Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu quy trình giám định 11-Nor-9-Cacboxyl-Delta-9-Tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng GC-MS

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------------------

NGUYỄN THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH

11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL

TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

------------------------

NGUYỄN THỊ TUYẾN

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH GIÁM ĐỊNH

11-NOR-9-CACBOXYL-DELTA-9-TETRAHYDROCANNABINOL

TRONG NƯỚC TIỂU CỦA NGƯỜI BẰNG GC-MS

Chuyên ngành: Hóa Phân tích

Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Trường

Hà Nội – 2014

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Xuân

Trường đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên và tạo điều kiện giúp đỡ em

hoàn thành luận văn này.

Em xin cảm ơn các thầy, cô giáo Khoa Hóa, trường Đại học Khoa học tự

nhiên đã dạy dỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập và

nghiên cứu, đặc biệt là sự chỉ bảo của PGS.TS.Nguyễn Văn Ri.

Em cũng xin chân thành cảm ơn Ths. Hoàng Ngọc Mai, cùng các anh chị

Trung tâm giám định ma túy - Viện Khoa học hình sự đã rất nhiệt tình giúp đỡ,

động viên, truyền đạt lại nhiều kinh nghiệm quý báu cho em.

Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn lãnh đạo phòng PC54 –CATP Hà Nội cùng các

đồng nghiệp trong đội giám định Hóa học- phòng PC54 – CATP Hà Nội đã hết

sức tạo điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè đã hỗ trợ, là

chỗ dựa vững chắc giúp tôi hoàn thành luận văn.

Hà Nội, ngày 5 tháng 12 năm 2014

Học viên

Nguyễn Thị Tuyến

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .................................................................................. 3

1.1. Cần sa, các chế phẩm từ cần sa và các hoạt chất chính của cần sa .................. 3

1.1.1. Cần sa ..................................................................................................... 3

1.1.2. Các chế phẩm từ cần sa ........................................................................... 5

1.1.3. Tác hại của việc sử dụng cần sa ............................................................... 6

1.1.4. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự .... 7

1.1.5. Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần sa 9

1.1.6. THC và sự chuyển hóa THC trong nước tiểu ......................................... 10

1.1.7. THC-COOH .......................................................................................... 12

1.2. Một số phương pháp phân tích THC-COOH ............................................... 13

1.2.1. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký lỏng .......................... 13

1.2.2. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký khí ............................ 17

1.3. Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký

khí đã được công bố ........................................................................................... 20

1.4. Nguyên tắc phương pháp nghiên cứu xác định THC-COOH bằng GC-MS . 22

1.5. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS ................................................ 22

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .......................................................................... 24

2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu ......................................................... 24

2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu .............................................................................. 24

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 24

2.1.3. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 25

2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ....................................................................... 26

2.2.1. Hóa chất ................................................................................................ 26

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................ 27

2.3. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 28

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu................................................. 28

2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu......................................................................... 28

2.4. Thực nghiệm ............................................................................................... 29

2.4.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị GC-MS Triple Quad 7000 ..... 29

2.4.2. Khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất .............................................. 30

2.4.3. Khảo sát dung môi chiết ........................................................................ 30

2.4.4. Khảo sát môi trường (pH) chiết ............................................................. 31

2.4.5. Khảo sát hiệu suất chiết ......................................................................... 31

2.4.6. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị ............ 31

2.4.7. Xây dựng đường chuẩn ......................................................................... 32

2.4.8. Đánh giá phương pháp phân tích ........................................................... 32

2.4.9. Phân tích mẫu thực tế .........................................................................33

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 34

3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trên GC-MS .................. 34

3.2. Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất ..................................... 40

3.3. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình chiết ................................... 40

3.3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết ........................................................... 40

3.3.2. Kết quả khảo sát môi trường chiết (pH) ................................................. 43

3.3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết ............................................................ 44

3.4. Phương pháp định lượng THC-COOH ........................................................ 44

3.4.1. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị 44

3.4.2. Xây dựng đường chuẩn ......................................................................... 45

3.4.3. Kết quả đánh giá tính phù hợp của phương pháp ................................... 47

3.4.4. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp ............................. 48

3.4.5. Quy trình giám định THC-COOH trên thiết bị GC-MS ......................... 49

3.5. Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế ............................................ 51

3.6. Hướng phát triển của đề tài .......................................................................... 51

KẾT LUẬN .......................................................................................................... 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 53

PHỤ LỤC ............................................................................................................. 56

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong KHHS .................... 7

Bảng 1.2. Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa ................. 8

Bảng 1.3. Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu ............................................. 9

Bảng 1.4. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc

ký lỏng .................................................................................................................. 15

Bảng 1.5. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc

ký khí .................................................................................................................... 21

Bảng 2.1. Thông tin một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ .........................................25

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết ............... 41

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết ......................... 43

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết ............................................................. 44

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THC-COOH ............................ 45

Bảng 3.5. Kết quả so sánh giữa giá trị a với 0 của phương trình đường chuẩn ....... 47

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp ......................................... 47

Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi trên nền mẫu thật ........................................................ 48

Bảng 3.8. Kết quả định lượng thu được từ một số mẫu thực .................................. 51

DANH MỤC HÌNH VẼ

Trang

Hình 1.1. Các đặc điểm hình thái đặc trưng của cây cần sa ................................... 4

Hình 1.2. Cần sa trồng trong nhà ............................................................................ 5

Hình 1.3. Sơ đồ quá trình chuyển hóa THC trong nước tiểu ................................ 12

Hình 1.4. Sắc đồ của THC-COOH khi phân tích bằng LC- MS ................................. 16

Hình 1.5. Phổ khối của THC-COOH khi phân tích bằng LC-MS ........................... 16

Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí và vận hành ..................................................... 19

Hình 1.7. Sự tạo thành và dẫn xuất THC-COOH ................................................. 22

Hình 1.8. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS ........................................... 23

Hình 2.1. Một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ ............................................................. 24

Hình 3.1. Phổ khối của THC-COOH chuẩn ......................................................... 35

Hình 3.2. Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN I ......................................... 36

Hình 3.3. Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN I .......................................... 37

Hình 3.4. Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN II ....................................... 38

Hình 3.5. Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN II ......................................... 39

Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết ....................................... 42

Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết ................................................. 43

Hình 3.8. Đường chuẩn xác định THC-COOH ..................................................... 46

Hình 3.9. Sơ đồ quy trình xử lý, tách chiết THC-COOH trong mẫu nước tiểu .... 50

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Delta 9 –tetrahydrocannabinol

THC

Canabinol

CBN

Cannabidiol

CBD

THC-COOH

11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol

Trimetylclosilan

TMCS

N,O-bis- (trimetylsilyl) trifloaxetamit

BSTFA

Trimetylsilyl

TMS

Internal standard (Chất nội chuẩn)

IS

PFPA/PFPOH Pentafluoropropionic anhydride/pentafluoropropanol

MSTFA

2,2,2-Trifluoro-N-methyl-N-(trimethylsilyl)acetamide

EtOAc

Etylaxetat

Limit of detection (Giới hạn phát hiện)

LOD

Limit of quantity (Giới hạn định lượng)

LOQ

High performance liquid chromatography

HPLC

(Sắc ký lỏng hiệu năng cao)

GC

Gas Chromatography (Sắc ký khí)

GC-MS

Gas chromatography–mass spectrometry (Sắc ký khí khổi phổ)

Liquid chromatography–mass spectrometry (Sắc ký lỏng khối

LC-MS

phổ)

KHHS

Khoa học hình sự

CTN

Chương trình nhiệt

MỞ ĐẦU

Từ lâu người ta đã biết đến ma túy là những chất có tác dụng làm thay đổi

trạng thái tâm lý và sinh lý của người sử dụng, có khả năng bị lạm dụng và gây ra

sự phụ thuộc về tâm, sinh lý vào việc sử dụng các chất đó.

Khi ngừng dùng chất ma túy, người nghiện thường không kiểm soát được

hành vi của mình, tìm mọi cách để có ma túy sử dụng tiếp, có khuynh hướng gia

tăng liều lượng nhằm thỏa mãn trạng thái tinh thần, cảm giác mong muốn. Đó là

nguyên nhân làm gia tăng các loại tội phạm hình sự như trộm cắp, giết người,

cướp của, mại dâm, là nguyên nhân của rất nhiều tội phạm kinh tế như buôn lậu,

gian lận, tham nhũng [3].

Cùng với các loại ma túy gây hậu quả nghiêm trọng tới đời sống xã hội

như thuốc phiện và các chất nhóm Opiat, các chất kích thích thần kinh nhóm

Amphetamine, nhóm Cocain, các thuốc an thần gây ngủ nhóm Benzodiazepine,

các thuốc an thần gây ngủ nhóm Barbiturat, hiện nay loại ma túy gây ảo giác Cần

sa đang ngày càng được giới trẻ sử dụng nhiều.

Người sử dụng cần sa có thể bị rối loạn thần kinh, gây mất thăng bằng,

chóng mặt, rối loạn tình dục, làm giảm khả năng sinh sản, làm trụy thai, chết thai

thậm chí gây rối loạn nhiễm sắc thể nếu sử dụng lâu dài. Từ cần sa người 61 chất

khác nhau, với thành phần chủ yếu là THC (delta 9 –tetrahydrocannabinol), CBN

(canabinol), CBD (cannabidiol). Trong đó THC là hoạt chất chính gây ra tác dụng

tâm lý tới người sử dụng cần sa.[16]

Cần sa được dùng chủ yếu bằng cách hút. Sau khi hút 24 giờ, khoảng 50%

lượng THC bị đào thải dưới dạng chuyển hóa, 50% còn lại được phân bố trong

toàn cơ thể, chủ yếu ở các mô mỡ, sau đó bị đào thải từ từ trong những ngày tiếp

theo. Khi bài tiết trong nước tiểu, chủ yếu là các sản phẩm oxy hóa THC-COOH

(11-nor-9-cacboxyl-delta-9-tetrahydrocannabinol) và các sản phẩm liên hợp với

một hoặc hai phân tử axit glucuronic của THC-COOH [3]. Đây chính là các đối

tượng để kiểm tra việc sử dụng cần sa.

1

Việc phân tích THC-COOH trong nước tiểu có thể thực hiện bằng phân

tích miễn dịch, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) hay bằng sắc ký khí (GC), tuy

nhiên HPLC là phương pháp tốn kém hơn do giá thành dung môi tương đối đắt.

Phương pháp sắc ký khí có hiệu quả tách rất cao, thời gian phân tích nhanh, độ

nhạy và độ chọn lọc cao. Vì thế chúng tôi lựa chọn sử dụng thiết bị sắc ký khí

khối phổ để xác định THC-COOH.

Từ hiện trạng sử dụng và mức độ nguy hại mà cần sa đem đến cho người

sử dụng nó, đồng thời để phục vụ cho công tác giám định ma túy, đề tài này

chúng tôi tập trung “Nghiên cứu quy trình giám định 11-nor-9-cacboxyl-delta-

9-tetrahydrocannabinol trong nước tiểu của người bằng thiết bị sắc ký khí khối

phổ” nhằm kiểm tra phát hiện đối tượng sử dụng cần sa.

2

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Cần sa, các chế phẩm từ cần sa và các hoạt chất chính của cần sa

1.1.1. Cần sa

Cây cần sa được trồng phổ biến ở những vùng nhiệt đới từ hàng trăm năm

nay nhằm mục đích lấy sợi gai và là chất gây ra tác dụng tâm lý. Tại hầu hết các

nước trên thế giới, việc trồng trọt và buôn bán cây cần sa bị coi là bất hợp pháp vì

đã được đưa vào danh mục các chất ma túy bị cấm. Tuy nhiên, nó vẫn được trồng

bất hợp pháp ở nhiều vùng thuộc Bắc Mỹ, Nam Mỹ, khu vực Caribe, châu Phi và

Đông Nam Á. Châu Mỹ chiếm khoảng 55% sản lượng trên toàn cầu năm 2006,

sau đến Châu Phi (khoảng 22%) [21]. Ở Việt Nam, nó còn có tên gọi là cây gai

dầu, trước đây mọc nhiều ở khu vực Long Xuyên, Châu Đốc.

Bộ phận chứa hoạt chất có tác dụng trên hệ thần kinh là lá, quả và hoa. Các

bộ phận này được thu hoạch riêng, phơi khô, ép thành bánh hoặc bó lại để sử

dụng bằng cách hút, đôi khi dùng đường uống. Dưới đây là các đặc điểm hình

thái đặc trưng của cần sa [21]:

3

Hình 1.1. Các đặc điểm hình thái đặc trưng của cây cần sa

A - Đặc điểm đặc trưng của hoa cần sa đực

B - Đặc điểm đặc trưng của hoa cần sa cái

1 - Chùm nhị hoa 8 - Hạt cần sa có lá bắc

2 - Nhị hoa (nhị khác và ngắn hơn) 9 - Hạt cần sa không có lá bắc

3 - Nhị hoa 10 - Hạt cần sa (nhìn ngang)

4 - Hạt phấn hoa 11 - Hạt cần sa (hình cắt ngang)

4

5 - Nhụy hoa cái có lá bắc 12 - Hạt cần sa (hình bổ dọc)

6 - Nhụy hoa cái không có lá bắc 13 - Hạt cần sa đã lột vỏ

7 - Bầu nhụy hoa cái (hình bổ dọc)

Tại một số nước đã xuất hiện hiện tượng trồng trái phép cần sa trong nhà,

có thể trồng theo phương pháp thủy canh, không cần đất mà sử dụng đèn chiếu

sáng nhằm qua mặt các cơ quan an ninh cho thấy mức độ phức tạp và khó khăn

trong công tác điều tra phòng chống tội phạm.

Hiện nay, cần sa được sử dụng ở rất nhiều nơi, đặc biệt là bộ phận những

người trẻ tuổi. Cần sa thường được cuộn thành điếu giống như điếu thuốc lá để

hút nhằm tạo cảm giác hưng phấn. Một điếu cần sa nhỏ có thể được bán với giá

thành rất đắt so với thuốc lá.

Hình 1.2. Cần sa trồng trong nhà

1.1.2. Các chế phẩm từ cần sa

Trong nông nghiệp cây cần sa đã được sử dụng để lấy sợi từ lâu. Các sản

phẩm hợp pháp cần sa gồm có hạt cần sa, dầu từ hạt cần sa và tinh dầu cần sa [9].

5

Các chế phẩm từ cần sa được sản xuất với các quy trình khác nhau và cách

chuyển hóa khác nhau để nhằm mục đích buôn lậu và sử dụng bất hợp pháp, các

chế phẩm và sản phẩm trái phép của cần sa gồm ba loại chính là: Cây cần sa,

nhựa cần sa và dầu cần sa do hàm lượng THC cao.

Nhựa cần sa là sản phẩm chế biến bằng cách loại bỏ hạt, sợi, hàm lượng

THC đạt 2-10% [4]. Nhựa cần sa được sản xuất tại khoảng 65 nước trên thế giới,

chủ yếu là tại các nước thuộc khu vực Bắc Phi và Tây-Nam Á, đặc biệt là

Afghanistan và Pakistan [21].

Cần sa lỏng là dịch chiết lỏng của cần sa thực vật hoặc nhựa cần sa, với

dụng cụ chiết tương tự như chiết soxhlet. Các dung môi hữu cơ thường dùng là

etanol, clorofom, n-hexan, ete dầu hỏa, cần sa lỏng chứa THC tới 10-30%. [16]

1.1.3. Tác hại của việc sử dụng cần sa

Cần sa gây ra hàng loạt những biến đổi về tâm lý và hành động ở người sử

dụng, thường tạo ra những khoái cảm, hưng phấn, nói nhiều. Nếu như người

nghiện heroin chỉ trở nên hung dữ khi lên cơn thèm thuốc thì người nghiện cần sa

có thể trở nên hung dữ ngay cả khi đang hưng phấn. Khi sử dụng cần sa, các cơ

quan cảm giác như thị giác, thính giác, xúc giác và vị giác bị kích thích mạnh dẫn

đến ảo giác, trí nhớ lẫn lộn, không phân biệt được quá khứ, hiện tại. Người

nghiện có thể quên đi mọi lo lắng, ưu tư, cảm thấy mình trôi nổi, bồng bềnh,

không quan tâm đến việc gì, không có mục đích rõ ràng. Từ đó dẫn đến những

trang thái bất thường về hành vi, không làm chủ được các hoạt động của bản thân.

Sử dụng cần sa lâu dài có thể bị rối loạn thần kinh, tình dục, giảm khả năng sinh

sản, gây ra trụy thai, chết thai hay rối loạn nhiễm sắc thể. Cần sa có thể gây ra bất

tỉnh, thậm chí dẫn đến tử vong.

Bên cạnh đó cần sa cũng có một vài công dụng dùng trong y học như

chống lại tác dụng gây nôn của các chất hóa trị liệu chống ung thư, làm thư giãn

cơ, chống co giật, hạ nhãn áp. Tuy nhiên việc sử dụng cần sa cho mục đích y học

cần được kiểm soát chặt chẽ.

6

1.1.4. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong khoa học hình sự

Bảng 1.1. Các thành phần hóa học của cần sa có ý nghĩa trong KHHS [21]

(-)-Δ9-trans-Tetrahydrocannabinol

- Công thức phân tử: C21H30O2

Tetrahydrocannabinol, THC

- Khối lượng phân tử: 314,46 g/mol

- Gần như không tan trong nước (2,8 mg/l ở 23oC), tan tốt trong dung môi

etanol, clorofom, hexan.

- Dược lý: Giảm đau, kháng viêm,

chống nôn.

(-)-∆9-trans-Tetrahydrocannabinolic

- Công thức phân tử: C22H30O4

Acid, THCA

- Khối lượng phân tử: 358 g/mol

- Gần như không tan trong nước, tan

tốt trong dung môi etanol, clorofom,

hexan.

- Dược lý: Kháng khuẩn, kháng sinh.

Cannabinol, CBN

- Công thức phân tử: C21H26O2

- Khối lượng phân tử: 310,43 g/mol

- Gần như không tan trong nước, tan

tốt trong dung môi etanol, clorofom,

hexan.

- Dược lý: An thần, giảm đau, chống

co giật, kháng sinh, kháng viêm.

Cannabidiol, CBD

- Công thức phân tử: C21H30O2

- Khối lượng phân tử: 314,46 g/mol

- Gần như không tan trong nước, tan

tốt trong dung môi etanol, clorofom,

hexan.

- Dược lý: An thần, giảm đau, chống

co thắt, kháng viêm.

7

Cannabigerol, CBG

- Công thức phân tử: C21H32O2

- Khối lượng phân tử: 316,48 g/mol

- Dược lý: Kháng sinh, kháng viêm,

giảm đau, chống nấm.

Cannabivarin, CBV

- Công thức phân tử: C19H22O2

- Khối lượng phân tử: 282,38 g/mol

Cannabichromene, CBC

- Công thức phân tử: C21H30O2

- Khối lượng phân tử: 314,46 g/mol

- Dược lý: Kháng viêm, kháng sinh,

giảm đau, chống nấm,

Hàm lượng THC trong cần sa thực vật khoảng 0,5-5%. Các kết quả phân

tích hàm lượng THC trong cần sa thực vật ở Việt Nam khoảng 3-5%, tuy nhiên

trong một số mẫu, có thể đạt tới 10-12% [4].

Bảng 1.2. Hàm lượng THC thay đổi tùy vào các bộ phận của cây cần sa [21]

STT

Loại cây cần sa

Hàm lượng THC

1

Hoa cái

10-12%

2

Lá

1-2%

3

Thân

0,1-0,3%

4

Gốc

<0,03%

Hàm lượng THC của các sản phẩm cần sa (cây, nhựa và dầu) là tỷ lệ của

khối lượng hoạt chất THC trên khối lượng của các phần của cây cần sa sử dụng.

Ví dụ như một nghiên cứu ở Thụy Sĩ năm 2006 cho thấy 2/3 vụ bắt giữ cây

cần sa có hàm lượng THC trong cây cần sa từ 2 – 12 %, 2/3 số vụ bắt giữ nhựa

8

cần sa có hàm lượng THC từ 4 – 21 %, tùy thuộc vào điều kiện và kỹ thuật canh

tác cụ thể, còn quá trình chiết nhựa và nụ hoa cần sa có thể cho ra sản phẩm dầu

cần sa có hàm lượng THC lên tới 60% [10].

1.1.5. Thời gian phát hiện và đối tượng phân tích đối với người sử dụng cần sa

Chưa có nghiên cứu nào chỉ ra thời gian chính xác để phát hiện mẫu dương

tính với người sử dụng cần sa, bởi nó phụ thuộc nhiều yếu tố như loại mẫu, độ

nhạy của thiết bị phát hiện, tần suất, liều lượng, thời gian sử dụng lần cuối cùng,

hệ thống tiêu hóa, di truyền, tình trạng trao đổi chất, hệ thống bài tiết của mỗi cá

nhân, đồng thời còn những yếu tố khác tác động vào như bệnh tật hay sử dụng

cùng lúc các loại ma túy khác. Dưới đây là thời gian gần đúng có thể phát hiện

trên một số loại mẫu sau khi lấy mẫu đối với người sử dụng cần sa [5].

Bảng 1.3. Thời gian phát hiện trên các đối tượng mẫu

Mẫu

Nước tiểu Máu

Tóc

Nước bọt

Không chắc

Không có giá

Người sử dụng một lần

1-7 ngày

12-24 giờ

chắn

trị

Người sử dụng thường

7-100 ngày 2-7 ngày

Hàng tháng

0-24 giờ

xuyên

Có thể kiểm tra huyết tương, nước bọt, mẫu tóc, hơi thở để phát hiện cần

sa trong cơ thể người sử dụng, tuy nhiên việc xét nghiệm nước tiểu được thực

hiện với chi phí rẻ hơn, việc lấy mẫu nhanh chóng, thời gian phát hiện lâu hơn và

xử lý mẫu cũng dễ dàng hơn so với mẫu máu, mẫu tóc, nước bọt và hơi thở. Vì

thế, lấy mẫu nước tiểu sẽ thuận lợi đối với điều kiện tại các phòng thí nghiệm

giám định Hóa học của các tỉnh thành trong cả nước cũng như Viện KHHS của

Bộ công an hiện nay.

Thời gian để phát hiện được cần sa trong nước tiểu phụ thuộc rất lớn vào

tần suất sử dụng, đối với những người sử dụng thường xuyên (trên một lần một

tuần), dạng chuyển hóa của THC là THC-COOH trong nước tiểu nồng độ có thể

đạt hàng trăm ng/ml [5].

9

Xét nghiệm nước tiểu có thể dựa trên sự phát hiện THC-COOH, một dạng

chuyển hóa của THC, nó là thành phần mang hoạt tính dược lý chính của cần sa.

Các nghiên cứu trên cơ thể người chỉ ra rằng, 80-90% tổng số THC được bài tiết

trong vòng 5 ngày, khoảng 20% trong nước tiểu và 65% trong phân [11]. Trong

huyết tương nồng độ THC cao nhất sau khi hút một liều thường rơi vào 2ng/ml

trong 4-6 giờ, và có thể phát hiện sau vài phút. Nước tiểu của người sử dụng cần

sa có chứa THC-COOH ở cả dạng tự do và dạng liên hợp với axit glucuronic.

THC có thể tích lũy trong mô mỡ, tạo ra nồng độ bài tiết cao hơn và thời

gian phát hiện lâu hơn. Nếu có tiền sử sử dụng cần sa, xét nghiệm nước tiểu với

người sử dụng bình thường có thể phát hiện sau khi sử dụng 2 tuần, và có thể lâu

hơn với người sử dụng kinh niên. Bất kể thí nghiệm nào cũng cần đo cả dạng tự

do và dạng chuyển hóa, bao gồm cả thủy phân để tăng độ nhạy của phép phân

tích.

Hoạt chất THC có thể hấp thu qua niêm mạc đường tiêu hóa, tuy nhiên tốc

độ chậm và thất thường, mức độ hấp thu thường chỉ đạt 6-20% qua đường tiêm

tĩnh mạch, 18% qua đường hút. Do đặc tính ưa mỡ cao nên THC có thể phân bố

rộng rãi trong toàn bộ cơ thể. THC chuyển hóa ở phổi nếu dùng bằng cách hút, ở

gan nếu uống. [4]

Mặc dù trong cần sa có trên 60 chất Cannabis được tìm thấy nhưng hoạt

chất chính tạo ra tác dụng của cần sa là THC, CNB và CBD. Để xác định việc sử

dụng cần sa, cần thiết phải kiểm tra dạng chưa chuyển hóa của các chất

cannabinoid chính là THC, CBN, CBD. Tuy nhiên lượng chất chưa chuyển hóa

này trong nước tiểu rất thấp, với THC chỉ khoảng 0,005-0,01% liều sử dụng, và

chỉ đào thải trong vòng vài giờ [4]. Bởi vậy hiện nay đối tượng giám định chủ

yếu

là sản phẩm chuyển hóa của THC

là 11-nor-9-cacboxyl-delta-9-

tetrahydrocannabinol (THC-COOH).

1.1.6. THC và sự chuyển hóa THC trong nước tiểu

1.1.6.1. Cấu tạo THC

- Công thức phân tử: C21H30O2

10

- Công thức cấu tạo:

1.1.6.2. Tính chất vật lý THC

- Ở dạng tinh khiết, THC ở trạng thái rắn kết tinh khi lạnh, dạng nhớt và

dính khi ấm.

- Tan rất ít trong nước nhưng tan tốt trong hầu hết các dung môi hữu cơ.

- Khối lượng phân tử: M = 314,46 g/mol. - Nhiệt độ sôi: 157oC - Độ tan trong nước: 0,0028 mg/ml ở 20oC

1.1.6.3. Tính chất hóa học và sự chuyển hóa THC

THC tan nhiều trong hầu hết các dung môi hữu cơ, đặc biệt là chất béo và

rượu. THC không bền với nhiệt độ cao và ánh sáng, dễ cháy. Nó tác dụng với

oxoaxit hay axit cacboxylic tạo ra este và nước. Nó có thể bị oxy hóa thành

anđehit hoặc xeton dưới điều kiện khác nhau.

Khi sử dụng cần sa, hoạt chất chính trong cần sa là THC bị hấp thụ vào cơ

thể. THC chứa một nhóm –OH được chuyển hóa trong gan, qua quá trình hydro

hóa nhóm –CH3 tạo thành THC-OH, thông qua quá trình oxy hóa một nhóm –OH

xúc tác bởi các enzyme Cytochrome P450 (CYPs) trong gan tạo thành THC-

COOH chứa một nhóm –COOH. Sau đó THC-COOH chứa 2 nguyên tử Hydro

linh động, tác dụng với axit glucuronic trong cơ thể người thành dạng muối của

axit glucuronic, và được thải ra ngoài bằng đường nước tiểu sau khi thận bài tiết.

Quá trình chuyển hóa được thể hiện qua sơ đồ sau:

11

Hydro hóa

THC-OH

THC

Oxy hóa

THC-COOH

THC-COOH

mono/diglucuronic

Hình 1.3. Sơ đồ quá trình chuyển hóa THC trong nước tiểu

1.1.7. THC-COOH

THC-COOH được hình thành trong cơ thể do quá trình oxy hóa THC bởi

các enzyme của gan. Sau đó, tiếp tục chuyển hóa thành dạng glucuronic, tạo

thành một hợp chất tan được trong nước và có thể dễ dàng bài tiết trong cơ thể

người [13].

Công thức phân tử: C21H28O4

Khối lượng phân tử: 344,445 g/mol

Công thức cấu tạo:

12

Thời gian bán hủy: 5,2-6,2 ngày [8] Do đặc điểm công thức cấu tạo có 2 nguyên tử H+ linh động của nhóm –

OH và nhóm –COOH nên THC-COOH có các phản ứng hóa học đặc trưng của nguyên tử H+.

1.2. Một số phương pháp phân tích THC-COOH

- Phương pháp sắc ký bản mỏng: Việc định tính các cấu tử dựa vào tỷ số

giữa độ di chuyển của chất so với độ di chuyển của dung môi trong cùng thời

gian chạy sắc ký. Sau đó, dựa vào diện tích pic trong mẫu để bán định lượng cấu

tử cần phân tích.

- Phân tích miễn dịch: Ưu điểm của phương pháp là không cần chiết và

làm sạch mẫu, thời gian phân tích nhanh và có thể áp dụng với một lượng mẫu

lớn. Các kháng thể sử dụng trong các kít thử thường có hoạt tính cao với sản

phẩm chuyển hóa THC-COOH, tuy nhiên còn có tác dụng chéo đối với các sản

phẩm chuyển hóa khác. Vì thế phương pháp này ít khi được sử dụng do tốn kém

và không tin cậy.

Hiện nay, phương pháp sử dụng thiết bị sắc ký khí và sắc ký lỏng được

dùng rộng rãi để phân tích THC cũng như THC-COOH vì có ưu điểm hiệu quả

tách tốt, độ nhạy và độ chính xác cao.

1.2.1. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký lỏng

Để phân tích THC-COOH trên thiết bị HPLC, các bước chuẩn bị, xử lý

mẫu cũng tương tự như đối với sắc ký khí được trình bày trong mục 1.2.2 phía

dưới. Tuy nhiên đối với phương pháp này, chúng ta không cần thực hiện giai

đoạn dẫn xuất mẫu. Vì với thiết bị HPLC có thể phân tích được cả các hợp chất

hữu cơ dễ bay hơi và khó bay hơi.

Sắc ký lỏng là kỹ thuật tách chất dựa trên cả hiện tượng vật lý và hóa học.

Trong quá trình sắc ký, trong cột sắc ký luôn xảy ra cân bằng động giữa pha tĩnh

và pha động, nghĩa là sự vận chuyển và phân bố chất tan luôn được lặp đi lặp lại

giữa hai pha. Chất phân tích được di chuyển từng lớp qua pha tĩnh từ đầu đến

cuối cột sắc ký theo pha động với dòng chảy liên tục, tốc độ và thành phần nhất

13

định, hay gradient. Do tính chất và cấu trúc của mỗi phân tử chất tan là khác nhau

nên tốc độ di chuyển của mỗi chất cũng khác nhau. Khi ở trong pha động, nó dịch

chuyển theo tốc độ của dòng pha động, còn khi ở trên pha tĩnh nó lại bị pha tĩnh

giữ lại trong một khoảng thời gian nhất định trong cột tách sắc ký, thời gian này

phụ thuộc vào bản chất sắc ký của cột pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của mỗi chất

tan, đồng thời cũng phụ thuộc vào bản chất của thành phần pha động dung để rửa

giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Vì thế trong quá trình sắc ký có chất tan bị lưu

giữ lâu, có chất tan bị lưu giữ ít trên cột. Điều đó dẫn đến kết quả có quá trình

tách các chất xảy ra trên cột sắc ký.

Tùy theo tính chất và hàm lượng chất phân tích, trong sắc ký lỏng người ta

đưa ra một số phương pháp cơ bản sau:

- Sắc ký lỏng pha thường (NP-HPLC).

- Sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC).

- Sắc ký trao đổi ion.

- Sắc ký rây phân tử.

- Sắc ký ái lực.

Mỗi phương pháp có đặc điểm riêng về pha tĩnh và pha động, detector

cũng như cách vận hành. [2]

Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc

ký lỏng đã công bố:

14

Bảng 1.4. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký lỏng

Khoảng

Tác nhân và nhiệt độ

Thiết bị phân

LOD

LOQ

H

STT

Chiết

Nội chuẩn

tuyến tính

thủy phân

tích

(ng/ml)

(ng/ml)

(%)

(ng/ml)

1

5-1000

Pha rắn

LC-MS-MS

THC-COOH-d3

5

10

-

[13]

β-glucuronidase ở 37oC/20 giờ

(r=0,9996)

2

-

HPLC

-

10

-

-

[6]

KOH 10M 50oC/20 phút

r=0,9995

10-10000

3

-

-

Pha lỏng

LC-MS-MS

THC-COOH-d3

-

(r=0,991)

[23]

β-glucuronidase/ arylsulfatase 37oC/5 giờ

15

Dưới đây là sắc ký đồ của THC-COOH được phân tích trên thiết bị sắc ký lỏng

khối phổ.

Hình 1.4. Sắc đồ của THC-COOH khi phân tích bằng LC- MS

Hình 1.5. Phổ khối của THC-COOH khi phân tích bằng LC-MS

16

1.2.2. Phương pháp phân tích THC-COOH bằng sắc ký khí

1.2.2.1. Thủy phân mẫu

Trên 80% lượng THC-COOH có trong nước tiểu dưới dạng liên hợp

glucuronic. Do vậy phải tiến hành thủy phân để tách gốc glucuronic ra khỏi THC-

COOH. Đối với mẫu cần sa, thủy phân trong môi trường kiềm cho hiệu quả cao

và ổn định hơn các phương pháp thủy phân trong môi trường axit và men.

1.2.2.2. Phương pháp chiết

Sau khi tiến hành thủy phân để tách THC-COOH ra khỏi dạng liên hợp của

nó với axit glucuronic, thì việc quan trọng tiếp theo là phải tách chúng ra khỏi

nước tiểu, hiệu quả tách càng cao đồng nghĩa với việc phân tích càng chính xác.

Có nhiều phương pháp tách chiết, tuy nhiên cần lựa chọn phương pháp sao cho

phù hợp với đối tượng mẫu, yêu cầu phân tích cũng như điều kiện phòng thí

nghiệm. Một số phương pháp phù hợp để chiết THC-COOH từ nước tiểu là chiết

lỏng-lỏng, chiết pha rắn, vi chiết pha rắn.

Quá trình tách trong chiết pha rắn cũng tương tự như chiết lỏng- lỏng và

phương pháp sắc ký, chủ yếu dựa trên định luật phân bố chất tan giữa hai pha

không trộn lẫn vào nhau. Chiết pha rắn thuận lợi hơn so với việc chiết pha lỏng,

nhưng trong đề tài này để phù hợp với điều kiện nghiên cứu tại nhiều phòng thí

nghiệm Kỹ thuật hình sự ở Công an các tỉnh thành trong cả nước, chúng tôi lựa

chọn chiết pha lỏng để tách THC-COOH ra khỏi nước tiểu.

1.2.2.3. Kỹ thuật dẫn xuất

Dẫn xuất: Kỹ thuật dẫn xuất hóa đóng vai trò quan trọng trong sắc ký khí

nhằm phân tích các chất khó bay hơi, đặc biệt là các hợp chất chứa một hoặc

nhiều nhóm chức, mà có khả năng hấp phụ đặc trưng gây ra sự giãn pic và làm

biến dạng pic, đặc biệt ở nồng độ thấp. Việc dẫn xuất hóa không chỉ tạo nên các

pic cân đối mà còn làm tăng độ phân giải, giúp định lượng chính xác. Các kiểu

dẫn xuất thường dùng là trialkyl silan hóa, este hóa, alkyl hóa…[1]

THCCOOH là hợp chất phân cực, chứa proton H+, nên sử dụng dẫn xuất

alkylsilyl là phù hợp. Trong quá trình dẫn xuất, phản ứng phải được thực hiện

17

dưới điều kiện không có nước, trong lọ thủy tinh có nút xoáy với đệm teflon.

BSTFA ( N,O-bis- (trimetylsilyl) trifloaxetamit) được sử dụng nhiều trong sắc ký

khí, thúc đẩy sự tạo thành các ete enol-TMS ngoại trừ các nhóm keton được bảo

vệ. Phản ứng xảy ra chậm ở nhiệt độ phòng, nên có thể thúc đẩy bằng cách thêm

xúc tác trimetylclosilan (TMCS).

1.2.2.4. Phương pháp phân tích định tính và định lượng

Việc phân tích THC-COOH trong nước tiểu phù hợp với khả năng của

thiết bị sắc ký khí (GC) kết nối detector khối phổ (MS), vì thế kết quả phân tích

có độ chính xác cao.

Nguyên tắc hoạt động của sắc ký khí: Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự

phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên,

có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha

tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha

tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Trong sắc ký khí, mẫu được tách do sự phân bố giữa pha tĩnh và pha động

nhờ cơ chế hấp phụ, phân bố hoặc kết hợp cả hai cơ chế này.

Khi pha tĩnh là một chất hấp phụ rắn, thì kỹ thuật phân tích gọi là sắc ký

khí - rắn (GSC). Khi pha lỏng được gắn lên bề mặt của chất mang trơ hoặc được

phủ dưới dạng một lớp phim mỏng lên thành cột mao quản, thì kỹ thuật này gọi là

sắc ký khí -lỏng (GLC) [1].

Sắc ký khí là phương pháp có hiệu quả tách rất cao, thời gian phân tích

nhanh, đối với những detector phù hợp, giới hạn phát hiện của phương pháp có

thể đạt 0,1ppb.

Tuy nhiên phương pháp có hạn chế là chỉ phù hợp với các hợp chất dễ bay

hơi [2]. Chính vì vậy, trước khi phân tích THC-COOH bằng GC, cần dẫn xuất nó

để tạo hợp chất dễ bay hơi nhằm phù hợp với phương pháp.

Sơ đồ thiết bị sắc ký khí và vận hành như sau:

18

Thiết bị sắc ký khí

5 6

2 3

7 1 4

Sơ đồ chức năng thiết bị sắc kí khí 1- Nguồn khí mang 5 - Detector

2- Điều chỉnh áp suất 6 - Máy ghi 3 - Bộ phận bơm mẫu 7 - Phần mềm và computer

4- Cột tách

Hình 1.6. Sơ đồ thiết bị sắc ký khí và vận hành

- Phương pháp phân tích định tính:

Nguyên tắc của các phép phân tích định tính là dựa vào một yếu tố đặc

trưng của tín hiệu tương ứng với mỗi cấu tử để nhận diện chúng. Trong sắc kí khí

người ta sử dụng yếu tố đặc trưng là thời gian lưu để nhận diện các cấu tử bằng

cách so sánh thời gian lưu của chúng với thời gian lưu của chất chuẩn. Sử dụng

phương pháp GC/MS, ngoài việc nhận diện các cấu tử thông qua yếu tố thời gian

lưu, chất cần phân tích còn được nhận diện thông qua việc so sánh các mảnh phổ

khối đặc trưng và cường độ vạch phổ của chất chuẩn với chất cần phân tích [1].

- Phương pháp phân tích định lượng:

Trong sắc kí, hai phương pháp thường được sử dụng để định lượng chất

phân tích là phương pháp nội chuẩn và phương pháp ngoại chuẩn.

Phương pháp nội chuẩn dựa trên sự so sánh cường độ tín hiệu của

chất cần phân tích với tín hiệu của chất nội chuẩn. Các chất dùng làm chất nội

chuẩn là các chất không có trong thành phần của mẫu, cho tín hiệu ổn định và

khoảng thời gian lưu nằm gần khoảng thời gian lưu của chất phân tích. Chất nội

chuẩn được đưa vào mẫu cần phân tích với nồng độ đã biết. Khi tính toán máy

sẽ dựa vào tỉ lệ tín hiệu của chất cần phân tích với tín hiệu của chất nội chuẩn

19

để tính ra nồng độ. Phương pháp này có độ chính xác cao vì nó loại bỏ được các

yếu tố gây ảnh hưởng đến tín hiệu phân tích (yếu tố nền, sự sai khác về thể tích

bơm mẫu giữa các lần đo).

Nguyên tắc của phương pháp ngoại chuẩn là so sánh trực tiếp độ lớn của

các tín hiệu (diện tích hay chiều cao pic thu được) trong mẫu chưa biết với dung

dịch chuẩn của chất đó.

Trước tiên cần bơm dung dịch chuẩn của chất cần phân tích với các nồng

độ thích hợp. Từ các kết quả thu được ta xây dựng đường chuẩn có dạng: y = a +

bx. Đo diện tích (hoặc chiều cao) pic của chất cần phân tích (giá trị y) và áp vào

đường chuẩn ta có thể tính ra nồng độ cấu tử cần phân tích (giá trị x).

Với thiết bị phân tích hiện đại GC-MS Agilent 7000 các thông số làm việc

của máy như nhiệt độ, tốc độ dòng…có độ ổn định tốt, các lần bơm mẫu có độ lặp

lại cao nên chúng tôi dùng phương pháp ngoại chuẩn để phân tích định lượng. [1]

1.3. Một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký

khí đã được công bố

Dưới đây là bảng một số các nghiên cứu về phân tích THC-COOH với các

điều kiện về thủy phân, phương pháp chiết, dung môi chiết, chất dẫn xuất, thiết bị

phân tích, chất nội chuẩn sử dụng, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, hiệu

suất thu hồi và khoảng tuyến tính của đường chuẩn.

20

Bảng 1.5. Một số nghiên cứu phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng sắc ký khí

Khoảng

Tác nhân và nhiệt

Thiết bị

LOD

LOQ

H

STT

Chiết

Dẫn xuất

Nội chuẩn

tuyến tính

độ thủy phân

phân tích

(ng/ml)

(ng/ml)

(%)

(ng/ml)

1

0,875-900

THC-

Pha rắn

PFPA/PFPOH GC-MS

0,875

1,75

95

[18]

(r=0,993)

COOH-d9

2

Pha lỏng

10-100

THC-

MSTFA

GC-MS

1,0

1,7

-

[12]

KOH 10N 50-60oC/15phút NaOH 6M 56oC/20 phút

n-hexan/etylaxetat

(r=0,9998)

COOH-d9

Pha lỏng

3

1,2-1500

THC-

Metanol/ hỗn hợp

PFPA/PFPOH GC-MS

1,0

2,0

-

[19]

NaOH 6M to phòng/ 20 phút

(r=0,9978)

COOH-d9

n-hexan/etylaxetat

4

Pha lỏng

GC-

THC-

NaOH

BSTFA

-

-

5-50

-

[14]

n-hexan/etylaxetat

MS/MS

COOH-d3

5

87-

10-300

THC-

KOH 10M 60oC/15phút

-

-

Pha rắn

TMS

GC-MS

[22]

97

(r=0,999)

COOH-d3

THC-

6

0,1-500

COOH-d3;

β-glucuronidase

Pha rắn

MSTFA

GC-MS

3

3

-

[7]

(r=1)

THC-

COOH-d9

21

1.4. Nguyên tắc phương pháp nghiên cứu xác định THC-COOH bằng GC-MS

Hoạt chất chính của cần sa khi được đưa vào trong cơ thể người là THC,

qua quá trình chuyển hóa sẽ chuyển thành THC-OH rồi sau đó chuyển sang dạng

liên hợp glucuronic của THC-COOH, tiến hành thủy phân trong môi trường kiềm

mạnh để chuyển dạng liên hợp glucuronic của THC-COOH về dạng tự do, sau đó

dẫn xuất THC-COOH bằng chất dẫn xuất BSTFA với chất dẫn xuất TMCS để

làm tăng khả năng phản ứng.

Chất dẫn xuất BSTFA chứa nhóm -TMS thay thế cho 2 nguyên tử hydro

linh động của THC-COOH tạo thành THC-COOH-2TMS và được phân tích trên

GC-MS. Quá trình phản ứng được thể hiện qua sơ đồ sau:

Hình 1.7. Sự tạo thành và dẫn xuất THC-COOH

1.5. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS

THC-COOH-2TMS với khối lượng phân tử m/z = 488, sau khi đưa vào phân

tích trên GC-MS có thể phân mảnh theo cơ chế sau:

22

Hình 1.8. Cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS

23

CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM

2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Mục tiêu nghiên cứu

Để xác định THC-COOH trong nước tiểu, cần khảo sát các điều kiện thủy

phân, môi trường pH để chiết lỏng - lỏng, dung dịch chiết, hiệu suất chiết, chất

dẫn xuất và điều kiện dẫn xuất trước khi đưa vào phân tích bằng máy GC-MS.

Phân tích hàm lượng THC-COOH trong nước tiểu bằng quy trình đã lựa

chọn được trên GC-MS.

2.1.2. Đối tượng nghiên cứu

Các mẫu nước tiểu nghi sử dụng cần sa. Các mẫu nước tiểu đều được thử

phản ứng miễn dịch với kít thử cần sa. Thông tin về một số mẫu nước tiểu bị thu

giữ theo lời khai của đối tượng như sau:

Hình 2.1. Một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ

24

Bảng 2.1. Thông tin một số mẫu nước tiểu bị bắt giữ

Ký Thể tích Thông tin mẫu Đặc điểm hiệu mẫu (theo lời khai của đối tượng)

Đậm màu, đục Lấy mẫu sau 7 ngày sử dụng bằng cách M1 250 ml (Dương tính) hút, hút không thường xuyên.

Đậm màu, đục Lấy mẫu sau 5 ngày sử dụng bằng cách M2 250 ml (Dương tính) hút, hút không thường xuyên.

Nhạt màu, không Lấy mẫu sau 1 ngày sử dụng bằng cách M3 200 ml đục (Dương tính) hút, hút không thường xuyên.

Nhạt màu, không Lấy mẫu sau 2 ngày sử dụng bằng cách M4 230 ml đục (Dương tính) hút, hút thường xuyên trong 1 năm.

Nhạt màu, không Lấy mẫu sau 3 ngày sử dụng bằng cách M5 80 ml đục (Dương tính) hút, hút 5 lần.

Đậm màu, không Lấy mẫu sau 5 ngày sử dụng bằng cách M6 90 ml đục (Âm tính) hút, mới hút 1 lần.

2.1.3. Nội dung nghiên cứu

Sau khi dẫn xuất THC-COOH, tiến hành bơm dung dịch này để phân tích

trên GC-MS. Cùng với sự kế thừa các nghiên cứu về phân tích THC-COOH, để

xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong nước tiểu bằng phương pháp sắc

ký khí khối phổ, trong luận văn này các vấn đề sau đây được nghiên cứu:

- Lựa chọn và khảo sát lại điều kiện thủy phân và dẫn xuất.

- Khảo sát dung môi chiết.

- Khảo sát môi trường chiết (pH).

- Đánh giá hiệu quả chiết.

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn phát hiện (LOQ)

- Xây dựng đường chuẩn của THC-COOH.

- Đánh giá tính phù hợp của phương pháp: Độ lệch chuẩn tương đối, hiệu

suất thu hồi…

25

- Ứng dụng: Phân tích trên các mẫu nước tiểu nghi sử dụng Cần sa bị bắt giữ.

2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1. Hóa chất

* Mẫu chuẩn THC-COOH Arlesheim, Thụy Sỹ do Liên hợp quốc cấp với

lượng chính xác là 0,1 mg.

* Các hóa chất còn lại đều là hóa chất tinh khiết dùng trong phân tích (đạt

tiêu chuẩn PA):

- Dung dịch HCl 36,5% (dùng để pha dung dịch HCl 2M và dung dịch

đệm), (Merck, Đức).

- NaOH, axit xitric (C6H8O7.H2O) để pha các dung dịch đệm Xitrat pH = 1,

pH = 2, pH = 3, pH =4.

- KOH (dùng để pha dung dịch KOH 10M).

- Muối khan Na2SO4 (Merck, Đức) được nung ở 2500 C trong 2h trước khi

sử dụng.

- Nước cất hai lần.

- Khí N2 kỹ thuật 99% dùng để đuổi dung môi.

- Khí He tinh khiết dùng làm khí mang cho thiết bị GC/MS.

- Chất dẫn xuất N,O-bis- (trimetylsilyl) trifloaxetamit (BSTFA) chứa 1%

trimetylclosilan (TMCS) hãng Sigma-Aldrich.

- Các dung môi tinh khiết: Xyclohexan, etylaxetat, dietylete, methanol, n-

hexan, isooctane, metylencloride, 2-propanol, (Merck, Đức).

- Kít thử miễn dịch Acon, Mỹ.

* Cách pha các dung dịch chuẩn và dung dịch đệm như sau:

+ Dung dịch chuẩn gốc THC-COOH nồng độ 2000 ng/ml được chuẩn bị

như sau: 0,1 mg chuẩn THC-COOH được pha với hỗn hợp dung môi n-

hexan/etylaxetat (9:1, v/v), định mức đến 50 ml. Dùng dung dịch chuẩn này để

pha loãng với các dung dịch chuẩn có nồng độ nhỏ hơn nằm trong khoảng từ 10 ÷

2000 ng/ml bao gồm: 10; 50; 250; 500; 1000; 1500; 2000 ng/ml. Các dung dịch

chuẩn này sau đó được làm khô bằng dòng khí nitơ, thêm dung dịch BSTFA chứa

26

1% TMCS rồi dẫn xuất và phân tích trên sắc ký. Sau khi phân tích và dựng đường

chuẩn, sẽ sử dụng các kết quả nằm trong khoảng tuyến tính của đường chuẩn cho

mục đích phân tích định lượng THC-COOH có mặt trong nước tiểu của đối tượng

sử dụng cần sa.

+ Dung dịch đệm pH=1: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất

sau: 0,388 gam NaOH; 1,019 gam axit xitric và 1,547 ml dung dịch HCl 36,5%,

thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.

+ Dung dịch đệm pH=2: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất

sau: 0,562 gam NaOH; 1,608 gam axit xitric và 1,470 ml dung dịch HCl 36,5%,

thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.

+ Dung dịch đệm pH=3: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất

sau: 0,806 gam NaOH; 2,118 gam axit xitric và 1,263 ml dung dịch HCl 36,5%,

thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.

+ Dung dịch đệm pH=4: Cho vào bình định mức loại 250 ml các hóa chất

sau: 1,120 gam NaOH; 3,724 gam axit xitric và 0,931 ml dung dịch HCl 36,5%,

thêm 100 ml nước cất, lắc cho tan rồi định mức đến 250 ml.

Tất cả các dung dịch đệm sau khi pha đều được kiểm tra lại bằng máy đo pH.

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị

- Lọ thủy tinh có nắp loại 100 ml.

- Pipet, ống đong các loại, phễu chiết, cốc thủy tinh, đũa thủy tinh bình

định mức các loại.

- Máy đo pH Thermo scientific.

- Tủ sấy, tủ ấm. - Cân phân tích Sartorius CPA 225D có độ chính xác 10-5.

- Máy điều nhiệt Memmer, Germany.

- Máy cô quay Eyela, Japan.

- Máy siêu âm Branson 1510.

- Máy lắc Unitwist 300.

- Máy GC-MS Triple Quad 7000, USA.

27

- GC Agilent Techologies 7890A.

- Agilent Technologies 7693 Autosample.

- Cột HP-5MS-5% phenyl metyl silox (30m x 250µm x 0,25µm).

2.3. Phương pháp nghiên cứu

2.3.1. Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu.

Mẫu trắng được lấy từ những người khỏe mạnh, không sử dụng bất cứ loại

ma túy nào. Mẫu thực tế được lấy từ các đối tượng nghi đã sử dụng cần sa của các

đơn vị bắt được, sau đó kiểm tra sơ bộ bằng que thử, mẫu nào dương tính với cần

sa sẽ dùng để tiến hành phân tích.

Các mẫu đều ghi đầy đủ thông tin về tên, độ tuổi, tiền sử sử dụng và ngày

sử dụng gần đây nhất và ngày lấy mẫu. Các mẫu đều được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20oC đến khi phân tích.

2.3.2. Phương pháp xử lý mẫu

Phân tích với đối tượng mẫu phức tạp như mẫu sinh học, quá trình chuẩn

bị mẫu phải hết sức cẩn thận, đòi hỏi khắt khe và tốn nhiều thời gian nhất. Nó

quyết định đến nhiều đại lượng của phương pháp phân tích.

Để tăng độ nhạy của phép phân tích, quá trình thủy phân và chiết cần được

thực hiện cẩn thận. Trước khi thủy phân mẫu, cần đo thể tích, pH mẫu, quan sát

độ đục, độ tạo bọt, có thể lọc nếu nhiều cặn.

Mẫu được xử lý theo 3 bước như sau:

- Bước 1: Tiến hành thủy phân với mẫu nước tiểu: Lấy 10 ml nước tiểu vào

lọ thủy tinh, thêm 2ml dung dịch KOH 10M, đậy kín và thủy phân ở nhiệt độ và

thời gian được lựa chọn, điều chỉnh pH rồi tiến hành chiết.

- Bước 2: Mẫu sau khi được chiết, để phân lớp, tách phần dung dịch hữu cơ, loại nước bằng Na2SO4 khan, đem cô quay chân không ở nhiệt độ 40oC,

chuyển dịch cô vào lọ thủy tinh nhỏ, cô khô bằng dòng N2. Sau đó được dẫn xuất

trước khi phân tích để tăng độ nhạy phép phân tích.

- Bước 3: Mẫu sau khi làm bay hơi được cho thêm 20µl BSTFA (N,O-bis-

trimetylsilyl trifloaxetamit) chứa 1% TMCS (trimetylclosilan). Làm nóng dung

28

dịch ở nhiệt độ và thời gian được lựa chọn. Sau đó để nguội ở nhiệt độ phòng,

bơm 1µl để phân tích sắc ký khí.

2.4. Thực nghiệm

2.4.1. Khảo sát điều kiện phân tích trên thiết bị GC-MS Triple Quad 7000

Điều kiện làm việc trên GC-MS Triple Quad 7000 được khảo sát với cùng

chương trình làm việc, với cùng 1 mẫu chuẩn ở cùng một nồng độ theo 2 chương

trình nhiệt độ khác nhau.

Điều kiện làm việc:

- Thể tích bơm mẫu: 1µl

- Kiểu bơm: Không chia; Thời gian không chia: 0,75 phút

- Khí mang: He; Tốc độ dòng: 3 ml/phút; Kiểu đẳng dòng. - Kiểu va chạm điện tử EI+(Electron Impact): 70 eV

- Chế độ quét: Full scan/SIM; Khoảng m/z: 40-500 - Nhiệt độ buồng bơm mẫu Injector: 250oC - Nhiệt độ lò sang cột Transferline: 280oC - Nhiệt độ nguồn ion: 230oC

* Chương trình nhiệt độ thứ nhất (theo tham khảo quy trình của trung

tâm ma túy, viện KHHS)

- Nhiệt độ ban đầu của cột mao quản là 100oC, giữ trong 2 phút. Sau đó tăng đến 270oC với tốc độ 20oC/phút. Nhiệt độ cuối cùng 270oC được giữ trong

20 phút. Tổng chương trình nhiệt độ là 30,5 phút.

- Sơ đồ mô tả chương trình nhiệt độ:

200C/ phút 100oC (2 phút) 270oC (20 phút)

Tổng cộng: 30,5 phút

* Chương trình nhiệt độ thứ hai [14] - Nhiệt độ ban đầu của cột mao quản là 120oC, giữ trong 2 phút. Sau đó tăng nhanh đến 200oC với tốc độ 50oC/phút, tiếp tục tăng đến 280oC với tốc độ

29

15oC/phút. Nhiệt độ cuối cùng 280oC được giữ trong 5 phút. Tổng chương trình

nhiệt độ là 13,933 phút.

- Sơ đồ mô tả chương trình nhiệt độ:

500C/ phút 150C/ phút

120oC (2 phút) 280oC (5 phút) 200oC Tổng cộng: 13,933 phút

2.4.2. Khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất

- Điều kiện thủy phân: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu dương tính, đo pH bằng giấy quỳ, thêm 2 ml KOH 10M, thủy phân ở các nhiệt độ 50oC, 55oC và 60oC trong thời gian 20 phút bằng máy điều nhiệt. Để nguội, đo lại pH,

thêm dung môi chiết, thu dung môi chiết, loại nước, cô khô, dẫn xuất và bơm vào

sắc ký.

- Điều kiện dẫn xuất: Lấy vào 3 lọ sắc ký cùng một lượng chuẩn THC-

COOH nồng độ 250 ppb. Cô khô, bơm 20µl dẫn xuất BSTFA chứa 1% TMCS.

Làm nóng ở các điều kiện sau:

+ 90oC trong 20 phút. + 90oC trong 30 phút. + 100oC trong 20 phút.

2.4.3. Khảo sát dung môi chiết

Lấy vào lọ thủy tinh có nắp: 10 ml nước tiểu dương tính, thực hiện thủy

phân theo điều kiện đã chọn trên. Đo pH của mẫu, rồi điều chỉnh đến pH =2 bằng

dung dịch HCl 2M. Thêm 3ml dung dịch đệm pH = 2. Thêm 20 ml dung môi

chiết. Lắc bằng máy lắc trong 30 phút. Xử lý mẫu sau khi chiết, dẫn xuất, bơm 1

µl mẫu vào GC-MS để phân tích.

Qua tham khảo các tài liệu, các hệ dung môi sau được lựa chọn để khảo sát

dung môi chiết: iso-octan; n-hexan/etylaxetat (9:1,v/v); n-hexan/etylaxetat

(7:3,v/v); metylencloride/2-propanol/etyaxetat (1:1:3,v/v/v); etylaxetat/dietyete

(1:1, v/v); xyclohexan/etylaxetat (7:1,v/v). Mỗi thí nghiệm lặp lại ba lần và lấy

kết quả trung bình.

30

2.4.4. Khảo sát môi trường (pH) chiết

Sau khi lựa chọn được hệ dung môi tốt nhất cho việc chiết mẫu, cố định

dung môi và khảo sát môi trường pH trong khoảng pH = 1 ÷ 4.

Lấy vào lọ thủy tinh có nắp: 10 ml nước tiểu dương tính, thực hiện thủy

phân theo điều kiện đã chọn trên. Thêm dung dịch HCl 2M để điều chỉnh pH đến

các giá trị pH=1; pH=2; pH=3; pH=4. Thêm 3 ml dung dịch đệm có pH tương

ứng. Thêm 20 ml dung môi chiết đã tối ưu được, lắc bằng máy lắc trong 30 phút.

Xử lý mẫu sau khi chiết, bơm 1 µl mẫu vào GC-MS để phân tích. Mỗi thí nghiệm

lặp lại ba lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong chương 3.

2.4.5. Khảo sát hiệu suất chiết

Tiến hành độc lập hai thí nghiệm sau:

- Thí nghiệm I: Lấy vào lọ sắc ký dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb,

làm khô rồi đem dẫn xuất.

- Thí nghiệm II: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu trắng, thêm

50 µl dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb, điều chỉnh đến pH đã tối ưu bằng

dung dịch HCl 2M, thêm 20 ml dung môi đã tối ưu, tiến hành chiết và xử lý mẫu

trước khi phân tích trên GC-MS.

Tiến hành phân tích ở cùng một điều kiện trên GC-MS đã tối ưu được. Mỗi

thí nghiệm lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Kết quả được trình bày trong

chương 3.

2.4.6. Xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị

Giới hạn phát hiện của thiết bị (LOD) và giới hạn định lượng của thiết bị

(LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng

được với tín hiệu phân tích có ý nghĩa định lượng so với tín hiệu nền.

LOD và LOQ được xác định dựa vào sai số giữa các lần bơm một dung

dịch có nồng độ nhỏ của chất cần phân tích lên thiết bị. Ban đầu tiến hành bơm

lặp dung dịch này 7-10 lần. Sau đó, tính độ lệch chuẩn SD theo công thức:

31

Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn

xi: lượng chất phân tích trong mẫu lặp i

x: lượng chất phân tích trung bình trong mẫu lặp

N: số mẫu lặp lại

Với độ tin cậy cần đạt là 99% thì

Giới hạn phát hiện của thiết bị: LOD ≈ 3 x SD

Và giới hạn định lượng của thiết bị: LOQ ≈ 10 x SD

Trong luận văn này chúng tôi lặp lại 10 lần dung dịch chuẩn THC-COOH

có nồng độ 10 ng/ml (10 ppb) đã được dẫn xuất thành THC-COOH-2TMS trên

thiết bị GC-MS, thể tích bơm mẫu là 1 µl.

2.4.7. Xây dựng đường chuẩn

Mẫu chuẩn được chuẩn bị ở 7 nồng độ đã xác định khác nhau trong khoảng

từ 10-2000ng/ml, sau đó được dẫn xuất bằng BSTFA chứa 1% TMCS. Mỗi điểm

nồng độ tiến hành đo 3 lần để xác định và loại trừ những giá trị khác biệt.

2.4.8. Đánh giá phương pháp phân tích

- Độ chụm

Người ta thường sử dụng độ lệch chuẩn tương đối (RSD) hay còn gọi là hệ

số biến thiên (CV %) hơn là độ lệch chuẩn (SD) do có thể đánh giá được độ lệch

chuẩn chiếm bao nhiêu % giá trị trung bình và có cái nhìn rõ hơn về độ chụm của

các số liệu trong tập số liệu lặp lại [4]. % RSD được xác định theo công thức:

RSD (%) = . 100%

Để đánh giá RSD, tiến hành các thí nghiệm độc lập ở điểm đầu và điểm

cuối đường chuẩn. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung bình. Kết quả

được trình bày trong chương 3.

- Hiệu suất thu hồi

Mục đích để đánh giá hiệu suất thu hồi là kiểm tra xem chất chuẩn được

thêm vào được trộn đều với nền mẫu thế nào và tính chất của nền mẫu có giống

với nền mẫu ban đầu hay không. Sử dụng mẫu thêm chuẩn để đánh giá độ thu hồi

của phương pháp xử lý mẫu. Mẫu thực tế dương tính được thêm một lượng nhất

32

định chuẩn THC-COOH vào ở 2 mức nồng độ 50 ppb, 1500ppb, sao cho tổng

hàm lượng THC-COOH sau khi xử lý không bị vượt quá đường chuẩn. Xử lý

mẫu và phân tích theo quy trình đã chọn. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, và

lấy kết quả trung bình. Kết quả được trình bày trong chương 3. Hiệu suất thu hồi

C

C

blank

H



x

100%

spike  0C

được xác định theo công thức sau:

Trong đó: Cspike: nồng độ của mẫu thêm chuẩn (ppb)

Cblank: nồng độ của mẫu nền (ppb)

C0: nồng độ chuẩn được thêm chuẩn (ppb)

2.4.9. Phân tích mẫu thực tế

Sau khi khảo sát và tối ưu được quy trình phân tích, tiến hành khảo sát trên

các mẫu thực thu được từ các vụ án để định tính và định lượng nồng độ THC-

COOH trong mẫu nước tiểu của đối tượng sử dụng cần sa. Kết quả phân tích mẫu

thực sẽ được trình bày trong chương 3.

33

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Kết quả khảo sát điều kiện phân tích THC-COOH trên GC-MS

Để tối ưu quá trình phân tích trên GC-MS đảm bảo khả năng tách tốt nhất,

tiến hành phân tích mẫu chuẩn ở chương trình nhiệt khác nhau như đã trình bày ở

chương hai.

Dưới đây là phổ khối của THC-COOH chuẩn, sắc ký đồ của THC-COOH-

2TMS, phổ khối của THC-COOH-2TMS ở hai chương trình nhiệt độ phân tích

khác nhau và cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS.

Chương trình nhiệt thứ nhất:

200C/ phút 100oC (2 phút) 270oC (20 phút)

Tổng cộng: 30,5 phút

Chương trình nhiệt thứ hai:

500C/ phút 150C/ phút

120oC (2 phút) 280oC (5 phút) 200oC Tổng cộng: 13,933 phút

34

Hình 3.1. Phổ khối của THC-COOH chuẩn

35

Hình 3.2. Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN I

36

Hình 3.3. Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN I

37

Hình 3.4. Sắc ký đồ của THC-COOH-2TMS ở CTN II

38

Hình 3.5. Phổ khối của THC-COOH-2TMS ở CTN II

39

Như vậy, sắc ký đồ trong hai điều kiện phân tích trên không có sự khác

nhau nhiều, sắc ký đồ đều cho pic đặc trưng sắc nét, phổ khối cho các mảnh phù

hợp với cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS. Tuy nhiên thời gian lưu của

THC-COOH-2TMS ở điều kiện phân tích thứ hai ngắn hơn, nên tiết kiệm được

thời gian phân tích. Do vậy, chương trình sắc ký thứ hai được lựa chọn để phân

tích.

Theo cơ chế phân mảnh của THC-COOH-2TMS có 3 mảnh chính và đặc

trưng là mảnh m/z = 371; 473; 488. Tuy nhiên mảnh m/z 371 cho tín hiệu cao

nhất đồng thời đặc trưng nhất, phù hợp với cơ chế phân mảnh của THC-COOH-

2TMS nên sẽ được lựa chọn làm mảnh cho phân tích định lượng.

3.2. Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân và dẫn xuất

- Điều kiện thủy phân: Kết quả khảo sát điều kiện thủy phân với cùng tác nhân là môi trường kiềm mạnh (KOH 10M) ở 3 nhiệt độ 50oC; 55oC; 60oC thu

được diện tích pic THC-COOH-2TMS không có thay đổi đáng kể, tức là ở nhiệt độ 50oC, quá trình thủy phân coi như đã hoàn toàn.

Vì vậy lựa chọn điều kiện thủy phân là: Môi trường kiềm mạnh KOH 10M,

nhiệt độ thủy phân là 50oC trong thời gian 20 phút.

- Điều kiện dẫn xuất: Kết quả khảo sát điều kiện dẫn xuất với cùng chất dẫn xuất là BSTFA chứa 1% TMCS ở các điều kiện: 90oC trong 20 phút; 90oC trong 30 phút; 100oC trong 20 phút cho thấy diện tích pic THC-COOH-2TMS không có thay đổi đáng kể, chứng tỏ ở điều kiện 90oC trong 20 phút quá trình dẫn

xuất đã xảy ra hoàn toàn.

Vì thế, lựa chọn điều kiện dẫn xuất là: BSTFA chứa 1% TMCS ở 90oC

trong 20 phút.

3.3. Kết quả khảo sát điều kiện tối ưu cho quá trình chiết

3.3.1. Kết quả khảo sát dung môi chiết

Khảo sát khả năng chiết THC-COOH trên 6 hệ dung môi: iso-octan; n-

hexan/etylaxetat (9:1,v/v); n-hexan/etylaxetat (7:3,v/v); metylencloride/2-

40

propanol/etyaxetat (1:1:3,v/v/v); etylaxetat/dietyete (1:1, v/v);

xyclohexan/etylaxetat (7:1,v/v): 10 ml nước tiểu dương tính, thực hiện thủy phân

theo điều kiện đã chọn trên. Đo pH của mẫu, rồi điều chỉnh đến pH =2 bằng dung

dịch HCl 2M. Thêm 3ml dung dịch đệm pH = 2. Thêm 20 ml dung môi chiết. Lắc

bằng máy lắc trong 30 phút. Xử lý mẫu sau khi chiết, dẫn xuất, bơm 1 µl mẫu vào

GC-MS để phân tích. Kết quả thu được trong bảng 3.1.

Bảng 3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết

STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS Dung môi Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

32132 37509 37419 35686 Isooctan

n-hexan/EtOAc 98635 99737 110469 102947 (9:1, v/v)

n-hexan/EtOAc 96814 94213 94708 95245 (7:3, v/v)

Metylencloride/2-

propanol/EtOAc 54163 50391 49733 51429

(1:1:3,v/v/v)

EtOAc/dietyete 88025 85564 85707 86432 (1:1, v/v)

Xyclohexan/EtOAc 89786 90176 91917 90626 (7:1,v/v)

41

Hình 3.6. Ảnh hưởng của dung môi đến quá trình chiết Nhìn vào đồ thị ảnh hưởng của dung môi tới quá trình chiết, ta thấy khả

năng chiết của các dung môi n-hexan/EtOAc (9/1); n-hexan/EtOAc (7/3);

EtOAc/dietylete (1/1); xyclohexan/EtOAc (7/1) không chênh lệch nhau nhiều.

Tuy nhiên, hệ có dung môi dietylete dễ bay hơi hơn, nên độ lặp lại không cao, dễ

gây sai số, đồng thời độc hại.

Đồng thời dựa vào diện tích pic trung bình của THC-COOH-2TMS, ta thấy

khả năng tách của hỗn hợp dung môi n-hexan/etylaxetat (9:1, v/v) là tốt nhất,

chiết còn ít tạp, hiệu quả chiết cao nhất, n-hexan là dung môi có độ phân cực cao

còn etylaxetat có độ phân cực thấp hơn sẽ làm cho khả năng tách THC-COOH dễ

nhất, đồng thời chúng là dung môi dễ mua, ít tốn kém, thường được sử dụng

trong các phòng thí nghiệm phân tích ma túy tại các địa phương, ít độc hại hơn so

với các dung môi còn lại.

Vì vậy, để tối ưu quá trình phân tích, hỗn hợp dung môi n-hexan/etylaxetat

(9:1, v/v) được lựa chọn để tách THC-COOH ra khỏi nước tiểu của đối tượng sử

dụng cần sa.

42

3.3.2. Kết quả khảo sát môi trường chiết (pH)

Môi trường chiết là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới hiệu

suất của quá trình chiết: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp10 ml nước tiểu dương tính,

thực hiện thủy phân theo điều kiện đã chọn trên. Thêm dung dịch HCl 2M để điều

chỉnh pH đến các giá trị pH=1; pH=2; pH=3; pH=4. Thêm 3 ml dung dịch đệm có

pH tương ứng. Thêm 20 ml dung môi chiết đã tối ưu được, lắc bằng máy lắc

trong 30 phút. Xử lý mẫu sau khi chiết, bơm 1 µl mẫu vào GC-MS để phân tích.

Kết quả thu được trong bảng 3.2.

Bảng 3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết

STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS pH Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

1,0 637708 661257 664912 654626

2,0 751335 785403 793884 776874

3,0 680955 706057 718497 701836

4,0 500237 557645 563977 540620

Hình 3.7. Ảnh hưởng của pH đến quá trình chiết

43

Nhận xét: Như vậy ở môi trường chiết pH=2, diện tích pic thu được của

THC-COOH-2TMS là lớn nhất, đồng thời lượng tạp chất trên sắc đồ cũng ít nhất

cho thấy khả năng chiết THC-COOH ở môi trường pH=2 cho kết quả tốt hơn so

với các pH =1; pH = 2; pH =3. Vì vậy lựa chọn dung dịch HCl để điều chỉnh đến

pH=2 làm môi trường chiết nhằm tối ưu quy trình chiết.

3.3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết

Sau khi tiến hành 2 thí nghiệm phân tích chuẩn THC-COOH riêng biệt:

- Thí nghiệm I: Lấy vào lọ sắc ký dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb,

làm khô rồi đem dẫn xuất.

- Thí nghiệm II: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu trắng, thêm

50 µl dung dịch chuẩn THC-COOH 500 ppb, điều chỉnh đến pH =2 bằng dung

dịch HCl 2M, thêm 20 ml dung môi hexan/etylaxetat (9:1, v/v), tiến hành chiết và

xử lý mẫu trước khi phân tích trên GC-MS. Kết quả thu được trong bảng 3.3.

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát hiệu suất chiết

Thí nghiệm STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS

Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình ( TN)

5927379 5976343 5836589 TN 1 5913437

5817481 TN 2 5548371 5709186 5691679

Hiệu suất 96,2 (H%)

Kết quả thí nghiệm chiết với tỉ lệ thể tích nước tiểu và dung môi là 1:2 cho

hiệu suất chiết THC-COOH đạt 96,2% khá cao, cho thấy quy trình phân tích

THC-COOH trong nước tiểu đạt yêu cầu phân tích lượng vết và có thể áp dụng

vào mẫu thực từ các vụ án bắt được.

3.4. Phương pháp định lượng THC-COOH

3.4.1. Kết quả xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị

Sau khi bơm lặp lại 10 lần dung dịch chuẩn THC-COOH có nồng độ 10

ng/ml (10 ppb) đã được dẫn xuất thành THC-COOH-2TMS trên thiết bị GC-MS,

44

độ lệch chuẩn được xác định như đã trình bày ở chương 2, chúng tôi thu được

giới hạn giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị đối với THC-

COOH-2TMS lần lượt là: 0,9 ng/ml và 2,9 ng/ml.

3.4.2. Xây dựng đường chuẩn

Chất chuẩn dùng để pha nhằm xây dựng đường chuẩn với 7 điểm nồng độ

nằm trong khoảng từ 10-2000 ng/ml. Mỗi nồng độ bơm một lượng dẫn xuất tương

ứng, lặp lại 3 lần và lấy trung bình. Kết quả ở bảng 3.4.

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của THC-COOH

[THC-COOH] STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS STHC-COOH-2TMS

(ng/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình

10 113583 118262 112171 114672

50 578217 589241 624257 597238

250 2791191 3008012 3114510 2971238

500 5794173 6093128 5954061 5947121

1000 9931744 11248722 13327980 11502815

1500 16907125 18053440 18513943 17824836

2000 22664504 24089856 24401104 23718488

45

Hình 3.8. Đường chuẩn xác định THC-COOH

- Kiểm tra sự khác nhau có nghĩa giữa hệ số a và giá trị 0 [4]

Trong phương trình hồi qui y = a + bx, trường hợp lý tưởng xảy ra khi a=0.

Tuy nhiên, trong thực tế các số liệu phân tích thường mắc sai số ngẫu nhiên luôn

làm cho a≠0. Nếu giá trị a khác “0” có nghĩa thống kê thì phương pháp phân tích

sẽ mắc sai số hệ thống. Vì vậy, trước khi sử dụng đường chuẩn cho phân tích cần

kiểm tra xem sự khác nhau giữa giá trị a và giá trị 0 không có ý nghĩa thống kê

không.

Nếu xem a ≈ 0 thì phương trình được viết thành phương trình y = b’x.

Thay các giá trị yi và xi vào phương trình y = b’x ta sẽ được các giá trị b’i là

trung bình cộng các giá trị bi thu được.

Sau đó đánh giá sự sai khác giữa giá trị a và giá trị 0 theo chuẩn F (tính

theo tỷ số của hai phương sai của hai phương trình sao cho F >1) và so sánh giá

trị này với F(P, f1, f2) với P = 0,95 với f1, f2 là bậc tự do (f1=n-3, f2=n-2, n là số

điểm trên đường chuẩn).

2

2

(

y



ˆ y

)

(

y

a 

bx

)

i

2

i

i

Phương sai của 2 phương trình được tính như sau:





S





y

n



2

i n



2

'

2

2

i

(

y



ˆ y

)

(

y



' xb

)

i





2' y

S





i n



3

i n



3

46

2' y

S

F



tinh

2

S

y

Chuẩn F được tính như sau:

2

2

Bảng 3.5. Kết quả so sánh giữa giá trị a với 0 của phương trình đường chuẩn

PT hồi quy Sy S'y Ftính Fbảng

y = -27884 +11840.x 1,73.1016 3,30.1016 1,91 5,19

Ta thấy Ftính < Fbảng với tất cả các phương trình đường chuẩn của THC-

COOH. Vì vậy có thể kết luận được giá trị a và 0 khác nhau không có ý nghĩa

thống kê, hay phương pháp xác định THC-COOH không mắc sai số hệ thống.

3.4.3. Kết quả đánh giá tính phù hợp của phương pháp

Để đánh giá RSD của phương pháp, tiến hành các thí nghiệm độc lập ở

nồng độ đầu và nồng độ cuối đường chuẩn ở nồng độ 10 ppb và 2000 ppb. Kết

quả thu được tính toán theo công thức % RSD = . 100%. Kết quả như sau:

Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

10 ppb 2000 ppb STT tR (phút) STHC-COOH-2TMS tR (phút) STHC-COOH-2TMS

120173 11,630 24375873 11,627 1

115237 11,636 24247912 11,624 2

109462 11,627 23958390 11,615 3

110791 11,638 25010389 11,611 4

122011 11,640 25391841 11,613 5

115535 11,634 24596881 TB 11,618

RSD 0,06 4,80 0,05 2,39 (%)

Kết quả phân tích cho thấy, THC-COOH-2TMS có thời gian lưu xác định.

Giá trị RSD rất nhỏ, RSD của thời gian lưu và tỉ lệ diện tích chất phân tích ở các

47

điểm nồng độ đầu và nồng độ cuối của đường chuẩn đều nhỏ hơn 5%, như vậy hệ

thống sắc ký phù hợp, có độ lặp lại tốt, độ chính xác cao, áp dụng được cho phân

tích định tính và định lượng trên sắc ký được.

3.4.4. Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi của phương pháp

Tiến hành độc lập 3 thí nghiệm với mẫu nước tiểu dương tính của cùng

một đối tượng để khảo sát hiệu suất thu hồi:

-Thí nghiệm I : Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu, xử lý và phân

tích theo quy trình đã được tối ưu.

-Thí nghiệm II: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu, thêm dung

dịch chuẩn 10 µl THC-COOH 50 ppb, xử lý và phân tích theo quy trình đã được

tối ưu.

-Thí nghiệm III: Lấy vào lọ thủy tinh có nắp 10 ml nước tiểu, thêm dung

dịch chuẩn 10 µl THC-COOH 1500 ppb, xử lý và phân tích theo quy trình đã

được tối ưu.

Sau khi lặp lại mỗi thí nghiệm 3 lần, kết quả thu được trong bảng 3.7.

Bảng 3.7. Hiệu suất thu hồi trên nền mẫu thật

[THC- [THC-COOH] STHC-COOH-2TMS COOH] thêm tìm được H (%) STHC-COOH-2TMS Trung bình vào (ng/ml) (ng/ml)

842649

0 868730 852550 74,4

846270

1346137

50 1364360 1353616 116,7 93,8

1350352

17742897

1500 17864911 17840234 1509,1 95,6

17912893

48

Với hiệu suất thu được ứng với 2 nồng độ THC-COOH thêm vào là 50 ppb

và 1500 ppb đạt 93,8 % và 95,6 % cho thấy, phương pháp có độ thu hồi tốt. Do

đó kết quả phân tích là đáng tin cậy.

3.4.5. Quy trình giám định THC-COOH trên thiết bị GC-MS

Trên cơ sở kế thừa các nghiên cứu đã công bố đã tối ưu các điều kiện đã

khảo sát cho thấy phương pháp có độ lặp lại tốt, độ chính xác cao, hiệu suất thu

hồi tốt đáp ứng được yêu cầu phân tích định tính và định lượng, do đó chúng tôi

xây dựng được quy trình xử lý mẫu để phân tích THC-COOH trong mẫu nước

tiểu của đối tượng bị bắt giữ như sau:

49

10 ml nước tiểu

2 ml KOH 10M

Thủy phân trong 20 phút ở 500C

HCl 2M đến pH=2 3 ml đệm pH=2 20 ml n-hexan/etylaxetat (9/1)

Lắc trong 30 phút, phân lớp

Thu dịch chiết, loại nước bằng Na2SO4 khan

Cô chân không, thu cặn chiết

Chuyển sang lọ dẫn xuất, rửa bằng 0,2 ml

Metanol, lắc siêu âm

Thổi khô bằng dòng khí N2

20 µl BSTFA chứa 1% TMCS

Dẫn xuất trong 20 phút ở 90oC

Bơm 1µl vào GC-MS

Hình 3.9. Sơ đồ quy trình xử lý, tách chiết THC-COOH trong mẫu nước tiểu

50

3.5. Ứng dụng quy trình vào phân tích mẫu thực tế

Từ quy trình đã được khảo sát và tối ưu, tiến hành phân tích với 5/6 mẫu

bắt được dương tính với que thử miễn dịch cần sa trong nước tiểu. Kết quả thu

được trong bảng 3.8.

Bảng 3.8. Kết quả định lượng thu được từ một số mẫu thực

Khối lượng STHC-COOH-

2TMS Lần 2

STT THC-COOH STHC-COOH-2TMS Lần 1 STHC-COOH-2TMS Lần 3 STHC-COOH-2TMS Trung bình (ng/ml)

359827 373729 M1 394023 375860 34,1

771801 780945 M2 799532 784092 68,6

884299 862841 M3 892446 879862 76,7

1986471 1954728 M4 1991763 1977654 169,4

328625 301249 M5 325033 318302 29,2

Kết quả cho thấy, hàm lượng THC-COOH trong mẫu nước tiểu phù hợp

với lời khai của đối tượng. Đối tượng có tiền sử sử dụng cần sa và đối tượng mới

sử dụng cần sa có hàm lượng THC-COOH trong mẫu nước tiểu cao hơn các đối

tượng ít sử dụng và đã sử dụng lâu ngày so với thời điểm lấy mẫu phân tích. Như

vậy, với đối tượng sử dụng cần sa thường xuyên hàm lượng THC-COOH có thể

lên tới vài trăm ng/ml. Từ kết quả hàm lượng THC-COOH thu được trên một số

mẫu nước tiểu có thể đánh giá lại được tiền sử và mức độ sử dụng cần sa của đối

tượng.

3.6. Hướng phát triển của đề tài

Với những kết quả tin cậy đạt được qua quá trình khảo sát các yếu tố cũng như xây dựng quy trình phân tích THC-COOH trong nước tiểu của người bằng sắc ký khí khổi phổ, phương pháp có thể áp dụng và triển khai tại các phòng thí nghiệm của địa phương để phục vụ cho công tác giám định ma túy.

Ngoài đối tượng phân tích là mẫu nước tiểu, hướng nghiên cứu tiếp theo được đề xuất là có thể áp dụng phân tích với các đối tượng mẫu khác như mẫu máu, nước bọt nhằm đa dạng hình thức lấy mẫu trên thiết bị GC-MS hoặc GC- MS/MS để tăng độ nhạy của phép phân tích. Đồng thời có thể tiến hành phân tích THC-COOH trong các đối tượng mẫu trên thiết bị HPLC, LC-MS để giảm bớt bước dẫn xuất hóa.

51

KẾT LUẬN

Trên cơ sở khảo sát các yếu tố chúng tôi thu được các kết quả sau:

* Điều kiện tối ưu trên thiết bị GC-MS với chương trình nhiệt độ:

500C/ phút 150C/ phút

120oC (2 phút) 200oC 280oC (5 phút)

Tổng cộng: 13,933 phút

- Các mảnh ion THC-COOH-2TMS: 73; 147; 209; 297; 355; 371; 398;

417; 432; 473; 488...

- Ion mảnh: 371.

* Khảo sát được phương pháp chiết lỏng lỏng với dung môi chiết THC-

COOH trong nước tiểu là n-hexan/etylaxetat (9/1, v/v), thể tích dung môi chiết là

20 ml.

* Khảo sát được môi trường chiết THC-COOH trong nước tiểu tốt nhất là

pH=2, môi trường chiết là HCl 2M, dung dịch đệm xitrat pH=2.

* Hiệu suất của quá trình chiết đạt 96,2%.

* Xây dựng được đường chuẩn phân tích định lượng THC-COOH trong

khoảng 10-2000 ng/ml với hệ số tương quan r2 = 0,9998.

- Xác định được giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của thiết bị là

LOD= 0,9 ng/ml; LOQ= 2,9 ng/ml.

* Đánh giá được tính phù hợp của phương pháp với RSD ở hai điểm nồng

độ đầu và nồng độ cuối của đường chuẩn nhỏ.

* Hiệu suất thu hồi trên nền mẫu thực cao 93,8 % và 95,6%.

* Xây dựng được quy trình phân tích THC-COOH trong mẫu nước tiểu của

người sử dụng cần sa.

* Ứng dụng phân tích trên một số mẫu nước tiểu nghi sử dụng cần sa với

hàm lượng từ 29,2 ng/ml – 169,4 ng/ml tùy thuộc vào tiền sử sử dụng cần sa và

thời gian tính từ thời điểm sử dụng lần cuối đến thời điểm lấy mẫu nước tiểu phân

tích bao lâu.

52

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Phạm Hùng Việt (2005), Sắc ký khí – Cơ sở lý thuyết và khả năng ứng dụng,

Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội.

2. Nguyễn Văn Ri (2009), Các phương pháp táchTrường ĐH Khoa học Tự nhiên.

3. Tạ Thị Thảo (2006), Bài giảng Thống kê trong Hóa phân tích, Trường ĐH

Khoa học Tự nhiên.

4. Trần Minh Hương (2004), Các chất ma túy thường gặp và phương pháp giám

định trong mẫu phẩm sinh học, Nhà xuất bản Công an nhân dân.

5. California NORML Guide Interpreting Drug Test Results (2012), Marijuana

Tiếng Anh

Drug Test Detection Time.

6. D. Bourquin, R. Brenneisen (1987), Determination of the major Δ9-

tetrahydrocannabinol metabolite in urine by high-performance liquid

chromatography andphotodiode array detection, Analytica Chimica Acta, Vol

198, pp 183-189.

7. Eirin Berge Steinshamn (2009), Development of an analytical method for

detection and quantification of cannabis and cannabinoid analogues in urine,

Master in analytical chemistry thesis for the Norwegian pharmacy degree

candidates pharmaciae.

8. Eugene W. Schwilke, David M. Schwope, Erin L. Karschner, Ross H. Lowe,

William D. Darwin, Deanna L. Kelly, Robert S. Goodwin, David A. Gorelick and Marilyn A. Huestis (2009), Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC), 11-Hydroxy-

THC, and 11-Nor-9-carboxy-THC Plasma Pharmacokinetics during and after

9. Fishburne PM, Abelson HI, Cisin I, (1979) National survey on drug abuse: main

Continuous High-Dose Oral THC, Clinical Chemistry, pp. 2180-2189.

findings, Government Printing Office, (HHS publication no. (ADM) 80-976).

53

10. Gehaltstatistik (2009), Swiss Federal Office of Public Health, THC Statistics,

p.p. 17-19.

11. Hunt AC, Jones RT (1980), Tolerance and disposition of THC in man. Pharm

Exp Ther, pp. 215:135-44.

Collected for Doping Analysis, Journal of Analytical Toxicolog, Vol 27, pp 106-109.

12. K.J.S.De Cock, F.T.Delbeke, D.De Boer, P.Van Eenoo, and K.Roels (2003) Quantitation of 11-nor-∆9-Tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid with GC-MS in Urine

13. Law, B; Mason, PA; Moffat, AC; King, LJ (1984). "Confirmation of cannabis

use by the analysis of delta 9-tetrahydrocannabinol metabolites in blood and

urine by combined HPLC and RIA" Journal of analytical toxicology, pp. 19-22.

14. Marcello Chiarotti, Luisa Costamagna (2000), Analysis of 11-nor-9-carboxy-

∆9-tetrahydrocannabinol in biological samples by gas chromatography tandem

mass spectrometry (GC/MS-MS), Forensic Science International, Vol 114, pp 1-6.

15. M. Felli, S. Martello, M. Chiarotti (2011), LC–MS–MS method for simultaneous

determination of THCCOOH and THCCOOH-glucuronide in urine: Application to

workplace confirmation tests, Forensic Science International, Vol 204, pp 67-73.

16. Narcotics Division (1998), Manual for identification of abused drugs,

Pharmaceutical and Medical Safety Bureau Ministry of Health and Welfare, Japan.

17. Perez-Reyes M, Guiseppi SD, Mason AP, Davis KH (1983), Passive

inhalation of marijuana smoke and urinary excretion of cannabinoids. Clin

Pharmacol Ther; pp. 34:36-41.

18. Peter R. Stout, Carl K. Horn, and Kevin L. Kalette (2001), Solid-Phase

Extraction and GC-MS Analysis of THC-COOH Method Optimized for a High-

Throughput Forensic Drug-Testing Laboratory, Journal of Analytical Toxicolog,

Vol 25, pp 550-554.

19. Shanlin Fu and John Lewis (2008), Novel Automated Extraction Method for Quantitative Analysis of Urinary 11-nor-∆9-Tetrahydrocannabinol- 9-Carboxylic

Acid (THC-COOH), Journal of Analytical Toxicolog, Vol 32, pp 292-297.

54

20. United Nations international drug control programe (1995), Recommended

methods for the detection and assay of Heroin, Cannabinoids, Cocaine,

Amphetamine, Methamphetamine and Ring-substituted Amphetamine Derivatives

in biological specimens, United Nations, New York, pp. 31-41.

21. UNODC United Nations office on drugs and crime (2009), Recommended

Methods for the Identification and Analysis of Cannabis and Cannabis Products,

United Nations, New York. pp. 8-9; 21-23.

22. Vandana Dixit and Vyas M. Dixit (1991) Solid-phase extraction of l l-nor-A-

9-tetrahydrocannabinol-9-carboxylic acid from human urine with gas

chromatographic-mass spectrometric confirmation, Journal of Chromatography B:

Biomedical Sciences and Applications, Vol 567, pp 81-91.

23. Wolfgang Weinmann*, Susanne Vogt, Rolf Goerke, Claudia Mu¨ller, Andreas

Bromberger (2000), Simultaneous determination of THC-COOH and

THC-COOH-glucuronide in urine samples by LC/MS/MS, Vol 113, pp 381-387.

55

PHỤ LỤC

Danh mục các hình tham khảo:

Hình 1. Sắc ký đồ của mẫu M1.

Hình 2. Phổ khối của mẫu M1.

Hình 3. Sắc ký đồ mẫu M2.

Hình 4. Phổ khối của mẫu M2.

Hình 5. Sắc ký đồ của mẫu M3.

Hình 6. Phổ khối của mẫu M3.

Hình 7. Sắc ký đồ mẫu M4.

Hình 8. Phổ khối của mẫu M4.

Hình 9. Sắc ký đồ của mẫu M5.

Hình 10. Phổ khối của mẫu M5.

Hình 11. Sắc ký đồ khảo sát bằng dung môi n-hexan/etylaxetat (9/1).

Hình 12. Phổ khối khảo sát bằng dung môi n-hexan/etylaxetat (9/1).

Hình 13. Sắc ký đồ khảo sát ở môi trường pH=2.

Hình 14. Phổ khối khảo sát ở môi trường pH=2.

56

Hình 1. Sắc ký đồ của mẫu M1

Hình 2. Phổ khối của mẫu M1

Hình 3. Sắc ký đồ mẫu M2

Hình 4. Phổ khối của mẫu M2

Hình 5. Sắc ký đồ của mẫu M3

Hình 6. Phổ khối của mẫu M3

Hình 7. Sắc ký đồ mẫu M4

Hình 8. Phổ khối của mẫu M4

Hình 9. Sắc ký đồ của mẫu M5

Hình 10. Phổ khối của mẫu M5

Hình 11. Sắc ký đồ khảo sát bằng dung môi n-hexan/etylaxetat (9/1)

Hình 12. Phổ khối khảo sát bằng dung môi n-hexan/etylaxetat (9/1)

Hình 13. Sắc ký đồ khảo sát ở môi trường pH=2

Hình 14. Phổ khối khảo sát ở môi trường pH=2