Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của cây chè

Chia sẻ: Thi Thi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

61
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số kích thích sinh trưởng lên khả năng tạo mô sẹo và tái sinh của cây chè. Kết quả cho thấy 2,4-D phù hợp hơn NAA trong thí nghiệm tạo mô sẹo từ mẫu thân và lá chè. Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D thích hợp cho tạo mô sẹo từ lá chè và môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l 2,4-D thích hợp cho tạo mô sẹo từ thân cây chè.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của cây chè

Nguyễn Thị Hải Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 23 - 29 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TÁI SINH IN VITRO CỦA CÂY CHÈ Nguyễn Thị Hải Yến*, Trần Thị Thu Hương Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên TÓM TẮT Để chọn tạo các giống chè có năng suất và chất lượng tốt phục vụ nhu cầu sản xuất và tiêu thụ chè, việc ứng dụng công nghệ gen là một hướng tiếp cận có triển vọng. Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng công nghệ gen thường đòi hỏi hệ thống tái sinh phù hợp và hiệu quả cao. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã nghiên cứu ảnh hưởng của một số kích thích sinh trưởng lên khả năng tạo mô sẹo và tái sinh của cây chè. Kết quả cho thấy 2,4-D phù hợp hơn NAA trong thí nghiệm tạo mô sẹo từ mẫu thân và lá chè. Môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D thích hợp cho tạo mô sẹo từ lá chè và môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/l 2,4-D thích hợp cho tạo mô sẹo từ thân cây chè. Các mảnh lá mầm mang phôi đã xuất hiện chồi nhỏ sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường bổ sung BAP và kinetin. Các đoạn thân không chứa nách và mảnh lá không tái sinh trên môi trường MS có bổ sung BAP. Các nồng độ khác nhau của BAP trong môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng khác nhau đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang nách lá, môi trường MS bổ sung 1mg/l BAP thích hợp cho tái sinh đa chồi. Từ khóa: cây chè, tái sinh, kích thích sinh trưởng MỞ ĐẦU* Trên thế giới, chè là một trong những cây công nghiệp quan trọng, góp phần thu hút nhiều lao động dư thừa và là mặt hàng xuất khẩu thu ngoại tệ của nhiều nước [7]. Ở nước ta, cây chè là một trong 10 chương trình trọng điểm về phát triển nông nghiệp. Hiện nay, nhu cầu tiêu thụ chè trong nước và xuất khẩu ngày càng cao vì vậy công tác chọn tạo giống chè phải đáp ứng đòi hỏi ngày càng khắt khe hơn về giống có năng suất và chất lượng. Mặc dù đã có nhiều công trình nghiên cứu về cây chè nhưng chủ yếu đi sâu nghiên cứu về đặc tính sinh hóa, đặc điểm sinh thái, giải phẫu lá, thân; đặc điểm sinh trưởng, phát triển, năng suất chất lượng chè [1], [3]. Để cải thiện năng suất và nâng cao chất lượng cây giống, các phương pháp tiếp cận theo hướng công nghệ gen đã được chứng minh là cho kết quả khả quan trên nhiều đối tượng cây trồng. Một trong những kỹ thuật mới được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới sử dụng có hiệu quả trong việc nâng cao chất lượng cây trồng là kỹ thuật chuyển gen. Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi phải có hệ thống tái sinh phù hợp và hiệu quả. Đã có một số công trình * Tel: 0982 982291; Email: nguyenhaiyensh@gmail.com nghiên cứu về tái sinh chè được thực hiện đã cho thấy tiềm năng tái sinh cây chè in vitro khá cao [4] [5] [6] [8]. Trong bài báo này, chúng tôi công bố kết quả nghiên cứu khả năng tái sinh in vitro của giống chè Trung Du (Camellia sinensis var. Macrophylla). Các kết quả thu được sẽ là tiền đề cho những nghiên cứu sâu hơn nhằm cải thiện năng suất và chất lượng các giống chè trồng hiện nay. VẬT LIỆU, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Hạt của giống chè Trung Du (Camellia sinensis var. macrophylla) được Công ty chè Sông Cầu, huyện Đồng Hỷ, Thái Nguyên cung cấp. Phương pháp nghiên cứu Thu và xử lý mẫu Các hạt chè được chọn có kích thước to, chắc, không sâu bệnh. Trước khi tiến hành đưa vào nuôi cấy, các hạt chè được phơi khô và bảo quản trong lọ có chứa hạt silica gel hút ẩm ở nhiệt độ phòng. Khử trùng hạt đưa vào nuôi cấy Sử dụng javen 30 % hoặc HgCl2 0,1% theo các bước như sau: (1) Lắc hạt trong dung dịch cồn 70o với thời gian 1 phút, tráng qua nước cất. Sau đó tiếp tục lắc hạt trong dung dịch 23 Nguyễn Thị Hải Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ giaven 30% trong vòng 30 phút (hoặc HgCl2 0,1% trong vòng 10 phút). Tráng lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng. Các hạt sau đó được thấm khô trước khi đưa vào nuôi cấy. 123(09): 23 - 29 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện khử trùng tới việc nảy mầm của hạt Hạt chè trước khi khử trùng được chia làm 2 lô thí nghiệm, lô 1 tách vỏ sành còn lô 2 để nguyên vỏ. Cả 2 lô này đều được khử trùng sơ qua bằng cồn 70o trong 1 phút, rửa bằng nước cất, tiếp tục khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong vòng 10 phút. Sau đó, lô 1 được đặt lên môi trường MS, lô 2 đượ chia thành 2 phần, một phần đặt trực tiếp lên môi trường MS; phần còn lại được tách hết vỏ sành bằng dao sắc rồi mới đặt lên môi trường nuôi cấy. Kết quả sau 6 tuần nuôi cấy thu được tỉ lệ nảy mầm của những hạt tách vỏ rồi khử trùng là 16,7 %, thấp hơn tỉ lệ nảy mầm của hạt để nguyên vẹn và tách vỏ sành sau khử trùng. Điều này có thể giải thích như sau: khi tách vỏ sành trước khử trùng hóa chất khử trùng không những làm chết vi sinh vật mà còn gây ảnh hưởng tới phôi trong hạt nên ảnh hưởng tới tỷ lệ nảy mầm và dẫn đến tỷ lệ sống của hạt thấp. Ngược lại, những hạt chè tách vỏ sành sau khử trùng có tỷ lệ sống lớn (60%) và thời gian nảy mầm nhanh hơn cả. Tuy nhiên, công việc tách vỏ sau khi khử trùng rất khó khăn do hạt chè tròn và vỏ sành cứng nên khó thao tác trong box cấy. Tạo mô sẹo Sử dụng các mảnh lá (kích thước 1cm x 1cm) hoặc đoạn thân in vitro đặt lên môi trường tạo mô sẹo chắc các kích thích sinh trưởng nhóm auxin. Các mẫu nuôi cấy được đặt trong tối để kích thích phân chia tế bào. Tái sinh chồi Các thí nghiệm tái sinh chồi được thực hiện với các nguyên liệu khác nhau: (1) Tái sinh chồi từ mô sẹo (mô sẹo tạo thành từ lá chè) (2) Tái sinh chồi từ phôi hạt (hạt được cắt bỏ một bên lá mầm còn bên lá mầm chứa phôi cấy lên môi trường tái sinh chứa kích thích sinh trưởng tạo chồi) (3) Tái sinh chồi từ thân mầm (Các đoạn thân có kích thước 1 – 1,5 cm có hoặc không mang nách lá) được nuôi cấy trên môi trường tạo chồi. Môi trường sử dụng trong thí nghiệm là môi trường MS (Murashige & Skoog), bổ sung 30g/l đường sucrose, 9g/l agar và các chất kích thích sinh trưởng theo mục đích thí nghiệm. Bảng 1. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng tới việc nảy mầm của hạt tách vỏ và không tách vỏ sành Lô thí nghiệm Bóc vỏ sành trước khử trùng Để nguyên hạt Bóc vỏ sành sau khử trùng Số hạt nảy mầm mới sau các tuần 4 tuần 5 tuần 6 tuần Tổng Số hạt đưa vào 2 tuần 30 0 1 3 1 5 16,7 30 1 7 5 3 16 53,3 10 6 0 0 0 6 60 Hình 1. Hạt chè nảy mầm trên môi trường MS sau 3 tuần (A) và sau 6 tuần (B) 24 % Nguyễn Thị Hải Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 23 - 29 Bảng 2. Kết quả tạo mô sẹo từ mảnh lá chè Mô sẹo tạo thành trên môi trường 2,4-D Hàm lượng Số mẫu đưa vào Tỷ lệ tạo mô sẹo Sau 20 ngày Sau 40 ngày 0 15 0 0,5 15 1 Mô sẹo tạo thành trên môi trường NAA Hàm lượng Số mẫu đưa vào Sau 20 ngày Sau 40 ngày 13.33 ± 1,34 0 15 0 13.33 ± 1,34 40 ± 1,22 86,67 ± 1,32 0,5 18 16.67 ± 1,22 38,89 ± 1,15 14 35,71 ± 1,31 71,43 ± 1,41 1 18 22,22 ± 1,27 50 ± 1,78 1,5 12 33,33 ± 1,40 58,33 ± 1,21 1,5 18 22,22 ± 2,12 55,55 ± 1,98 2 12 25 ± 1,16 41,67 ± 1,34 2 18 38,80 ± 1,56 77,78 ± 2,25 Kết quả tạo mô sẹo Kết quả tạo mô sẹo từ lá chè Lá chè in vitro được sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm tạo mô sẹo. Các mảnh lá kích thước 1cm x 1cm được đặt lên môi trường MS bổ sung 2,4-D và NAA với các nồng độ thay đổi từ 0; 0,5; 1; 1,5 và 2 mg/l và nuôi trong điều kiện tối. Kết quả cho thấy, khả năng tạo mô sẹo của các mẫu lá chè ở các công thức môi trường bổ sung nồng độ 2,4-D khác nhau có sự khác nhau rõ rệt (Bảng 2). Sau 20 ngày theo dõi nhận thấy, mô sẹo bắt đầu hình thành tại những vết cắt và tỷ lệ mô sẹo là khác nhau ở các công thức môi trường có bổ sung 2,4-D. Nhìn chung, khi tăng nồng độ 2,4-D theo dãy nồng độ 0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l thì tỷ lệ mô sẹo giảm tương ứng 40%, 35,71%, 33,33%, 25%. Sau 40 ngày nuôi cấy, mô sẹo đạt kích thước lớn hơn, sắc màu có phần chuyển sang hơi xanh sau đó dần chuyển sang màu đỏ thẫm. Tỷ lệ tạo mô sẹo vẫn giảm dần khi nồng độ 2,4-D tăng dần. Tỷ lệ tạo mô sẹo cao và đồng đều nhất tại tất cả các mô nuôi cấy là môi trường bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D (86,67%). Trên môi trường tạo mô sẹo bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau sau 20 ngày đã bắt đầu hình thành mô sẹo. Khi tăng nồng độ NAA từ 0,5 mg/l lên 2,5 mg/l thì tỷ lệ tạo mô sẹo tăng tương ứng là 16,67%, 22,22%, 22,22%, 38,80%, 50%. Sau 40 ngày nuôi cấy tỷ lệ tương ứng đạt 38,89%, 50%, 55,55%, 88,89%. Tuy nhiên kích thước khối mô không có sự tăng trưởng rõ rệt như trên môi trường bổ sung 2,4-D ở cùng thời gian nuôi cấy. Kết quả tạo mô sẹo từ đoạn thân chè Đối với các đoạn thân in vitro trên các môi trường tạo mô sẹo bổ sung 2,4-D với các nồng độ khác nhau thì sau 20 ngày nuôi cấy mô sẹo đã bắt đầu được tạo thành. Tuy nhiên, kích thước mô sẹo còn rất nhỏ chỉ là những hạt trắng li ti tại các vết cắt. Khác với thí nghiệm ảnh hưởng của 2,4-D đến khả năng tạo mô sẹo ở lá cây, khi thay đổi nồng độ 2,4D từ 0,5; 1; 1,5 và 2 mg/l thì tỷ lệ tạo mô sẹo từ thân lại tăng lên tương ứng (từ 25% lên 41,67%). Sau 40 ngày nuôi cấy thấy tỷ lệ tạo mô sẹo ở các nồng độ 2,4-D là 0,5; 1; 1,5 mg/l thì tỷ lệ tạo mô sẹo tăng tương ứng 58,33%, 66,67%, 83,33%. Nhưng tại môi trương có 2mg/l 2,4-D thì tỷ lệ tạo mô sẹo lại giảm điều này chứng tỏ ở nồng độ 2,4-D 2 mg/l đã bắt đầu gây độc cho cây khi thời gian nuôi cấy kéo dài. Đối với các công thức môi trường bổ sung NAA chúng tôi nhận thấy, giống như ảnh hưởng của NAA lên khả năng tạo mô sẹo từ lá chè. Khi tăng nồng độ NAA từ 0,5 mg/l đến 2,5 mg/l thì tỷ lệ tạo mô sẹo cũng tăng tương ứng là 13,33%, 27,78%, 50%, 55,56%, 58,82% sau 20 ngày và là 33,33%, 61,11%, 83,33%, 94,44%, 94,11% sau 40 ngày nuôi cấy. Tuy nhiên ở đây có thể nhận thấy kích thước mô sẹo tương đối hạn chế. 25 Nguyễn Thị Hải Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ 123(09): 23 - 29 Bảng 3. Kết qủa tạo mô sẹo từ đoạn thân chè Mô sẹo tạo thành trên môi trường 2,4-D 2,4-D mg/l Số mẫu đưa vào 0 Mô sẹo tạo thành trên môi trường NAA Tỷ lệ tạo mô sẹo Sau 20 ngày Sau 40 ngày NAA mg/l 15 6,67 ± 1,73 20 ± 1,23 0 0,5 12 25 ± 1,35 58,33 ± 1,56 1 12 25 ± 1,72 1,5 12 2 12 Số mẫu đưa vào Tỷ lệ tạo mô sẹo Sau 20 ngày Sau 40 ngày 15 6,67 ± 1,73 20 ± 1,23 0,5 15 13,33 ± 1.67 33,33 ± 1,57 66,67 ± 1,34 1 18 27,78 ± 1,89 61,11 ± 1,26 41,67 ± 1,23 83,33 ± 1,55 1,5 18 50 ± 1,23 83,33 ± 1,37 41,67± 1,42 75 ± 1,47 2 18 55,56 ± 1,56 94,44 ± 1,24 Hình 3. Hình ảnh mô sẹo được tạo thành từ lá chè và đoạn thân sau 20 ngày nuôi cấy (A; B) Mô sẹo được tạo thành từ lá trên môi trường bổ sung 2,4D và NAA (C; D) Mô sẹo được tạo thành từ thân trên môi trường bổ sung 2,4D và NAA Bảng 4. Ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/cytokinin đến sự phân hóa mô sẹo lá cây Chè NAA (mg/l) 0 0,5 26 BAP (mg/l) 1 1,5 2 1 1,5 2 Số mẫu đưa vào 20 17 23 21 20 25 Sự phân hóa của mô sẹo sau 50 ngày Tạo rễ Lục hóa Tái sinh 0 75,73 ± 1,37 0 0 94,11 ± 1,41 0 0 86,95 ± 1,98 0 28,57 ± 1,13 85,71 ± 1,25 0 90,85 ± 1,16 100 ± 0,00 0 95,21 ± 1,73 100 ± 0,00 0 Nguyễn Thị Hải Yến và Đtg Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ Từ các kết quả trên có thể cho rằng 2,4-D phù hợp hơn NAA trong thí nghiệm tạo mô sẹo từ mẫu thân và lá chè. Tỷ lệ tạo mô sẹo trên môi trường bổ sung 2,4-D cao đồng thời kích thước khối mô to và chắc hơn. Kết quả Tái sinh chồi Sự phân hóa chồi từ mô sẹo Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ auxin/cytokinin đến sự phân hóa mô sẹo lá cây chè được thể hiện ở trong bảng 3.10. Nhìn chung, tỷ lệ lục hóa của mô sẹo ở các môi trường bổ sung các chất kích thích sinh trưởng đều cao đạt trên 75%. Cao nhất ở trên 2 môi trường bổ sung 0,5mg/l NAA và 1,5 – 2,0mg/l BAP, đều đạt tới 100% ở 3 lần thí nghiệm khác nhau. Ở các môi trường chỉ bổ sung BAP nhận thấy khả năng tạo rễ rất hạn chế. Tiến hành bổ sung NAA 0,5 mg/l vào các môi trường nuôi cấy thì kết quả cho thấy cả tỷ lệ lục hóa và tỷ lệ tạo rễ đều tăng mạnh. Trên môi trường chứa NAA 0,5mg/l; BAP l,5mg/l và 2mg/l thì tỷ lệ tạo rễ tương ứng là 90,85%; 95,21% còn tỷ lệ lục hóa đạt tới 100%. Kết quả tái sinh đa chồi trực tiếp từ mảnh lá mầm mang phôi Trong nghiên cứu quy trình tái sinh cây trồng phục vụ chuyển gen, tái sinh chồi trực tiếp từ mảnh lá mầm mang phôi hoặc không mang phôi đã được tiến hành trên nhiều đối tượng thực vật như đậu tương (từ phôi mầm) hay cà chua (từ mảnh lá mầm). Với mục đích tìm hiểu khả năng tái sinh đa chồi trực tiếp từ phôi mầm, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy các mảnh lá mầm mang phôi lên môi trường tái sinh đa chồi (MS bổ sung BAP và kinetinvới các nồng độ thay đổi.) Sau 6 tuần nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy, các mẫu lá mầm mang phôi đã xuất hiện chồi nhỏ và chậm phát triển hơn về chiều cao, đặc điểm 123(09): 23 - 29 của cây là lùn, lá to, xanh, tuy nhiên chúng tôi chưa thu được sự khác biệt trên các môi trường nuôi cấy. Kết quả tái sinh chồi từ đoạn thân Các thân mầm được nảy mầm sau 10 tuần được chúng tôi sử dụng để tiến hành tái sinh chồi. Những đoạn thân dài khoảng 1cm có hoặc không mang nách lá được cấy lên môi trường MS có bổ sung BAP với nồng độ thay đổi từ 0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l; 2mg/l; 2,5mg/l; 3mg/l. Đối với các đoạn thân không mang nách lá, chúng tôi không thu được chồi tái sinh, các mẫu nuôi cấy đen dần rồi chết. Ngược lại, với các mẫu mang nách lá, sau khoảng 2 tuần đã thấy chồi được hình thành ở tất cả các mẫu tái sinh. Sau 6 tuần quan sát nhận thấy các mẫu thân trên tất cả môi trường bổ sung BAP đều thấy xuất hiện đa chồi (Bảng 5). Kết quả thu được cho thấy, ở môi trường bổ sung 0,5mg/l; 1mg/l; 1,5mg/l BAP cho hệ số nhân chồi cao tương ứng là 2,39; 3,15; 2,82. Tuy nhiên, ở nồng độ 1,5mg/l BAP hệ số nhân chồi giảm so với ở nồng độ 1mg/l BAP chứng tỏ ở nồng độ này đã có sự ảnh hưởng của nồng độ hóa chất tới sự sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. So sánh với kết quả nhân chồi của Sandal và cộng sự 2005, tác giả đã thiết lập được quy trình tái sinh chồi đạt kết quả tối ưu là 14 ± 1,16 chồi/ mẫu cấy sau 24 tuần nuôi cấy. Trong nghiên cứu đó, tác giả đã sử dụng 2,4-D là chất điều hoà sinh trưởng với nồng độ rất cao (7,5 - 10 mg/l) và nuôi cấy trong thời gian khá dài (hơn 5 tháng) [8]. Mặc dù kết quả tốt nhất chúng tôi thu được trung bình khoảng 5 chồi/mẫu tái sinh nhưng thời gian nuôi cấy ngắn hơn nhiều (sau 6 tuần nuôi cấy) và nồng độ chất điều hoà sinh trưởng cũng thấp hơn nhiều (0 - 3 mg/l BAP). Bảng 5. Ảnh hưởng của BAP lên khả năng tái sinh cây của thân mầm Lô thí nghiệm 1 2 3 4 5 6 7 Nồng độ BAP (mg/l) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Số thân mầm đưa vào 12 18 20 20 20 17 19 Số chồi tái sinh trung bình 12 43 63 57 37 31 25 Hệ số nhân 1 ± 0,00 2,39 ± 0,01 3,15 ± 0,02 2,85 ± 0,03 1,85 ± 0,04 1,82 ± 0,01 1,32 ± 0,02 27