Nghiên cứu hiệu quả sử dụng bộ kít elisa định lượng nọc rắn hổ mang Naja atra trên lâm sàng

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> <br /> NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ SỬ DỤNG BỘ KÍT ELISA ĐỊNH LƯỢNG<br /> NỌC RẮN HỔ MANG Naja atra TRÊN LÂM SÀNG<br /> Hà Thị Hải*; Nguyễn Ngọc Tuấn**<br /> Đỗ Khắc Đại**; Nguyễn Đặng Dũng**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: nghiên cứu này đánh giá khả năng định lượng nọc rắn Hổ mang (Naja atra) của bộ<br /> xét nghiệm ELISA định lượng nọc rắn trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng. Đối tượng và phương<br /> pháp: 36 bệnh nhân (BN) (32 nam, 4 nữ) được chẩn đoán bị rắn Hổ mang cắn, độ tuổi trung<br /> bình 46, thời gian nhập viện chủ yếu trong 24 giờ đầu sau khi bị rắn cắn. Kết quả: nồng độ nọc<br /> rắn định lượng được trong huyết thanh BN dao động từ 2,8 - 159,1 ng/ml; 26/36 mẫu (72%) cho<br /> kết quả nồng độ nọc rắn < 50 ng/ml; có mối liên quan giữa nồng độ nọc rắn với số liều huyết<br /> 2<br /> thanh kháng nọc rắn (HTKNR) dùng điều trị (R = 0,51; p < 0,001), mối liên quan này chặt chẽ<br /> hơn khi phân tích nhóm BN nhập viện trong 6 giờ đầu kể từ khi bị rắn cắn (R2 = 0,72; p <<br /> 0,001). Kết luận: bộ kít cho phép xác định nồng độ nọc rắn Hổ mang trong mẫu huyết thanh BN<br /> bị rắn Hổ mang cắn. Việc xác định nồng độ nọc rắn đặc biệt có giá trị khi thực hiện xét nghiệm<br /> ở BN bị rắn độc cắn nhập viện trong 6 giờ đầu.<br /> * Từ khóa: Nọc rắn; Naja atra; Định lượng.<br /> <br /> Evaluation of the Effect of Quantitative ELISA Test Kit for Naja<br /> atra Venom on Clinical<br /> Summary<br /> Objectives: To evaluate the testing capability of the quantitative ELISA test kit we had<br /> developed on clinical samples taken from Naja atra snake-bite patients. Subjects and methods:<br /> Involved 36 patients (32 males, 4 females) diagnosed to be bitten by Naja atra snake and<br /> hospitalized mainly within 24 hours from the snake-bite. Results: Concentrations of Naja atra<br /> venom in 36 serum samples ranged between 2.8 - 159.1 ng/mL; 26/36 (72%) samples had<br /> venom concentration below 50 ng/mL; there was a statistically significant relationship between<br /> venom concentration and number of antivenom units used for treatment (R2 = 0.51, p < 0.001)<br /> and this relationship was stronger in patients hospitalized within 6 hours from snake-bite<br /> (R2 = 0.72, p < 0.001). Conclusion: The test kit allows the quantitative of N. atra venom<br /> concentrations in serum samples of patients diagnosed to be bitten by cobra snake.<br /> Determination of snake venom concentration is valuable, especially when performing tests in<br /> patients hospitalized within 6 hours from snake-bite...<br /> * Keywords: Venom; Naja atra; Quantitative.<br /> * Trường Đại học Y Dược Thái Bình<br /> ** Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Ngọc Tuấn (nguyenngoctuanmd@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 17/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 07/09/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 18/09/2017<br /> <br /> 59<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Rắn độc cắn là một cấp cứu nội khoa,<br /> bệnh cảnh lâm sàng có thể nhẹ, chỉ là tổn<br /> thương mô tại chỗ, nhưng cũng có thể rất<br /> nặng, đe dọa các chức năng sống, gây<br /> nguy hiểm đến tính mạng của BN, đòi hỏi<br /> phải có biện pháp cấp cứu kịp thời. Theo<br /> Tổ chức Y tế Thế giới, thuốc điều trị hiệu<br /> quả nhất cho BN bị nhiễm độc nọc rắn là<br /> HTKNR. Hiện nay, tại Việt Nam và nhiều<br /> nước trên thế giới, HTKNR được sử dụng<br /> cho BN rắn độc cắn có nguồn gốc từ<br /> ngựa; việc sử dụng HTKNR có thể kích<br /> thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể BN<br /> chống lại protein khác loài, gây ra một số<br /> bệnh lý quá mẫn, do đó HTKNR cần<br /> được chỉ định điều trị một cách phù hợp.<br /> Một trong những căn cứ có tính khoa học<br /> để chỉ định liều sử dụng HTKNR cho BN<br /> là kết quả định lượng nọc rắn trong mẫu<br /> huyết thanh của BN bị rắn cắn. Trong<br /> nghiên cứu trước đây, chúng tôi đã phát<br /> triển một bộ kít xét nghiệm ELISA định<br /> lượng nọc rắn Hổ mang (Naja atra) [3].<br /> Chúng tôi tiếp tục thực hiện nghiên cứu<br /> này nhằm: Đánh giá hiệu quả sử dụng<br /> trên lâm sàng của bộ kít xét nghiệm trên<br /> các mẫu bệnh phẩm từ BN bị rắn Hổ<br /> mang cắn.<br /> <br /> 2. Vật liệu nghiên cứu.<br /> - Bộ kít ELISA định lượng nọc rắn Hổ<br /> mang do Bộ môn Miễn dịch, Học viện<br /> Quân y chế tạo.<br /> - Máy đo mật độ quang DTX 880<br /> (Hãng Beckman Coulter).<br /> - Pippet các loại, máy Vortex, tủ ấm…<br /> - Một số hoá chất, vật tư tiêu hao khác<br /> dùng cho nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn<br /> phân tích và do chính hãng sản xuất cung<br /> cấp.<br /> 3. Phương pháp nghiên cứu.<br /> - Nghiên cứu tiến cứu, mô tả cắt ngang.<br /> * Các bước tiến hành nghiên cứu:<br /> - Thu thập: thông tin BN, mẫu huyết<br /> thanh từ BN trước khi được điều trị nhiễm<br /> độc do rắn Hổ mang cắn.<br /> - Thực hiện phản ứng ELISA với bộ kít<br /> đã xây dựng [3], định lượng nọc rắn trong<br /> các mẫu huyết thanh đã thu thập được.<br /> - Xử lý số liệu theo các phương pháp<br /> thống kê y sinh học.<br /> * Nguyên lý kỹ thuật ELISA định lượng:<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tượng nghiên cứu.<br /> 36 BN được chẩn đoán do rắn Hổ<br /> mang cắn, nhập viện tại Trung tâm Chống<br /> độc, Bệnh viện Bạch Mai từ tháng 4 đến<br /> 10 - 2014.<br /> 60<br /> <br /> Hình 1: Nguyên lý của kỹ thuật ELISA<br /> sandwich.<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> Phương pháp dựa trên nguyên lý của<br /> kỹ thuật ELISA sandwich, trong đó kháng<br /> thể thứ nhất (KT1) là IgG ngựa đặc hiệu<br /> với nọc rắn Hổ mang, được gắn cố định<br /> trên bề mặt giếng phản ứng (pha rắn solid phase); kháng thể thứ hai (KT2) là<br /> IgG thỏ đặc hiệu với kháng nguyên nọc<br /> rắn Naja atra; kháng thể thứ ba (KT3) là<br /> IgG cừu kháng IgG thỏ, được gắn enzym<br /> horse-radish peoxidase (HRP). Mật độ<br /> quang học (OD) của các giếng ELISA tỷ<br /> lệ thuận với lượng kháng nguyên nọc rắn<br /> có trong giếng. Xây dựng đường chuẩn<br /> (đường cong tương quan giữa giá trị OD<br /> và nồng độ nọc rắn chuẩn) dựa trên giá trị<br /> OD trung bình của các giếng phản ứng<br /> với nọc rắn chuẩn; từ đường chuẩn đã<br /> xây dựng, tính toán nồng độ nọc rắn có<br /> trong mẫu huyết thanh dựa trên giá trị OD<br /> trung bình của giếng phản ứng với mẫu<br /> huyết thanh.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Đặc điểm đối tượng nghiên cứu .<br /> <br /> Biểu đồ 1: Phân bố tuổi, giới của nhóm<br /> BN nghiên cứu (n = 36).<br /> Độ tuổi trung bình 46, thấp nhất 9 tuổi,<br /> cao nhất 89 tuổi, 3/4 số BN có độ tuổi<br /> < 52. Đa số BN là nam giới (32 BN =<br /> 89%), chỉ có 4 BN nữ (11%). Kết quả này<br /> phù hợp với nghiên cứu của các tác giả:<br /> Nguyễn Kim Sơn (2008) thông báo 84,2%<br /> BN bị rắn hổ cắn là nam giới [5], Đỗ Khắc<br /> Đại (2013) báo cáo 68,8% là nam giới<br /> trong tổng số 122 BN bị rắn cắn điều trị<br /> tại Bệnh viện Chợ Rẫy [2]. Kết quả này<br /> cũng phù với nghiên cứu của Dong Zong<br /> Hung và CS (2003) trên 31 BN: 68% BN<br /> bị rắn Hổ mang cắn là nam [6].<br /> <br /> Biểu đồ 2: Phân bố nghề nghiệp của<br /> nhóm BN nghiên cứu (n = 36).<br /> 61<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> Phần lớn BN bị rắn Hổ mang cắn làm<br /> ruộng (25 BN = 70%). Đây là những<br /> người phải thường xuyên tiếp xúc với môi<br /> trường hoạt động và sinh sống của rắn và<br /> vào thời điểm ban đêm khi rắn đi săn mồi.<br /> Ngoài ra, 11% là những người làm nghề<br /> nuôi bắt rắn và 6% là học sinh. Có thể<br /> thấy, đối tượng bị rắn cắn thường là lao<br /> động chính, nếu bị rắn cắn thì chính họ sẽ<br /> trở thành gánh nặng về kinh tế đối với gia<br /> đình họ.<br /> <br /> nhân) thường nhập viện sớm trong<br /> những giờ đầu [5]. Thời gian nằm viện<br /> của nhóm BN nghiên cứu từ 3 - 4 ngày,<br /> ngắn hơn đáng kể so với nhóm BN bị rắn<br /> Cạp nia hay một số loài rắn độc khác cắn;<br /> lý do chính của việc rút ngắn thời gian<br /> nằm viện là những BN này được điều trị<br /> bằng HTKNR đặc hiệu (trong khi tại cùng<br /> thời điểm này, HTKNR đặc hiệu cho các<br /> loài rắn khác không có sẵn cho điều trị)<br /> [5]. Có thể thấy, việc sử dụng HTKNR kịp<br /> thời đã giúp hạn chế di chứng cũng như<br /> thời gian nằm viện của BN bị rắn độc cắn.<br /> 2. Kết quả định lượng nọc rắn trên<br /> các mẫu bệnh phẩm lâm sàng.<br /> <br /> Biểu đồ 3: Phân bố thời gian nhập viện<br /> sau khi bị rắn cắn (n = 36).<br /> Thời gian nhập viện ảnh hưởng rất lớn<br /> đến việc điều trị và tiến triển của BN.<br /> Trong nghiên cứu của chúng tôi, BN chủ<br /> yếu nhập viện trong 24 giờ đầu, trong đó<br /> số BN đến viện trước 6 giờ chiếm 3/4.<br /> Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của<br /> Dong Zong Hung (2003) [6], Ngô Ngọc<br /> Quang Minh [4]. Rắn độc cắn là một trong<br /> những tai nạn có tỷ lệ tử vong cao, các<br /> triệu chứng tại chỗ và toàn thân xuất hiện<br /> sớm, điều này giải thích vì sao BN (nạn<br /> 62<br /> <br /> Biểu đồ 4: Phân bố nồng độ nọc rắn của<br /> BN lúc vào viện (n = 36).<br /> Nồng độ nọc rắn của BN lúc mới vào<br /> viện được định lượng bằng bộ xét nghiệm<br /> ELISA dao động từ 2,8 - 159,1 ng/ml. Kết<br /> quả của chúng tôi có độ dao động thấp<br /> hơn so với nghiên cứu của Dong Zong<br /> Hung và CS (2003) định lượng 27 mẫu<br /> huyết thanh BN bị rắn Hổ mang cắn có<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2017<br /> giá trị dao động khá lớn (0 - 1.270 ng/ml)<br /> [6]. Sự khác biệt này có thể là do số mẫu<br /> trong các nghiên cứu còn thấp nên chưa<br /> đủ để mang tính đại diện, nhiều trường<br /> hợp vào viện muộn nên kết quả định<br /> lượng có thể không tương xứng với triệu<br /> chứng lâm sàng. Tuy nhiên, với nồng độ<br /> nọc rắn định lượng được hầu hết < 50 ng/ml<br /> (26 BN = 72%), kết quả của chúng tôi<br /> tương đối phù hợp với nghiên cứu của<br /> Andrew Churchman (2010) [7], George E.<br /> Allen (2012) [8].<br /> <br /> Biểu đồ 5: Tương quan giữa nồng độ nọc<br /> rắn lúc vào viện và số liều huyết thanh<br /> điều trị (n = 27).<br /> Có mối liên hệ giữa nồng độ nọc rắn<br /> trong huyết thanh định lượng được khi<br /> BN nhập viện và số liều HTKNR (lọ)<br /> (r = 0,76). Phương trình mô tả sự liên<br /> quan giữa hai biến trên là: y = 0,20*x +<br /> 9,59 với y: số liều huyết thanh kháng nọc<br /> sử dụng (lọ); x: nồng độ nọc rắn trong<br /> huyết thanh lúc vào viện (ng/ml), phương<br /> trình này có ý nghĩa thống kê (p < 0,001).<br /> Hệ số xác định bội R2 = 0,51 càng khẳng<br /> định mối liên quan giữa hai biến kể trên.<br /> <br /> Biểu đồ 6: Tương quan giữa nồng độ nọc<br /> rắn lúc vào viện và số liều huyết thanh<br /> điều trị của nhóm BN nhập viện trong<br /> 6 giờ đầu (n = 15).<br /> Trên nhóm BN nhập viện trong 6 giờ<br /> đầu, mối liên quan giữa hai biến (số liều<br /> HTKNR và nồng độ nọc rắn lúc vào viện)<br /> càng chặt chẽ hơn (r = 0,81); phương<br /> trình thiết lập được: y = 0,21*x + 5,49 với<br /> y: số liều HTKNR sử dụng (lọ); x: nồng độ<br /> nọc rắn trong huyết thanh lúc nhập viện<br /> (ng/ml), phương trình này có ý nghĩa<br /> thống kê (p < 0,001) và hệ số xác định bội<br /> R2 = 0,72. Kết quả này gợi ý, nồng độ nọc<br /> rắn trong mẫu huyết thanh của BN trong<br /> những giờ đầu (khi nọc rắn còn trong<br /> huyết thanh của BN rắn độc cắn chưa<br /> phân tán hoàn toàn đến các mô đích)<br /> phản ánh tương đối chính xác mức độ<br /> nhiễm độc nọc rắn của BN. Trong điều<br /> kiện thực hành lâm sàng điều trị BN<br /> nhiễm độc nọc rắn do bị rắn cắn, một<br /> trong những khó khăn của bác sỹ lâm<br /> sàng là chỉ định khi nào cần sử dụng<br /> HTKNR, nếu sử dụng, liều HTKNR là bao<br /> nhiêu để có thể đủ trung hòa nọc rắn mà<br /> không lãng phí HTKNR do sử dụng quá<br /> liều. Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng<br /> độ nọc rắn trong huyết thanh có thể là<br /> một tiêu chí khách quan giúp bác sỹ lâm<br /> sàng chỉ định liều HTKNR phù hợp.<br /> 63<br /> <br />