Nghiên cứu một số chỉ số chống oxy hóa và sinh hóa chức năng gan trên chuột thực nghiệm uống cao khô đông trùng hạ thảo

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ SỐ CHỐNG OXY HÓA VÀ SINH HÓA<br /> CHỨC NĂNG GAN TRÊN CHUỘT THỰC NGHIỆM<br /> UỐNG CAO KHÔ ĐÔNG TRÙNG HẠ THẢO (Cordyceps militaris)<br /> Lê Minh Hoàng*; Nguyễn Hoàng Ngân**; Nguyễn Bá Quang***<br /> Nghiêm Hữu Thành***; Nguyễn Duy Bắc**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: đánh giá ảnh hưởng của cao khô đông trùng hạ thảo (ĐTHT) lên thay đổi một số<br /> chỉ số chống oxy hóa và sinh hóa chức năng gan trên chuột nhắt trắng gây tổn thương gan bằng<br /> paracetamol. Đối tượng và phương pháp: chuột nhắt trắng điều trị trước bằng ĐTHT trong 6 ngày,<br /> sau đó gây độc gan bằng paracetamol 400 mg uống trong 2 ngày liên tiếp. Xác định các chỉ số chống<br /> oxy hóa và sinh hóa chức năng gan. Kết quả: ĐTHT liều 160 mg/kg/24 giờ và 320 mg/kg/24 giờ<br /> dùng đường uống ở chuột nhắt trắng gây độc bằng paracetamol có tác dụng làm giảm hàm<br /> lượng MDA gan, tăng chỉ số GSH gan, SOD, TAS, GSH máu, làm giảm enzym AST, ALT máu<br /> tương đương với silymarin liều 67 mg/kg/24 giờ, hồi phục các chỉ số trên về giá trị tương<br /> đương với lô chứng sinh lý. Chỉ số protein toàn phần và albumin máu biến đổi không có ý nghĩa<br /> thống kê. Kết luận: ĐTHT có tác dụng chống oxy hóa tốt, bảo vệ gan trên mô hình thực nghiệm.<br /> * Từ khóa: Đông trùng hạ thảo; Chống oxy hóa; Sinh hóa; Chức năng gan; Thực nghiệm.<br /> <br /> Research on the Effect of Cordyceps Militaris Dried Extract on the<br /> Variation of Anti-oxidant Indices and Biochemical Markers of Liver<br /> Function in Experimental Mice<br /> Summary<br /> Objectives: To evaluate the effect of Cordyceps militaris dried extract on the variation of antioxidant indices and biochemical markers of liver function in paracetamol-induced liver damage<br /> mice. Subjects and methods: After 6 days of orally pre-treatment of Cordyceps militaris dried<br /> extract 160 and 320 mg/kg body weight/day, hepatotoxicity was induced in mice by oral<br /> administration of paracetamol 400 mg/kg on two consecutive days. Anti-oxidant indices and<br /> biochemical markers of liver function wwere measured. Results: Cordyceps militaris dried<br /> extract 160 and 320 mg/kg body weight/day orally administration in paracetamol-induced liver<br /> damage mice had the effects on reducing MDA in liver; increasing GSH in liver, SOD, TAS and<br /> GSH in serum; reducing AST, ALT in serum; restored these indeces to the value equivalent to<br /> physiological control group. Change of total protein and albumin in serum was not statistically<br /> significant. Conclusions: Cordyceps militaris dried extract have good antioxidant and<br /> hepatoprotective effects on the experimental model.<br /> * Keywords: Cordyceps militaris; Anti-oxidant; Biochemical markers; Liver function; Experiment.<br /> * Đại học Y Dược Cần Thơ<br /> ** Học viện Quân y<br /> *** Bệnh viện Châm cứu Trung ương<br /> Người phản hồi (Corresponding): Nguyễn Duy Bắc (bac_hvqy@yahoo.com)<br /> Ngày nhận bài: 30/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 05/09/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 09/09/2017<br /> <br /> 601<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Trùng thảo (Cordyceps) là một chi nấm<br /> mọc trên ấu trùng của côn trùng. Có > 350<br /> loài Cordyceps, tuy nhiên tên gọi ĐTHT<br /> thường dùng cho 2 loài đã được chứng<br /> minh có hoạt chất và tác dụng sinh học<br /> quý là Cordyceps sinensis và Cordyceps<br /> militaris. ĐTHT có nhiều tác dụng sinh<br /> học quý, trong đó có tác dụng chống oxy<br /> hóa, bảo vệ gan [1, 2, 3]. Nhiều cơ sở<br /> trong nước, trong đó có Học viện Quân y<br /> đã nuôi cấy thành công nấm ĐTHT<br /> Cordyceps militaris. Tuy nhiên, chưa có<br /> nhiều nghiên cứu về tác dụng dược lý<br /> của ĐTHT nuôi cấy tại Việt Nam. Vì vậy,<br /> nghiên cứu này được tiến hành với mục<br /> tiêu: Đánh giá một số chỉ số chức năng<br /> gan và chống oxy hóa trong máu chuột<br /> thực nghiệm gây độc bằng paracetamol<br /> uống cao khô ĐTHT Cordyceps militaris<br /> nuôi cấy tại Việt Nam.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Đối tƣợng nghiên cứu.<br /> - Chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh,<br /> trọng lượng 20 ± 2 g, do Ban Cung cấp<br /> Động vật Thí nghiệm, Học viện Quân y<br /> cung cấp. Nuôi dưỡng chuột trong điều<br /> kiện phòng nuôi và thức ăn chuẩn dành<br /> cho động vật nghiên cứu, chuột làm quen<br /> với điều kiện thí nghiệm 1 tuần trước khi<br /> tiến hành thí nghiệm.<br /> - Chế phẩm nghiên cứu:<br /> Bột cao khô ĐTHT bào chế từ ĐTHT<br /> Cordyceps militaris nuôi cấy tại Việt Nam,<br /> đạt tiêu chuẩn cơ sở.<br /> 602<br /> <br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> Tiến hành theo phương pháp của<br /> Kuppan Nithianantham và CS (2011) [1].<br /> Chia ngẫu nhiên chuột nhắt trắng thành<br /> 5 lô, mỗi lô 10 con.<br /> - Lô 1 (chứng sinh lý): uống nước cất.<br /> - Lô 2 (chứng gây độc): uống nước cất<br /> + paracetamol.<br /> - Lô 3 (lô silymarin): uống silymarin liều<br /> 67 mg/kg/24 giờ + paracetamol.<br /> - Lô 4 (ĐTHT liều 1): uống cao khô<br /> ĐTHT 160 mg/kg/24 giờ + paracetamol.<br /> - Lô 5 (ĐTHT liều 2): uống cao khô<br /> ĐTHT 320 mg/kg/24 giờ + paracetamol.<br /> Cho chuột uống bằng kim cong đầu tù,<br /> hàng ngày vào 8 giờ sáng, trong 6 ngày<br /> liên tục. Sau 6 ngày điều trị trước bằng<br /> ĐTHT, chuột được gây độc (ngoại trừ lô 1)<br /> bằng paracetamol uống 400 mg/kg trong<br /> 2 ngày liên tục. Sau gây độc 2 ngày, giết<br /> chuột, đánh giá các chỉ số:<br /> - Xét nghiệm MDA gan theo phương<br /> pháp của I.U.A Vladymyrop và CS (1972).<br /> Ủ dịch đồng thể 2% của mẫu gan chuột<br /> trong dung dịch đệm Tris (pH = 7,4) ở<br /> 37oC trong 45 phút. Thêm dung dịch axít<br /> tricloacetic (TCA) 30% (1/5 thể tích dịch<br /> đồng thể), lắc kỹ cho phản ứng tạo tủa.<br /> Lọc loại bỏ tủa. Lấy 2 ml dung dịch trong,<br /> thêm vào 2 ml dung dịch axít<br /> thiobarbituric (TBA) 0,25%. Đun cách thuỷ<br /> ở 100oC trong 15 phút. Để nguội đến<br /> nhiệt độ phòng. Đo quang ở max = 532 nm,<br /> từ đó tính hàm lượng MDA.<br /> - Xét nghiệm GSH trong gan theo<br /> phương pháp của G.A Hazenton và C.A<br /> Lang (1980). Tạo dịch đồng thể 9% của<br /> mẫu gan chuột trong dung dịch axít<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> metaphosphoric 5%. Thêm dung dịch axít<br /> tricloacetic (TCA) 30%, lắc kỹ cho phản<br /> ứng tạo tủa. Lọc loại bỏ tủa. Lấy 0,5 ml<br /> dung dịch trong cho vào 4,5 ml dung dịch<br /> gồm: thuốc thử ellman 0,1 mM/ml trong<br /> hỗn hợp đệm Na3PO4 0,1 M và EDTA<br /> 0,05 M. Ủ ở nhiệt độ 25oC trong 2 phút.<br /> <br /> - Xét nghiệm AST (aspartate<br /> aminotransferase),<br /> ALT<br /> (alanine<br /> aminotransferase), protein toàn phần và<br /> albumin trong máu chuột bằng máy xét<br /> nghiệm sinh hoá (Biochemical Systems<br /> International Srl, Italia, model 3000<br /> Evolution), hóa chất (Hãng MEDIA, Italia).<br /> <br /> Đo quang ở bước sóng  = 412 nm, từ đó<br /> tính hàm lượng GSH.<br /> <br /> * Xử lý số liệu:<br /> Phân tích thống kê bằng one-way<br /> ANOVA, Tukey test, sử dụng phần mềm<br /> SPSS 13.1. Khác biệt có ý nghĩa thống kê<br /> khi p < 0,05.<br /> <br /> - Xét nghiệm SOD, TAS và GSH trong<br /> máu bằng kít xét nghiệm (Hãng Sigma,<br /> Hoa Kỳ).<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU<br /> 1. Một số chỉ số chống o<br /> paracetamol uống c o khô ĐTHT.<br /> <br /> h<br /> <br /> trên chuột nhắt trắng gâ<br /> <br /> độc bằng<br /> <br /> * Hàm lượng MDA và GSH gan:<br /> Bảng 1: Hàm lượng MDA và GSH gan chuột (mean ± SD, n = 10).<br /> Hàm lƣợng MDA trong gan<br /> <br /> Hàm lƣợng GSH trong gan<br /> <br /> (nmol/g tổ chức)<br /> <br /> (g/g tổ chức)<br /> <br /> Chứng sinh lý (1)<br /> <br /> 6,83 ± 1,16<br /> <br /> 0,77 ± 0,14<br /> <br /> Chứng gây độc (2)<br /> <br /> 9,45 ± 0,95<br /> <br /> 0,51 ± 0,09<br /> <br /> Silymarin (3)<br /> <br /> 7,00 ± 2,12<br /> <br /> 0,69 ± 0,08<br /> <br /> ĐTHT liều 1 (4)<br /> <br /> 7,76 ± 1,40<br /> <br /> 0,68 ± 0,12<br /> <br /> ĐTHT liều 2 (5)<br /> <br /> 7,43 ± 1,20<br /> <br /> 0,71 ± 0,13<br /> <br /> Lô nghiên cứu<br /> <br /> p<br /> <br /> p1,3,4,5-2 < 0,01; p3,4,5-1 > 0,05; p4,5-3 > 0,05; p4-5 > 0,05<br /> <br /> So với lô chứng sinh lý, lô chứng gây độc có hàm lượng MDA trong gan tăng, hàm<br /> lượng GSH trong gan giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Lô ĐTHT có hàm lượng<br /> MDA gan thấp hơn, hàm lượng GSH gan cao hơn so với lô chứng gây độc (p < 0,01),<br /> hồi phục tương đương so với lô chứng sinh lý (p > 0,05). So với lô tham chiếu dùng<br /> silymarin, hàm lượng MDA và GSH trong gan chuột ở các lô ĐTHT tương đương<br /> nhau, không có khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).<br /> 603<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> * Chỉ số GSH/máu, SOD/máu, TAS huyết tương:<br /> Bảng 2: Nồng độ GSH/máu, SOD/máu, TAS huyết tương ở các lô chuột nghiên cứu<br /> (mean ± SD, n = 10).<br /> Lô nghiên cứu<br /> <br /> Nồng độ GSH máu<br /> (g /ml)<br /> <br /> Nồng độ SOD máu<br /> (ng/ml)<br /> <br /> TAS huyết tƣơng<br /> (UI/ml)<br /> <br /> Chứng sinh lý (1)<br /> <br /> 304,33 ± 23,48<br /> <br /> 93,27 ± 4,93<br /> <br /> 3,60 ± 0,25<br /> <br /> Chứng gây độc (2)<br /> <br /> 254,50 ± 32,20<br /> <br /> 72,00 ± 2,53<br /> <br /> 2,97 ± 0,05<br /> <br /> Silymarin (3)<br /> <br /> 299,65 ± 25,79<br /> <br /> 91,10 ± 7,49<br /> <br /> 3,54 ± 0,21<br /> <br /> ĐTHT liều 1 (4)<br /> <br /> 295,16 ± 22,63<br /> <br /> 89,64 ± 6,66<br /> <br /> 3,51 ± 0,29<br /> <br /> ĐTHT liều 2 (5)<br /> <br /> 315,12 ± 76,65<br /> <br /> 92,98 ± 13,36<br /> <br /> 3,56 ± 0,42<br /> <br /> p<br /> <br /> p1,3,4,5-2 < 0,01; p3,4,5-1 > 0,05; p4,5-3 > 0,05; p4-5 > 0,05<br /> <br /> So với lô chứng sinh lý, lô chứng gây độc có nồng độ GSH máu, SOD máu và TAS<br /> huyết tương giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,01). Các lô ĐTHT có nồng độ GSH máu,<br /> SOD máu và TAS huyết tương cao hơn so với lô chứng gây độc (p < 0,01), hồi phục<br /> tương đương so với lô chứng sinh lý (p > 0,05). So với lô silymarin, nồng độ GSH<br /> máu, SOD máu và TAS huyết tương chuột ở các lô ĐTHT tương đương, không khác<br /> biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).<br /> 2. Một số chỉ số h sinh chức năng g n trên chuột nhắt trắng gâ độc bằng<br /> paracetamol uống c o khô ĐTHT.<br /> Bảng 3: Chỉ số hóa sinh chức năng gan trong máu chuột nghiên cứu (mean ± SD,<br /> n = 10).<br /> Lô nghiên cứu<br /> <br /> Hoạt độ AST (U/l )<br /> <br /> Hoạt độ ALT (U/l ) Protein toàn phần (g/l ) Albumin (g/l )<br /> <br /> Chứng sinh lý (1)<br /> <br /> 188,90 ± 118,61<br /> <br /> 43,00 ± 22,77<br /> <br /> 50,80 ± 16,02<br /> <br /> 26,20 ± 7,96<br /> <br /> Chứng gây độc (2)<br /> <br /> 586,20 ± 143,12<br /> <br /> 66,40 ± 10,32<br /> <br /> 48,60 ± 15,34<br /> <br /> 23,40 ± 6,40<br /> <br /> Silymarin (3)<br /> <br /> 218,30 ± 79,00<br /> <br /> 43,80 ± 13,98<br /> <br /> 51,40 ± 7,46<br /> <br /> 26,90 ± 4,41<br /> <br /> ĐTHT liều 1 (4)<br /> <br /> 221,80 ± 108,44<br /> <br /> 47,30 ± 15,73<br /> <br /> 49,60 ± 15,94<br /> <br /> 24,60 ± 6,98<br /> <br /> ĐTHT liều 2 (5)<br /> <br /> 205,40 ± 89,10<br /> <br /> 44,30 ± 17,30<br /> <br /> 50,20 ± 14,00<br /> <br /> 25,20 ± 7,36<br /> <br /> p<br /> <br /> p1,3,4,5-2 < 0,01; p3,4,5-1 > 0,05;<br /> <br /> p1-2,3,4,5 > 0,05; p2-3,4,5 > 0,05;<br /> <br /> p4,5-3 > 0,05; p4-5 > 0,05<br /> <br /> p3-4,5 > 0,05; p4-5 > 0,05<br /> <br /> Hoạt độ enzym AST và ALT trong máu ở lô chứng gây độc tăng, có ý nghĩa thống<br /> kê so với lô chứng sinh lý (p < 0,01). Các lô ĐTHT và lô dùng silymarin có hoạt độ<br /> enzym AST và ALT trong máu giảm so với lô chứng gây độc (p < 0,01), hồi phục<br /> tương đương so với lô chứng sinh lý (p > 0,05). Không có khác biệt giữa các lô ĐTHT<br /> và lô dùng silymarin (p > 0,05). Nồng độ protein toàn phần và albumin trong máu ở các<br /> lô không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).<br /> 604<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Mô hình thực nghiệm gây tổn thương<br /> gan bằng paracetamol được nhiều tác giả<br /> sử dụng [1, 3, 5]. Chỉ số đánh giá gồm<br /> hàm lượng MDA gan (đánh giá tác dụng<br /> ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế<br /> bào của chế phẩm), hàm lượng GSH gan,<br /> GSH, SOD và TAS trong máu (đánh giá<br /> ảnh hưởng của chế phẩm lên tình trạng<br /> chống oxy hóa của cơ thể). Nghiên cứu<br /> cho thấy ĐTHT có tác dụng hồi phục tốt<br /> các chỉ số này trên chuột gây độc bằng<br /> paracetamol, chứng tỏ tác dụng chống<br /> oxy hóa của chế phẩm. Kết quả này phù<br /> hợp với một số nghiên cứu đã công bố về<br /> tác dụng chống oxy hóa của ĐTHT [1, 2,<br /> 3]. Chỉ số về hoạt độ enzym AST và ALT<br /> được dùng để đánh giá khi có tổn thương<br /> tế bào gan. Cao khô ĐTHT làm giảm hoạt<br /> độ các enzym này trong máu. Với kết quả<br /> về tác dụng làm giảm MDA gan và tăng<br /> GSH gan thấy: chế phẩm có tác dụng bảo<br /> vệ, làm giảm tổn thương tế bào gan,<br /> được giải thích một phần cơ chế do tác<br /> dụng chống oxy hóa, làm giảm quá trình<br /> peroxy hóa lipid màng tế bào gan. Kết<br /> quả nghiên cứu về nồng độ protein toàn<br /> phần và albumin huyết tương ở các lô<br /> chuột không biến đổi đáng kể (p > 0,05),<br /> có thể lý giải do khả năng bù trừ của gan<br /> rất lớn.<br /> KẾT LUẬN<br /> Kết quả nghiên cứu cho thấy cao khô<br /> ĐTHT Việt Nam với liều 160 mg/kg/24 giờ<br /> <br /> và liều 320 mg/kg/24 giờ có tác dụng<br /> chống oxy hóa (làm giảm hàm lượng<br /> MDA gan, phục hồi GSH gan, SOD, TAS,<br /> GSH máu) và tác dụng bảo vệ gan (làm<br /> giảm enzym AST, ALT huyết tương),<br /> tương<br /> đương<br /> với<br /> silymarin<br /> liều<br /> 67 mg/kg/24 giờ khi đánh giá trên chuột<br /> nhắt trắng gây độc bằng paracetamol.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Kuppan Nithianantham, Murugesan<br /> Shyamala, Yeng Chen, Lachimanan Yoga<br /> Latha, Subramanion L Jothy and Sreenivasan<br /> Sasidharan. Hepatoprotective potential of<br /> clitoriaternatea<br /> leaf<br /> extract<br /> against<br /> paracetamol induced damage in mice.<br /> Molecules. 2011, 16, pp.10134-10145;<br /> doi:10.3390/molecules161210134.<br /> 2. Reis F.S, Barros L, Calhelha R.C, Cirić<br /> A, van Griensven L.J, Soković M, Ferreira I.C.<br /> The methanolic extract of Cordyceps militaris<br /> (L.) Link fruiting body shows antioxidant,<br /> antibacterial, antifungal and antihuman tumor<br /> cell lines properties. Food Chem Toxicol.<br /> 2013, 62, pp.91-8. doi: 10.1016/j.fct.2013.08.033.<br /> Epub 2013 Aug 27.<br /> 3. Yu Zhan, Cai-Hong Dong, Yi-Jian Yao.<br /> Anti-oxidant activities of aqueous extract from<br /> cultivated fruit-bodies of Cordyceps militaris<br /> (L.) Link in vitro. Journal of Integrative Plant<br /> Biology. 2006, 48 (11), pp.1365-1370.<br /> 4. Wang L, Xu N, Zhang J, Zhao H, Lin L, Jia<br /> S, Jia L. Antihyperlipidemic and hepatoprotective<br /> activities of residue polysaccharide from<br /> Cordyceps militaris SU-12. Carbohydr Polym.<br /> 2015, 131, pp.355-62. doi: 10.1016/j.carbpol.<br /> 2015.06.016. Epub 2015, Jun 17.<br /> <br /> 605<br /> <br />