác ngày). Chuẩn bị 03 mẫu độc lập cho mỗi mức nồng độ. 3.2.5. Độ đúng của phương pháp Khối lượng cân mẫu chuẩn: 5,03 mg; Diện tích pic Dùng phương pháp thêm chuẩn vào nền mẫu (dung trung bình mẫu chuẩn: 2922770 mAU.s. môi pha mẫu). Kết quả khảo sát độ đúng được thể hiện ở Bảng 4. - Dung dịch chuẩn: Sử dụng dung dịch chuẩn ở mục Kết quả khảo sát cho thấy tỷ lệ thu hồi ở 3 mức nồng 3.2.1. Độ đặc hiệu. độ từ 98,29% đến 100,29 %; RSD của tỷ lệ thu hồi từ - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn tự tạo: Cân chính xác 0,68% đến 0,73% (< 2,0%). Phương pháp phân tích đạt khoảng 20 mg dioscin chuẩn vào bình định mức 20 ml, yêu cầu về độ đúng. 10 Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 4.2020; Tập 18.(70)
Bảng 4. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp Nồng độ Thể tích dung Lượng tương ứng Lượng Dung Lượng Diện tích pic Tỷ lệ thu dung dịch dịch chuẩn với C45H72O16 C45H72O16 STT dịch khảo chuẩn cân Dioscin hồi chuẩn thêm vào thêm vào tìm lại sát (mg) (mAU.s) (%) (mg/ml) (ml) (mg) (mg) 1 80% 20,28 0,980 2,0 1,959 2345239 1,950 99,51 2 80% 20,40 0,985 2,0 1,971 2345673 1,950 98,94 3 80% 20,12 0,972 2,0 1,944 2344955 1,949 100,29 Trung bình (%) 99,58 RSD (%) 0,68 4 100% 20,28 0,980 2,5 2,449 2920073 2,427 99,12 5 100% 20,40 0,985 2,5 2,464 2918727 2,426 98,49 6 100% 20,12 0,972 2,5 2,430 2921026 2,428 99,94 Trung bình (%) 99,18 RSD (%) 0,73 7 120% 20,28 0,980 3,0 2,939 3496359 2,907 98,90 8 120% 20,40 0,985 3,0 2,956 3495435 2,906 98,29 9 120% 20,12 0,972 3,0 2,916 3495953 2,906 99,68 Trung bình (%) 98,96 RSD (%) 0,70 4. Kết luận Nhóm nghiên cứu đã xây dựng được quy trình định lượng nguyên liệu dioscin bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao trên cột pha đảo với pha động là hỗn hợp của acetonitril - nước (55:45). Phương pháp sử dụng cột RP 18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), nhiệt độ cột duy trì ở 35oC; Tốc độ dòng 1,0 ml/phút; Thể tích tiêm 20 µl; Detector 203 nm. Phương pháp đã được thẩm định về tính đặc hiệu, tính thích hợp của hệ thống sắc ký, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại, độ chính xác trung gian. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp HPLC đã xây dựng hoàn toàn phù hợp để định tính, định lượng nguyên liệu dioscin. Tài liệu tham khảo 1. Bộ Y tế (2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà xuất bản Y học, Phụ lục 5.3, trang PL-147. 2. Chen C. X., Zhou J. (1981), “Studies on the saponin compounents of plants in Yunnan V. Steroid glycosides and β-ecdysone of Paris polyphyllar Sm. var. yunnanensis (FR.) HM.”, Acta Botanica Yunnanica, 1, p. 011. 3. Devkota K. P., Khan M. T. H., Ranjit R., Meli L. A., Samreen, Iqbal C. M. (2007), “Tyrosinase inhibitory and antileishmanial constituents from the rhizomes of Paris polyphylla”, Natural Product Research, 21, pp. 321-327. 4. Zheng W., Yan C. M., Zhang Y. B., Li Z. H., Z. Q. Li, Li X. Y., Wang Z. W., Wang X. L., Chen W. Q., Yu X. H. (2015), “Antiparasitic efficacy of dioscin and zingibernsis newsaponin from Costus speciosus (Koen ex. Retz) Sm. against Ichthyophthirius multifiliis”, Parasitology, 142(3), pp. 473-479. 5. Guangyi Yang, Wei Lu, Meng Pan, Chenning Zhang, Yuan Zhou, Pei Hu, Ming Hu, Gao Song (2017), An LC-MS/ MS method for simultaneous determination of nine steroidal saponins from Paris polyphylla var. in rat plasma and its application to pharmacokinetic study, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 145, pp. 675-681. 6. ICH (2005), “Validation of analytical procedures: Text and methodology Q2(R1)”, ICH Harmonized Tripartite guidelines, 1-13. Tạp chí KIỂM NGhiệm thuỐC - Số 4.2020; Tập 18.(70) 11