Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa protein NS1 của virut Zika ở vi khuẩn Escherichia coli

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN<br /> MÃ HÓA PROTEIN NS1 CỦA VIRUT ZIKA Ở<br /> VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI<br /> Hoàng Quốc Trường*; Vũ Lê Quỳnh Chi*; Phan Quốc Hoàn*<br /> Park Huyn**; Vũ Xuân Nghĩa***; Lê Thị Quỳnh Mai****<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: nghiên cứu tách dòng và biểu hiện, tinh sạch protein NS1. Phương pháp: tách dòng<br /> trình tự gen mã hóa protein NS1 vào vector TA và tiến hành chuyển sang vector pET-28A (+)<br /> tạo plasmid tái tổ hợp biểu hiện protein NS1 trong vi khuẩn E. coli. Kết quả: NS1 biểu hiện<br /> thành công được xác nhận bằng kỹ thuật điện di biến tính SDS-PAGE và kỹ thuật chuyển thẩm<br /> miễn dịch. Đây là kết quả nghiên cứu bước đầu định hướng tạo bộ sinh phẩm chẩn đoán phát<br /> hiện virut Zika (ZIKV) tại Việt Nam. Kết luận: biểu hiện thành công NS1 protein.<br /> * Từ khóa: Virut Zika; E. coli; NS1.<br /> <br /> Cloning and Expression of a Full-Leng Recombinant NS1 Protein<br /> from Zika Virus in Escherichia coli<br /> Summary<br /> Objectives: In this study, Zika virus (ZIKV) NS1 was expressed and purified. Methods: Zika<br /> virus RNA was used as a template to produce DNA clones of the full-length NS1 genes via<br /> reverse transcriptase synthesis of cDNA by PCR amplification of the NS1 region. Products were<br /> cloned TA plasmid and subsequently subcloned into pET-28A (+) vector to construct a<br /> recombinant plasmid. The recombinant plasmid was transformed into E. coli BL21 strains and<br /> expressed NS1 protein. Results: Protein was identified by SDS-PAGE and western blotting.<br /> This research need to be further investigated to develop a NS1 diagnosis test of ZIKV in Vietnam.<br /> Conslusion: NS1 was expressed successfully.<br /> * Key words: Zika virus; E. coli; NS1.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Virut Zika là một virut ARN thuộc họ<br /> Flaviviridae, chi Flavivirus, được phân lập<br /> lần đầu tiên từ khỉ vàng Uganda năm<br /> 1947. Năm 1954, ZIKV được phân lập từ<br /> 3 cư dân Nigeria. Cho đến nay, nhiều<br /> nghiên cứu khẳng định kháng thể kháng<br /> <br /> ZIKV đã tồn tại trên người được nhiều<br /> quốc gia châu Phi và một số nước châu Á<br /> mô tả, trong đó có Thái Lan, Singapore,<br /> Malaysia, Campuchia, Philippines và Việt<br /> Nam. Tháng 05 - 2015, ZIKV lần đầu<br /> tiên được mô tả phát hiện bên ngoài châu<br /> Phi và châu Á khi phân lập tại Brazil.<br /> <br /> * Bệnh viện Trung ương Quân đội 108<br /> ** Trường Đại học Y Wonkawang<br /> *** Học viện Quân y<br /> **** Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương<br /> Người phản hồi (Corresponding): Vũ Xuân Nghĩa (nghia69@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 16/01/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 18/03/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 22/03/2017<br /> <br /> 23<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> Tháng 2 - 2016, Tổ chức Y tế Thế giới<br /> tuyên bố lây nhiễm ZIKV là vấn đề y tế<br /> khẩn cấp trong cộng đồng quốc tế [1].<br /> Đường lây truyền ZIKV được xác nhận là<br /> vector trung gian muỗi vằn A. aegypti và<br /> A. albopictus, có thể qua quan hệ tình dục<br /> [2]. Trong khi các triệu chứng lây nhiễm<br /> ZIKV thầm lặng hoặc có thể bệnh giống<br /> sốt dengue, các bằng chứng ZIKV gây biến<br /> chứng nghiêm trọng đến hệ thần kinh<br /> trung ương ở thai nhi/trẻ sơ sinh (bệnh<br /> đầu nhỏ, microcephaly), triệu chứng<br /> Guillain-Barré ở người trưởng thành và tế<br /> bào gốc vạn năng thần kinh của người<br /> được công bố với các bằng chứng khoa<br /> học tin cậy [3, 4, 5].<br /> Tại Việt Nam, theo thông tin đăng trên<br /> trang mạng của Viện Vệ sinh Dịch tễ<br /> Trung ương, tính đến ngày 20 - 11 2016, trên địa bàn toàn Thành phố Hồ<br /> Chí Minh xác nhận có 62 trường hợp<br /> nhiễm ZIKV tại 16/24 quận huyện. Trong<br /> đó, quận Bình Thạnh phát hiện 13 trường<br /> hợp, Quận 2 có 10 ca, tiếp đến là các<br /> quận 9, 12 và Tân Phú mỗi quận có 6 ca<br /> xác định dương tính với ZIKV. Ngày 17 10 - 2016, lãnh đạo Bộ Y tế và các<br /> chuyên gia của Văn phòng Đáp ứng Dịch<br /> khẩn cấp EOC (Bộ Y tế), chuyên gia của<br /> Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa dịch<br /> bệnh (CDC) Mỹ, Tổ chức Y tế Thế giới<br /> (WHO) và lãnh đạo Viện Vệ sinh Dịch tễ<br /> TW; Cục Quản lý Khám, Chữa bệnh; Vụ<br /> Sức khỏe Bà mẹ và Trẻ em (Bộ Y tế);<br /> Bệnh viện Phụ sản TW đã họp và thông<br /> báo, trao đổi về trường hợp bé gái<br /> 4 tháng tuổi đầu tiên tại Việt Nam mắc dị<br /> tật đầu nhỏ nghi do ZIKV. Em bé là con<br /> của bà mẹ 23 tuổi, dân tộc Ê Đê, sống tại<br /> Đắk Lắk. Khi mang thai thời điểm 3 tháng<br /> và 6 tháng, người mẹ bị sốt, phát ban.<br /> Để khẳng định nhiễm ZIKV, Trung tâm<br /> Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh Hoa<br /> 24<br /> <br /> Kỳ khuyến cáo sử dụng test phát hiện<br /> NS1, xét nghiệm Zika IgM ELISA và kỹ thuật<br /> sinh học phân tử để phân biệt với nhiễm<br /> do Chikungunia hoặc Dengue. NS1, protein<br /> không cấu trúc của ZIKV là một glycoprotein<br /> với trọng lượng phân tử 43 - 50 kD đã<br /> được công bố về cấu trúc sau 9 tháng<br /> WHO cảnh báo ZIKV liên quan đến bệnh<br /> đầu nhỏ ở thai nhi và trẻ sơ sinh [6, 7].<br /> Năm 2016, hai công trình khoa học công<br /> bố trên tạp chí EMBO và Nat Struct Mol<br /> Biol về cấu trúc của NS1 đã chứng minh<br /> các đặc tính bề mặt khác biệt của ZIKV<br /> so với những virut khác thuộc họ Flavivirus<br /> về tính đặc hiệu với kháng thể kháng<br /> ZIKV NS1 và làm sáng tỏ vai trò của<br /> protein này trong cơ chế lây nhiễm ZIKV.<br /> Trong nghiên cứu này, gen NS1 của ZIKV<br /> được tách dòng và biểu hiện trong vi<br /> khuẩn E. coli với định hướng chế tạo các<br /> bộ sinh phẩm phát hiện ZIKV ở mức độ<br /> gen và kháng nguyên NS1 tại Việt Nam.<br /> ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Vật liệu nghiên cứu.<br /> ARN tổng số của ZIKV do Khoa Sinh<br /> học Truyền nhiễm, Trung tâm Nghiên cứu<br /> bệnh lây sang người, Trường Đại học<br /> Wonkwang, Hàn Quốc cung cấp. Sinh<br /> phẩm tổng hợp cADN (SuperScriptTM Kit),<br /> tách dòng gen TA/pGEM-T easy vector<br /> (Hãng Promega). Chủng Escherichia coli<br /> Top 10F’, chủng vi khuẩn BL21 và vector<br /> pET28-A (+) (Hãng Novagen). Kít tinh sạch<br /> sản phẩm PCR, Gel Extraction Kit (Hãng<br /> QIAGEN). Kít tinh sạch protein (ProBondTM<br /> Purification System) (Hãng Invitrogen).<br /> 2. Phương pháp nghiên cứu.<br /> * Tách dòng và giải trình tự gen NS1<br /> của ZIKV:<br /> Khuếch đại gen mã hoá cho NS1 bằng<br /> cặp mồi đặc hiệu có gắn thêm vị trí của 2<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> enzym EcoRI và NotI ở đầu 5’ tương ứng<br /> của mồi xuôi và mồi ngược: mồi xuôi<br /> (Hoang_NS1-5’): 5’-CCGGAATTCCGGATGGTGGGGTGCTCAGT G-3’; mồi ngược<br /> (Hoang_NS1-3’): 5’-ATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCATGACCCCGCTGTC AC-3’.<br /> cADN được tổng hợp theo bộ kít<br /> SuperScriptTM và dùng làm khuôn cho<br /> phản ứng PCR để khuếch đại gen NS1. Chu<br /> trình nhiệt như sau: bước 1: 95°C - 3<br /> phút; bước 2: 95°C - 30 giây; bước 3:<br /> 58°C - 30 giây; bước 4: 72°C - 1 phút 30<br /> giây; bước 5: lặp lại 40 chu kỳ từ bước 2<br /> đến bước 4; bước 6: 72°C - 10 phút. Gen<br /> NS1 được gắn vào vector pGEM-T easy<br /> tạo pNS1, biến nạp vào chủng vi khuẩn E.<br /> coli TOP 10F’ bằng phương pháp sốc<br /> nhiệt. Các dòng plasmid tái tổ hợp mang<br /> gen NS1 được chọn lọc theo phương<br /> pháp khuẩn lạc xanh trắng [8] và cắt kiểm<br /> tra bằng enzym giới hạn EcoRI và gửi giải<br /> trình tự đến Hãng Cosmogenetech (Hàn<br /> Quốc). Xử lý kết quả giải trình tự bằng<br /> phần mềm Bioedit và phân tích trực tuyến<br /> với Ngân hàng Gen thế giới sử dụng<br /> công cụ BLAST.<br /> * Thiết kế plasmid biểu hiện protein tái<br /> tổ hợp NS1:<br /> Cắt gen NS1 ra khỏi pNS1 bằng 2 enzym<br /> EcoRI và NotI, sản phẩm cắt được tinh<br /> sạch bằng Gel Extraction Kit thu được<br /> gen NS1p và gắn vào vector pET28-A(+)<br /> đã được cắt mở vòng bằng 2 enzym<br /> tương ứng để tạo ra vector biểu hiện<br /> pET-NS1rec. Các dòng plasmid tái tổ hợp<br /> mang gen NS1rec được chọn lọc bằng kỹ<br /> thuật plasmid PCR, sử dụng cặp mồi đặc<br /> hiệu cho vector pET28-A (+), T7 promoter<br /> primer #69348-3 và T7 terminator primer<br /> #69337-3 (Novagen, Hoa Kỳ) và do Công<br /> ty Cosmogenetech (Hàn Quốc) giải trình<br /> tự xác định đúng chiều gắn trước khi biểu<br /> hiện tạo protein tái tổ hợp.<br /> <br /> * Biểu hiện và tinh sạch NS1rec:<br /> Để biểu hiện gen mã hóa NS1rec, biến<br /> nạp plasmid pET-NS1rec vào vi khuẩn E.<br /> coli chủng BL21. Chủng biểu hiện protein<br /> NS1 được nuôi cấy trong 400 ml môi<br /> trường LB (bổ sung 100 µg/ml kanamycin)<br /> ở nhiệt độ 37°C với tốc độ lắc 200<br /> vòng/phút, bổ sung IPTG ở điều kiện tối<br /> ưu 1 mM nồng độ cuối cùng khi mật độ<br /> nuôi cấy vi khuẩn OD600 nm đạt 0,5 - 1.<br /> Sau 3 - 4 giờ cảm ứng biểu hiện, thu hồi<br /> vi khuẩn bằng ly tâm với tốc độ 3.000 g/30<br /> phút ở 4°C. NS1 được biểu hiện ở dạng<br /> thể vùi trong chủng vi khuẩn BL21. Hòa<br /> cặn vi khuẩn sau biểu hiện với 10 ml đệm<br /> TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0 và 5 mM EDTA),<br /> phá màng tế bào bằng 3 chu kỳ trên máy<br /> nén French với áp lực nén 100 bars<br /> ở 4°C. Dịch phá tế bào được ly tâm với<br /> tốc độ 20.000 g/20 phút 4°C, cặn tế bào<br /> hòa trong 10 ml Buffer A (10 mM TrisHCl, 100 mM NaH2PO4, 10 mM βmercaptoethanol và 8 M urea) trong 1 giờ<br /> ở nhiệt độ 4oC. Dịch protein ở dạng tan<br /> được thu hồi sau khi ly tâm với tốc độ<br /> 20.000 g/20 phút 4°C, protein NS1 tiếp<br /> tục tinh chế sử dụng cột sắc ký ái lực Ni-NTA<br /> (Qiagen, Đức) theo hướng dẫn của nhà<br /> sản xuất. Đánh giá mức độ biểu hiện và<br /> quy trình tinh sạch protein tái tổ hợp NS1<br /> bằng kỹ thuật điện di biến tính SDS-PAGE.<br /> * Kỹ thuật chuyển thấm miễn dịch:<br /> NS1rec được phân tích phản ứng<br /> kháng nguyên-kháng thể sử dụng kháng<br /> thể chuột kháng histidin bằng kỹ thuật<br /> chuyển thấm miễn dịch. Cụ thể, mẫu<br /> chủng biểu hiện protein NS1 điện di biến<br /> tính trên gel 12,5% SDS-PAGE, sau đó<br /> nhuộm với Coomassie brilliant blue R250<br /> (Sigma-Aldrich) hoặc chuyển sang màng<br /> nitrocellulose (Amersham/GE Healthcare,<br /> 25<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> Hoa Kỳ) bằng thiết bị chuyển màng<br /> Trans-Blot® SD Semi-Dry Electrophoretic<br /> Transfer Cell (BioRad, Hoa Kỳ) theo hướng<br /> dẫn của nhà sản xuất. Màng chuyển<br /> protein được phủ với 5% skim milk trong<br /> đệm PBS-T trong 1 giờ ở 37°C. Pha loãng<br /> kháng thể chuột kháng His.H8 (Pierce 6X<br /> His Epitope Taq Antibody) theo tỷ lệ<br /> 1:2.500 trong đệm PBS + 0.05% Tween-20<br /> để phủ màng ở 37°C trong 1 giờ. Màng<br /> sau khi rửa, làm phản ứng với kháng thể<br /> thứ 2, kháng thể anti-mouse rabbit IgG<br /> (HRP) (ab97046) với tỷ lệ pha loãng 1:5.000<br /> trong 1 giờ ở 37°C để phát hiện kháng<br /> nguyên NS1rec có gắn His. Phản ứng<br /> hiện màu sử dụng 3, 3’-Diaminobenzidine<br /> tetra hydrochloride hydrate (DAB, Cat. #<br /> D5637, Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ) trong 10<br /> ml đệm PBS + 0.05% (v/v) H2O2.<br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả tách dòng gen NS1.<br /> Khuếch đại gen NS1 của ZIKV bằng<br /> phản ứng PCR như đã mô tả ở phần<br /> phương pháp. Kiểm tra sản phẩm PCR<br /> bằng điện di trên gel agarose 1% (hình<br /> 1A) xuất hiện 1 băng duy nhất có kích<br /> <br /> thước khoảng 1,1 kb tương ứng với kích<br /> thước của NS1 được khuếch đại. tinh<br /> sạch và gắn sản phẩm PCR vào vector<br /> tách dòng pGEM-T easy, biến nạp vào vi<br /> khuẩn E. coli TOP10F’, cấy trải trên đĩa<br /> thạch LB bổ sung ampicillin (100 µg/ml).<br /> Plasmid từ 3 dòng khuẩn lạc trắng và<br /> 1 dòng khuẩn lạc xanh được tách chiết và<br /> điện di kiểm tra trên gel agarose 1%. Tất<br /> cả 3 dòng plasmid tách từ khuẩn lạc trắng<br /> đều có vị trí cao hơn so với plasmid tách<br /> chiết từ dòng khuẩn lạc xanh (hình 1B).<br /> Do vậy, chúng đều có khả năng mang<br /> gen NS1. Do vector pGEM-T easy có<br /> chứa 2 vị trí nhận biết của EcoRI nằm ở 2<br /> đầu của đoạn gen ngoại lai, nên nếu gen<br /> ngoại lai được chèn vào vector này, khi<br /> cắt bằng EcoRI, chúng sẽ văng ra khỏi<br /> vector. Do vậy, chúng tôi chọn 3 dòng<br /> khuẩn lạc trắng ở trên cắt kiểm tra bằng<br /> EcoRI. Kiểm tra kết quả bằng điện di trên<br /> gel agrose 1% (hình 1C) cho thấy, cả<br /> 3 dòng plasmid sau khi cắt đều xuất hiện<br /> 1 băng ADN với kích thước tương ứng<br /> với kích thước của sản phẩm PCR gen<br /> NS1, trong khi không xuất hiện băng này<br /> ở giếng chứa dòng khuẩn lạc xanh (giếng<br /> 1, hình 1C).<br /> <br /> Hình 1: Kết quả tách dòng gen NS1.<br /> (A) Kết quả khuếch đại gen NS1, M: Thang ADN chuẩn; ĐC 1: Chứng âm, ĐC 2:<br /> Sản phẩm nhân gen NS1. (B) Kết quả tách chiết plasmid. ĐC 1: Plasmid được tách<br /> 26<br /> <br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 4-2017<br /> chiết từ khuẩn lạc xanh; ĐC 2 - 4: Các plasmid được tách chiết từ 03 khuẩn lạc trắng<br /> riêng rẽ. (C) Kết quả cắt pNS1 trong vector TA bằng EcoRI; ĐC 1: Plasmid được tách<br /> chiết từ khuẩn lạc xanh; ĐC 2 - 4: Plasmid được tách chiết từ khuẩn lạc trắng; ĐC 6:<br /> Sản phẩm PCR khuếch đại gen NS1.<br /> Để khẳng định chắc chắn gen được tách dòng là NS1, chúng tôi chọn 2 mẫu<br /> plasmid đã kiểm tra enzym cắt giới hạn EcoRI để giải trình tự. So sánh kết quả giải<br /> trình tự với trình tự NS1 trên Ngân hàng Gen Quốc tế qua chương trình so sánh trực<br /> tuyến BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Kết quả ở hình 2 cho thấy, trình tự mà<br /> chúng tôi thu được là gen NS1 của ZIKV với độ tương đồng 100% về trình tự nucleotid<br /> với chủng ZIKV MR-766/1947, với mã số đăng ký trên Ngân hàng Gen Quốc tế là:<br /> KX601169.1. Như vậy, đã tách dòng thành công gen NS1 của ZIKV.<br /> <br /> Hình 2: Kết quả giải trình tự gen NS1.<br /> Một phần trình tự đầu 5’ của gen NS1 và kết quả so sánh với trình tự NS1 tách dòng<br /> từ ZKV trên Ngân hàng Gen Quốc tế qua công cụ so sánh trực tuyến BLAST<br /> (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).<br /> 27<br /> <br />