Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư của chất CT-1 chiết xuất từ cây khổ sâm trên chuột thiếu hụt miễn dịch

TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƢ CỦA<br /> CHẤT CT-1 CHIẾT XUẤT TỪ CÂY KHỔ SÂM CHO LÁ<br /> TRÊN CHUỘT THIẾU HỤT MIỄN DỊCH<br /> Trịnh Hồng Anh*; Cao Minh Hưng*; Hồ Anh Sơn**; Nguyễn Lĩnh Toàn**<br /> Phương Thiện Thương*; Nguyễn Minh Khởi*; Lê Tuấn Anh*<br /> TÓM TẮT<br /> Với liều 50 mg/kg thể trọng, chất CT-1 chiết xuất từ cây Khổ sâm cho lá có tác dụng dự<br /> phòng và điều trị ung thư phổi người tế bào không nhỏ (UTPNTBKN) trên chuột thiếu hụt miễn<br /> dịch, thể hiện:<br /> - Sau khi ghép tế bào (TB) ung thư, nhóm dự phòng có 20% chuột không xuất hiện khối u,<br /> trong khi nhóm chứng và nhóm điều trị 100% xuất hiện khối u.<br /> - Kích thước khối u ở nhóm điều trị nhỏ hơn nhóm chứng ở mọi thời điểm theo dõi.<br /> - Sau 3 tháng theo dõi, tỷ lệ chuột chết ở nhóm chứng là 100%, nhóm dự phòng 60%, nhóm<br /> điều trị 40%.<br /> * Từ khóa: Khổ sâm cho lá; Độc tính cấp; Độc tính bán trường diễn.<br /> <br /> Research about Anticancer of CT-1 Extracted from Croton tonkinensis<br /> Gagnep on Nude Mice<br /> Summary<br /> CT-1 extracted from Croton tonkinensis Gagnep with dose of 50 mg/kg has the effective<br /> in prevention and treatment of lung cancer on nude mice:<br /> - After cancer cell transplantation, 20% of mice in control group had no tumor, 100% of mice in<br /> prevention and treatment groups had tumor.<br /> - The volume of tumor in treatment group was smaller than the other groups at any times.<br /> - After 3 months: control goup: 100% of nude mice dead, prevention group: 60% of nude<br /> mice dead, treatment group: 40% of nude mice dead.<br /> * Key words: C. tonkinensis; Acute toxicity; Semi-chronic toxicity.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Cây Khổ sâm cho lá có tên khoa học là<br /> Croton tonkinensis Gagnep, thuộc họ Thầu<br /> dầu (Euphorbiaceae), là một loại cây đặc<br /> <br /> hữu của Việt Nam được sử dụng làm<br /> thuốc chữa sốt rét, mẩn ngứa, lở loét,<br /> đau bụng đi ngoài (lỵ cấp tính), ăn không<br /> tiêu, viêm loét tá tràng, đau dạ dày.<br /> <br /> * Trường Đại học Khoa học Tự nhiên<br /> ** Học viện Quân y<br /> *** Viện Dược liệu<br /> Người phản hồi (Corresponding): Hồ Anh Sơn (hoanhsonhp@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 10/11/2014; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 27/11/2014<br /> Ngày bài báo được đăng: 28/11/2014<br /> <br /> 19<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014<br /> <br /> Các nghiên cứu về thành phần hóa<br /> học của cây Khổ sâm cho lá bắt đầu<br /> khoảng 20 năm trở lại đây cho thấy thành<br /> phần hóa học chính của lá Khổ sâm cho<br /> lá là ent-kauranediterpenoid, điển hình là<br /> ent-18-acetoxy-7β-hydroxy..kaur-15-oxo16-ene (tạm gọi là chất CT-1), có hàm<br /> lượng khoảng 293,05 µg/g [3]. Chất này<br /> có tác dụng ức chế sự phát triển của<br /> nhiều dòng TB ung thư trên in vitro, g m<br /> thư v MCF-7, ung thư phổi NCI-H460<br /> [6], ung thư gan SK-HEP1 [7], ung thư đại<br /> tràng Caco-2 và LS180 trên in vitro [8].<br /> Sử dụng chuột thiếu hụt miễn dịch (gọi<br /> tắt là chuột nude) là một bước đột phá<br /> trong nghiên cứu ung thư, cho phép<br /> nghiên cứu ung thư người trên cơ thể<br /> động vật. Chuột nude có một gen bị đột<br /> biến đ ng hợp tử (homozygous), gen này<br /> quy định sự phát triển của lông và tuyến<br /> ức. Do đó, với gen bị đột biến, chuột nude<br /> có tuyến ức bị suy giảm chức năng hoặc<br /> thậm chí không có tuyến ức, không có<br /> lông và hệ thống đáp ứng miễn dịch TB bị<br /> hạn chế do suy giảm mạnh số lượng TB<br /> lympho T. Nhờ vậy, khi ghép TB ung thư<br /> người lên chuột nude, khối u phát triển<br /> không bị đào thải do yếu tố miễn dịch của<br /> chuột và khối u mang đặc tính sinh học<br /> khá tương đ ng với khối ung thư trên cơ<br /> thể người.<br /> Để đánh giá tác dụng kháng ung thư<br /> trên mô hình in vivo, ch ng tôi thực hiện<br /> đề tài này nhằm: Đánh giá tác dụng<br /> kháng ung thư của chất CT-1 chiết xuất<br /> từ cây Khổ sâm cho lá trên mô hình chuột<br /> thiếu hụt miễn dịch mang khối ung thư<br /> phổi người.<br /> <br /> 20<br /> <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Vật liệu nghiên cứu.<br /> - Chuột thiếu hụt miễn dịch: 30 con.<br /> - TB UTPNTBKN (adenocarcinomic human<br /> alveolar basal epithelial cells) A549 (Công<br /> ty ATCC, Hoa Kỳ).<br /> - Môi trường nuôi cấy TB ung thư.<br /> - Thước đo kích thước khối u, tủ nuôi<br /> cấy TB.<br /> - Chất CT-1 thu được từ quá trình chiết<br /> xuất, phân lập từ lá của cây Khổ sâm cho lá.<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Nuôi cấy TB ung thư và tạo khối u<br /> trên chuột:<br /> TB UTPNTBKN A549 được nuôi cấy<br /> trong môi trường Eagle’s minimum essential<br /> medium, bổ sung fetal bovine serum 10%,<br /> 1% penicillin và streptomycin (Invitrogen<br /> GmbH, Karlsruhe, CHLB Đức), 1,5 mcg<br /> insulin/ml môi trường. Mỗi chai nuôi cấy<br /> diện tích 75 cm2 chứa 106 TB. TB được<br /> nuôi cấy tăng sinh và thay môi trường<br /> 2 lần/tuần ở điều kiện nhiệt độ 370C, CO2<br /> 5%. Khi TB phát triển đạt 80% diện tích,<br /> tiến hành cấy chuyển sang chai mới.<br /> Tách TB và đếm, thu TB với n ng độ 107<br /> TB/ml để phục vụ các thử nghiệm tiếp<br /> theo.<br /> Chuẩn bị TB trước ghép: TB trước khi<br /> tách được rửa hai lần bằng dung dịch<br /> PBS 1X, sau đó tách bằng dung dịch<br /> trypsin-EDTA 1X. Dung dịch TB ung thư<br /> đã chuẩn bị được h t vào bơm tiêm 1 ml<br /> với số lượng 107/ml. Cố định chuột nude<br /> và tiêm 0,1 ml vào dưới da đùi phải (106<br /> TB/chuột). Quá trình thao tác thực hiện<br /> trong điều kiện vô trùng tuyệt đối.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014<br /> <br /> * Đánh giá hiệu quả dự phòng và điều<br /> trị ung thư của CT-1:<br /> - Phân nhóm: 30 chuột nude, phân<br /> thành 3 nhóm:<br /> + Nhóm dự phòng: 10 con, uống CT-1<br /> với liều 50 mg/kg cân nặng/ngày, trong 2<br /> tuần liên tục trước khi ghép TB tạo khối<br /> ung thư.<br /> + Nhóm điều trị: 10 con, uống CT-1 với<br /> liều 50 mg/kg cân nặng/ngày, trong 2 tuần<br /> liên tục sau khi có khối ung thư.<br /> + Nhóm chứng: 10 con, uống nước cất<br /> với thể tích 0,1 ml/10 g cân nặng/ngày,<br /> trong 2 tuần liên tục sau khi có khối ung thư.<br /> - Sau khi ghép TB, xuất hiện khối u,<br /> phân riêng chuột nhóm dự phòng, những<br /> chuột còn lại được chia ngẫu nhiên thành<br /> 2 nhóm điều trị và nhóm chứng và bắt<br /> đầu cho uống thuốc.<br /> - Đánh giá theo dõi sự phát triển khối u<br /> tại vị trí tiêm (đùi phải) 2 lần/tuần bằng<br /> quan sát, sờ nắn và đo kích thước bằng<br /> thước chính xác NSK.<br /> <br /> + Kích thước khối u: đo theo 2 kích<br /> thước dài x rộng bằng thước chính xác<br /> NSK (Nhật Bản) 01 lần/tuần. Kích thước<br /> u được tính theo công thức: V = D x R2 x<br /> 0,5 (Yamaura và CS, 2000), trong đó: V:<br /> thể tích khối u; D: chiều dài khối u; R:<br /> chiều rộng khối u.<br /> Quá trình đánh giá kích thước khối u<br /> dừng lại khi có chuột chết ở bất kỳ nhóm<br /> nào, những con khác vẫn được theo dõi<br /> để xác định thời gian sống thêm.<br /> + Thời gian sống của các nhóm: thời<br /> gian sống của chuột được tính từ sau khi<br /> ghép TB ung thư. Quá trình theo dõi thời<br /> gian sống của mỗi nhóm chuột dừng lại khi<br /> toàn bộ chuột của nhóm chứng đều chết.<br /> - Các chỉ tiêu đánh giá:<br /> + Tỷ lệ xuất hiện khối u.<br /> + Kích thước khối u trung bình của các<br /> nhóm.<br /> + Tỷ lệ chết sau theo dõi.<br /> <br /> KÕt qu¶ nghiªn cøu vµ bµn luËn<br /> 1. Tác dụng dự phòng ung thƣ của CT-1.<br /> 120%<br /> 100%<br /> <br /> 100%<br /> <br /> Nhóm chứng<br /> <br /> Nhóm điều trị<br /> <br /> 100%<br /> 80%<br /> 80%<br /> 60%<br /> 40%<br /> 20%<br /> 0%<br /> Nhóm dự phòng<br /> <br /> Biểu đồ 1: Tỷ lệ xuất hiện khối u sau ghép TB ung thư ở các nhóm (n = 10).<br /> 21<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014<br /> <br /> Cho chuột thiếu hụt miễn dịch uống<br /> <br /> chứng. Điều đó chứng tỏ, chất CT-1<br /> <br /> chất CT-1 với liều 50 mg/kg/ngày trong<br /> <br /> không chỉ có tác dụng dự phòng ung thư<br /> <br /> 2 tuần liên tục, sau đó ghép 10<br /> <br /> 6<br /> <br /> TB<br /> <br /> phổi mà còn có tác dụng ức chế sự phát<br /> <br /> A549/con. Trong số 10 chuột nhóm này, 8<br /> <br /> triển của TB ung thư phổi trên chuột thiếu<br /> <br /> chuột phát triển khối u, 2 chuột (20%)<br /> <br /> hụt miễn dịch.<br /> <br /> không phát triển khối u (sau 2 tuần ghép<br /> <br /> - Hình ảnh đại thể:<br /> <br /> TB). Đối với nhóm chứng và nhóm điều trị,<br /> 100% chuột đều có khối u phát triển. Điều<br /> đó cho thấy chất CT-1 có thể có tác dụng<br /> dự phòng ung th- phæi.<br /> 2. Tác dụng của CT-1 lên kích thƣớc<br /> khối u.<br /> <br /> Nhóm chứng<br /> <br /> Biểu đồ 2: Kết quả theo dõi thể tích khối u<br /> qua các thời điểm nghiên cứu.<br /> Chuột sau khi hình thành khối u (ở ngày<br /> <br /> Nhóm dự phòng<br /> <br /> thứ 7), kích thước khối u ở 3 nhóm tương<br /> đương nhau.<br /> Tiếp tục theo dõi kích thước khối u<br /> ch ng tôi nhận thấy: nhóm điều trị bằng<br /> CT-1 có tác dụng cải thiện rõ rệt trong<br /> kìm hãm tốc độ phát triển của khối u,<br /> thể hiện kích thước khối u của nhóm<br /> điều trị luôn nhỏ hơn nhóm chứng và<br /> nhóm dự phòng ở mọi thời điểm theo<br /> dõi. Nhóm dự phòng, kích thước khối u<br /> có xu hướng nhỏ hơn, tuy nhiên chưa<br /> có sự khác biệt đáng kể so với nhóm<br /> 22<br /> <br /> Nhóm điều trị<br /> <br /> Ảnh 1: Hình ảnh khối u của 3 nhóm tại thời<br /> điểm bắt đầu theo dõi.<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014<br /> <br /> Khối u của các nhóm tại thời điểm bắt<br /> đầu theo dõi có kích thước tương đ ng.<br /> <br /> 3. Thời gian sống dƣ của chuột sau<br /> ghép TB ung thƣ.<br /> <br /> Khối u của nhóm chuột được phân ngẫu<br /> <br /> Thời gian sống dư của các nhóm: thời<br /> <br /> nhiên, có kích thước trung bình khoảng 70<br /> <br /> gian sống dư của chuột tạm được coi từ<br /> <br /> 3<br /> <br /> mm . Khối u có bờ rõ, cứng chắc, ít di<br /> <br /> sau khi ghép TB ung thư. Trong suốt thời<br /> <br /> động. Da phía trên không thay đổi màu sắc.<br /> <br /> gian này, ngoài việc đo kích thước khối u,<br /> ch ng tôi còn theo dõi các biểu hiện bất<br /> thường khác như liệt, chết. Quá trình theo<br /> dõi thời gian sống dư của mỗi nhóm chuột<br /> dừng lại khi toàn bộ chuột của nhóm chứng<br /> đều chết.<br /> <br /> Nhóm chứng<br /> <br /> Biểu đồ 3: Biểu diễn thời gian sống của<br /> các nhóm chuột.<br /> Sau 3 tháng, toàn bộ chuột ở nhóm<br /> Nhóm dự phòng<br /> <br /> chứng chết, thống kê thời gian sống dư<br /> của từng nhóm, so sánh tỷ lệ chuột chết.<br /> Nhóm điều trị còn 60% chuột sống (6 con),<br /> nhóm dự phòng còn 40% (4 con, trong đó<br /> 2 con không mọc u). Như vậy, chất CT-1<br /> có tác dụng kéo dài thời gian sống dư đối<br /> với chuột nude mang khối ung thư phổi người.<br /> KẾT LUẬN<br /> <br /> Nhóm điều trị<br /> <br /> Đánh giá tác dụng của chất CT-1 chiết<br /> <br /> Ảnh 2: Hình ảnh khối u của các nhóm tại<br /> <br /> xuất từ cây Khổ sâm cho lá trên chuột thiếu<br /> <br /> thời điểm 35 ngày sau điều trị.<br /> <br /> hụt miễn dịch mang khối ung th- phæi người<br /> <br /> Sau 35 ngày điều trị, kích thước khối u<br /> khác biệt đáng kể giữa các nhóm.<br /> 23<br /> <br /> ch ng tôi nhận thấy:<br /> <br />