Nghiên cứu trình tự các Gen tiêu biểu và phát triển kỹ thuật Multilplex PCR mới chẩn đoán Bacillus Anthracis gây bệnh ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

12
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật dựa trên PCR xác định nhanh tác nhân khủng bố sinh học, đặc biệt là Bacillus anthracis đang được quan tâm. Trong bài viết này, gen vrrA trên nhiễm sầc thể, gen độc lực pagA,cya, lef (plasmid pX01), capA, capB, capC (plasmid pX02) từ các chủng B. anthracis Việt Nam được tách dòng và giải trình tự hoàn chỉnh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu trình tự các Gen tiêu biểu và phát triển kỹ thuật Multilplex PCR mới chẩn đoán Bacillus Anthracis gây bệnh ở Việt Nam

NGHIÊN CỨU TRÌNH Tự CÁC GEN TIÊU BIỂU VÀ PHÁT TRIÉN KỸ THUẬT MULTIPLEX PCR MỚI CHẦN ĐOÁN BACILLUS ANTHRACIS GÂY BỆNH Ở VIỆT NAM ThS. Đinh Thị Thu Hằng, ThS. Nguyên Thanh Việt T - , í ~ *1^* IP A V n . ỉ Ị Ị M A w . ' jS m , / ì t u n y ta m A rt* i f is ờ ỉiiti r Lsurvx* risjK* V /C Í I W u c m y ThS. Nguyễn Văn An (B M K V isinh y học, Bệnh viện Q uâtiy 1Ó3, Học viện Quân ý) Hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Thái sớ n BMK Vi sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y TÓM TẮT Nghiên cứu phát triển các kỹ thuật dựa trên PCR xác định nhanh tác nhân khủng bố sinh học, đặc biệt là Bacillus anthracis đang được quan tẩm. Trong công trình này, gen vrrA trên nhiễm sầc thể, gen độc lực pagA, cya, lef (plasmid pX01), capA, capB, capC (plasmid pX02) từ các chủng B. anthracis Việt Nam được tách dòng và giải trình tự hoàn chỉnh. Đã xác đính được 1 đột biến thêm nucleotide A trên gen vrrA, 1 đột biến đồng nghĩa, 2 đột biến sai nghĩa trên gen pagA và 1 đột biến đồng nghĩa trên gen cya. Đặc biệt, 1 đột biến sai nghĩa lần đấu tiên được phát hiện trên gen capA chủng B. anthracis Ba1. Cốc gen còn lại tương đồng 100% so với chủng tham chiếu B. anthracis Vollum-USA. Đồng thời, một phản ứng PCR đa mồi chứa chứng nội tại được thiết kế để phát hiện chính xác B. anthracis. Đày là công bố đấy đủ chi tiết đầu tiên trong nước về trình tự các gen tiêu biểu của B. anthracis cũng như phát triển một cõng cụ hữu Ịch cho phép chẩn đoán nhanh B. anthracis gây bệnh. Từ khóa: Chứng nội tại, độc lực, PCR đa mồi, vi khuẩn than, Việt Nam, SUMMARY COMPLETE SEQUENCE ANALYSIS OF THE TYPICAL GENES OF BACILLUS ANTHRACIS AND DEVELOPMENT OF A NOVEL MULTIPLEX PCR FOR VIRULENT BACILLUS ANTHRACIS DETECTION IN VIETNAM Dinh Thi Thu Hang, Nguyen Thanh Viet Bio-medical and Pharmaceutical Applied Research Centre, Vietnam Military Medical University Nguyen Van An, 103 Hospital, Vietnam Military Medical University Development o f PCR-based techniques for rapid and accurate identification o f bioterrorism agents, especially Bacillus anthracis is interest in recent years. In this study, the entire sequences o f the vrrA gene (chromosome), pagA, cya, lef genes (virulence plasmid pX01) and capA, capB, capC genes (virulence plasmid pX02) o f ten B. anthracis strains Ba1-10 isolated in Northern Vietnam were cloned and analyzed. One insertion mutation at nucleotide position 346 A in the vrrA gene (10 strains), one synonymous and two missense mutations in the pagA gene and one synonymous mutation in the cya gene (Ba3, 4). Interestingly, one missense mutation was first identified in the capA gene o f B. anthracis strain Ba1. The remaining genes had 100% similarity in comparison to the B. anthracis references. In addition, a multiplex PCR assay with primer pairs vrrAF1/R1, pagAF1/R1, capAF1/R1, including recombinant internal amplification control was developed for detection o f virulent B. anthracis strains. This is the first report in Vietnam that investigates the full-length o f the vrrA gene and some typical genes on virvlence plasmids pX 01 and pX 02 as well as develops a useful molecular tool for rapid detection o f virvlent B. anthracis in Vietnam. Keywords: Bacillus anthracis, internal amplification control, multiplex PCR, virulent, Vietnam. ĐẶT VÁN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU Bởi tính chất cếp tính, khả năng gây chết người Bacillus anthracỉs, tác nhân gây bệnh than được qua đường hô hấp kết hợp vởi khả năng phục hồi của tim thấy ờ nhiều quốc gia trên thế giới. Khả năng gây bào tử sau khi tiếp xúc với nhiệt và phóng xạ khiến B. bệnh của B, anthracis chủ yếu nhờ sự có mặt của các anthracis được sử dụng là vũ khí sinh học. ở Việt gẽn nằm trên hai plasmid !ớn là pX01 (182 kb) và Nam, bệnh than vẫn còn xuất hiện rải rác ở các tĩnh pX02 {95 kb) - được gọi íà các plasmid độc lực. miền núi phía Bắc như Sơn La, Điện Biên, Lai Châu,... Plasmid pX01 chứa các gen sảrì xuất độc tố, trong khi [1]. Gần đây (10/2014) ờ Mèo Vạc, Hà Giang đã ghi pX02 chứa các gen liên quan đển quá trình tổng hợp nhận 9 ca nhiêm bệnh than do ăn thịt gia súc chết vì vò poiy-D-g!utamic acid [9]. Chì những chùng có đầy bệnh than. Sự xuất hiện trở lại cùa B. anthracỉs một đù hai píasmid này mới có khả năng gây bệnh nguy íần nữa cảnh báo mầm bệnh nguy hiềm này cần được hiểm. Trên pX01, có ba gen quan trọng nhất lần lượt quan tâm đúng mức và có phương án phòng chống ià gen pagẢ mẵ hóa cho kháng nguyền bảo vệ, cya hiệu quả, tránh để dịch bùng phát. Trong công trinh mã hóa cho yếu tố gây phù nề (edema factor - EF) - này, nhóm nghiên cứu giới thiệu quá trình phân lập, một adenylyl cyciase dẫn đến phù nề da trong cơ thể xác định trình tự đầy đù gen đặc trưng trên nhiễm sẳc và let mã hóa cho yếu tố gây chết (lethal factor - LF) thể vrrA và các gen độc lực pagA, cya, ief (pXOỊ), [11]. Plasmid pX02 chứa các operon capBCADE [5] capA, capB, capC (pX02). Điều này góp phần làm với các gen quan trọng là capA, capB, capò. phong phú thêm những kết quả về phân tử cũng như 480
có thêm dữ liệu tương đối hoàn chình về một số gen Tách dòng và giải trinh tự: Chủng vi khuẩn than tiêu biểu của các chủng B. anthracis phân iập tại Việt được bấí hoạt ờ đieu kiện 121°C/20 phút sau đó tách Nam. Trên cơ sở kếỉ quả phân tích trinh tự này, kết DNA tổng số theo quy trình của nhà sản xuất (QIAamp hợp với các nghiên cứu trên thế giới để phát triển một DNA Mini Kit). Phản ứng PCR có độ chính xác cao kỹ thuật PCR đa mồi (multiplex PCR - mPCR) tối ưu được thực hiện trên máy PCR Eppendorf Mastercycíer với ba gen đích lần lượt trên nhiễm sắc thể, pX01, pros (Đức) sử dụng hóa chat PCR High Fidelity pX02 cùng chứng nội tại tái tổ hợp (IC) xác định chính (Thermo scientific). Sản phẩm PCR được tinh sạch xác B. anthracis gây bệnh trong tự nhiên. Như vậy, bằng kií GeneJet PCR purification và dòng hóa vào công trình nghiên cứu có hai mục tiêu sau: vector pJET1.2/blunt (Thermo scientific). Các piasmid Phân tích trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA (trên tái tổ hợp sau khỉ được kiểm tra có chứa gen mong nhiễm sắc thể), các gen độc lực pagẤ, cya, lef muốn được giải trình tự theo nguyên lý Sanger trên (plasmid pX01) và capA, capẻ, capC (plasmid pX02) máy ABI 3730XL, sử dụng phần mềm Bioeđit và của các chủng B. anthracis phân lập ở Việt Nam. Genious R7 để xử lý, nối ghép tạo trinh tự toàn bộ các Phát triển kỹ thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tại gen đích, so sánh và phân tích trinh tự thu được với tái tổ hợp xác định nhanh, chính xác B. anthracis gây các trình tự tham chiếu trên Genbank. bệnh trong tự nhiên. Multiplex PCR chứa chứng nội tại: Từ kết quả giải VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIỀN cứu trình tự, một phản ứng FCR đa mồi chứa chứng nội tại Vậỉ liệu ổược thiết kế đề phát hiện chính xác các chủng B. Cac chủng vỉ khuẩn: Mười chủng vi khuẩn B. anthracis gây bệnh trong tự nhiên. Chứng nội tại này anỉhracis được phân lập từ bệnh nhân, gia súc chết vì được bồ suríg vào mẫu trong quá trình tách chiết DNA bệnh than và môi trường được cung cấp bởi Học viện với các nồng độ khác nhau để xác định lượng tối thiểu Quân y và Viện Y học Dự phòng Quân đội, Cục Quân vừa đủ có thể phát hiện được. Các thử nghiệm đều y (Ba1-Ba10). Trong đó, có 3 chủng B. aníhracis đầy được tiến hành song song với mẫu không chứa IC để đủ độc lực (Ba1, Ba3 và Ba4), 1 chủng B. anỉhracis chỉ so sánh và mẫu đối chửng âm (nước deion) để kiểm có pX01 (Ba6), 6 chủng còn lại là B. anthracis không soát ngoại nhiễm cũng như nhiễm chéo. độc. Chủng B. cereus Bc1 ổược sử dụng làm đổi Phản ứng mPCR có thành phần như sau: 1X chứng ắm. Dream Taq Buffer; 2t0U Dream Taq Polymerases; Cac cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để nhân toàn dNTPs 0,25 mM mỗi ioại; 0,6-0,64 (aM mồi xuôi, mồi bộ gen vrrA (chromosome), pagA, cya, ief (pX01) và ngược mỗi loại, khoảng 10 ng DNA khuôn, điều chỉnh capẦ, capB, capc (pXÓ2) sử dụng phần mềm H20 đủ thể tích 25 Ị i l (Thermo scientific). Chu trinh primer3pius. Ba cặp mồi phát hiện qen vrrA, pagA, mPCR được thiết kế: Biền tính 94oC/4 phút, tiếp theo capA trong phản ứng mPCR được the hiện chi tiết ở !à 30 chu kỳ (940C/45 giây; 56oC/40 giây; 72oC/40 bảng 1 . giây), sau đó hoàn thành keo dài chuỗi ở 72° trong 6 Chứng nội tại (internal amplification conirol-IC): phút. Sản phẩm mPCR được điện dí kiểm tra trên gel Plasmid tái tồ hợp JET1.2-capA-IC1 đã được thiết lập agarose 1,5% TBE 0,5X, nhuộm ethidium bromide và trong nghiên cứu trước đây của nhóm tác giả [3] và chụp ảnh dưới ánh sáng u v (UVP Eppendorf). đăng ký sáng chế (Phụ lục 2). Plasmid này được thiết Công trình được thực hiện tại Trung tâm Nghiên kế theo hướng sử dụng chung với cặp mồi chẩn đoán cứu ứng dụng Sinh Y Dược học và Bộ môn Khoa Vi là capAF1/R1 (Bảng 1)7 sinh y học, Bệnh viện Quân y 103, Học viện Quân y từ Bảng 1. Các moi sử dụng trong phản ứng mPCR tháng 05/2014 đến tháng 02/2015. chứa IC KẾT QUẢ NGHIÊN c ứ u Kích 1. Nghiên cứu trình tự gen đặc trưng và gen Gen đích Trình tự (5'-3’) thước độc lực của B. anthracis (bp) Gen vrrA (chromosome): Kết quả phân tích toàn bộ vrrA (nhiễm vrrAF1 :CTGTAAGCCCTGTCGTCGAA 222 gen vrrA trên 10 chủng B. anthracis nghiên cứu cho sắc thể) vrrARI :CCTCGCGCACTTCT TTTTCT thấy gen vrrA giống nhau hoàn toàn về trình tự pagA nucleotide giữa các chủng B. arìthracis này và tương (plasmid pagAF1 :AAATGGAGCACGGCTTCTGA 751 đồng từ 99-100% so vởi các chủng tham chiếu. So với pX01) pagARI :AGCCTGTATCCACCCTCACT chủng B. anthracis Vollum-USA, trình tự gen vrrA của capA các chủng phân lập ở Việt Nam chỉ sai khác 1 (plasmid capAFI :TGACGATGACGATGGTTGGT nucleotide (thêm nucleotide A ờ vị trí 346). pX02) 610 capARI: Gen pagA, cya, !ef (pX01): Ket quả phân tích toàn PJET1.2- GCTTCCTGTCTAGGACTCGG 1000 bộ trình tự gen pagA các chủng than gây bệnh đã xác capA-ICI định được 3 đột biến điểm (T-»C), gồm 1 đột biến Phương pháp đồng nghĩa (T-»C)195 và 2 đột biến sai nghĩa Nghiên cứu được thiết kế theo phương pháp thực (T~>C)1693, (T ^ C )Í7 9 9 khi so sánh với trình tự tham nghiệm mô tả, phân tích phòng thí nghiêm và trên thực chiếu B. anthracĩs Volium-USA. Chỉ xác định được 1 địa, sử dụng các kỹ thuậí vi sinh kinh điển và sinh tìọc đột biến đồng nghĩa (T~»C)600 trên gen cya chủng B. phân tử. anthracis Ba3 và Ba4. Đột biến này trước đó cũng đã Các kỹ thuậỉ chính được tóm tắt như sau: được tìm thấy ở các chủng như B. aníhracis A2012, 481
Ames Ancestor, BFV. Trong khi đó, gen ief có trình tự trước đó chưa được tìm thấy trong các nghiên cứu giống nhau và tương đồng 100% so vởỉ chủng tham trên thế giới và có thể khẳng định đay ià đột biến mới, chiếu. phát hiện đầu tiên trên 1 chủng của Việt Nam (Ba1) Gen capA, capB, capC (pX02): Trên pX02, một (Hình 1). Hai gen còn lại capB, capC cổ tính bảo tồn đột biến sai nghĩa hoàn toàn mới (A->G)1048 được cao, khong xảy ra đột biến ờ bất cứ điềm nào trên các xác định ở gen capA chủng B. anthràcis Ba1 làm thay chùng nghiên cứu. đồi amino acid lysine íhành aiuíamic. Đây !à đột biến 1010 1020 Í0 3 0 1040 -.0 5 0 1060 1070 1080 1050 1100 .... 1.... í . - . . I ------ 1 . . . . I . . . . I . . . . 1 . . . . I . . . . I ------ 1 • • • • ! • • • • ! -•••!■■'•f R V V R s i, ~ K r> f a is > f. - « A A ER 01000044 KKA Ư 3A ......................... .................................................. ............... ....................... . .......................................................... ............................................... .............................................. 1 ! i .. s !> K i- V ý: I . i> K R V < Si iỉ T. T K Í! !•'. K Vi HC_012S77 coc 684 ....... .............. ............................................................... ........................................... L ~ V E -X - K V t >> !i - u> s w R V V R •; i T K D •; £ K Ĩ, w NZ K S 0506S 3 A .B r.0 0 3 .................. ................................. ................................................................................. .......................................................... - .................................................................................................... - 1. K •• ~ V K '■ V r '• !, 15 K :: R V 1 a T X a : * K t I. AA ES01000049 A u s tr a lia 9« ............. ......................... .. .............................................................................................................................. ..................... ......................................................................... ........................ Ĩ ■} s ;; !' K ?■ V V Ũ I. o K s B V ■/ p. c- - T K '•> ■' K - ~ « NZ C Ẽ 007702 B FV ƯSA .........................- ................................................................................................................................................................................................................................................................................. " ro K s p K Ĩ V :■ E >. o K i: R V V H Q T K !j 1 K K ■; Si J P IG 0 1 0 0 0 0 8 Z C ir b o s a p ............. , - ..................... ........................................................ ............................................................................................................................................................................................... L r 5 K c :: !• K f- 9 •; c T. - K X- s V P- ’2 L T K & T n K a A ;i C P008848 HYOOl .................. ................................. ..........................................G .................................................................................................. - .................................................................................................... V í Q K s !■ K t> V s ft i . I’r K tỉ K V T « (,1 r, V K r. ¥ K -V sz AB DN 02000062 T o la n k o v s ............................................................................................................ ............................................................................................................................................................................................... “ L X' £ •: s r K ;■ V T n E r. r ỈT r V T A — D ĨC R V V B c- T K ữ 3 K vi A K Ba 4 V ie tn a m .................................................................................................................................................................................................................. ........................................................................................... (. i V. < !■ y. :• V ■. !ì K •- H V V Fi i. ■( K it ■■■ K s Í. >■ Hình 1. So sánh trình tự nucleotide và amino acid cùa gen capA Ờ 3 chủng B. anthracis Ba1, Ba3, Ba4 VỚỈ12 chủng B. anthracis thạm chiếu trên Genbank (đoạn nucleotide có xẩy ra đột biến điểm). Các chủng tham chiếu được ký hiệu theo thứ tự mã số, tên chủng/phân lập, nguồn gốc chủng, dấu chấm biểu thị nucleotide giống nhau, nếu có đọt biển se đưọ-c biểu thị bằng các nucleotide. Như vậy, qua phân tích trình tự toàn bộ các gen cặp mồi capAF1/R1, cho sản phầm có kích thước 1kb) vrrA (nhiễm sac thể), pagA, cya, lef (pXÒ1), capA, dề dàng phân biệt tren bản điển di (Hình 2). capB, capC (pX02) cho thấy: Sự sai khác về trình tự nucleotide của các gen đích trên giữa chủng nghiên cứu và các chùng tham chiểu là không nhiều. Trinh tự đầy đủ của các gen phân ịập đã được đăng ký trên Genbank với mã sổ: KP2131Ò2, KP213103, KP213104, KP213105-7, KP759885-7, KP759888-93 (Phụ lục 3 -1 7 ). 2. Nghiên cứu phát triển kỹ thuật PCR đa mồi IC 1000 bp chửa chứng nội tại tái tổ hợp xác định B. anthracis pagA 751 bp Để xác định B. anthracis có độc lực, cần chl ra capA 610 bp được chủng vi khuẩn than đó có chứa đồng thời cả 2 plasmid độc íực là pX01 và pX02. Phản ứng mPCR vrrA 222 bp đã được thiềt kế với 3 cặp mồi ià vrrAF1/R1, pagAF1/R1 và capAF1/R1 để xác đính sự có mặt cùa các gen tương ứng đặc trưng cho B. anthracis. Sản Hình 2. Xác định B. anthracỉs gây bệnh trong tự nhiên phẩm mPCR khuếch đại đồng thời 3 gen đích của B. bằng mPCR chứa chứng nội tại anthracis cỏ kích thước lần lượt là 222, 751 và 610 bp M: Marker 100 bp (Thermo scientific), ĐC {-): Đối chứng xảc định các gen tương ứng vrrA, pagA và capA cùng âm; ĐC(+): Đối chưng dượng sử dụng plasmid chứa cac với sển phẩm khuếch đại plasmid IC (sử dụng chung gen pagA, capA, vrrA; B1-3: Các mẫu cần kiểm tra 482
BÀN LUẬN mPCR tối ưu cho phép xác minh kếí quả chẩn đoán, Việc phân tích trình tự các gen đặc írưng và gen loại bỏ hiện tượng am tính giả. độc lực của các chủng B. anthracis phân lập ờ Việt KẾT LUẬN_VA KIẾN NGHỊ Nam rất quan trọng. Đây là công bố đay đủ nhất trong Kết luận: Trình tự đầy đủ gen đặc trưng vrrA nước về trình tự nucleotide gen vrrA và các gen đặc (nhiễm sắc thể), các gen độc lực pagA, ief, cya trưng trên hai plasmid độc lực là pX01, pX02. Kết quả (plasmid pX01) và capA, capB, cape (plasmid pX02) cho thấy, sự sai khác về trình tự nucleotide của các của 10 Chung B. anthracis ở Việt Nam có sự sài khác gen đích trên giữa chủng nghiên cứu và các chủng không nhiều so vởi thể giới. Một đột biến mới tham chiếu là không nhiều. Mức tương đồng cao phản (A-»G)1048 được xác định ở gen capA trên chủng B. ánh tính đa dạng di truyền thấp cùa các chủng B. anihracis Ba1. Đòng thời, đã phát triển thành công kỹ anthracis. Một phần kết quả này đã được công bố thuật PCR đa mồi chứa chứng nội tại tái íổ hợp xác trong công trình nghiên cửu gần đây của nhóm tác giả định nhanh, chính xác B. anthracis gẩy bệnh trong tự [2], Đột biến xảy ra ít được lý giải do B. anthracis có nhiên. khả năng hỉnh thành bào tử, tồn tại írong đất qua Kiến nghị: Đánh giá khả năng phát hiện của kỹ nhiều thập kỷ. Do đó, cơ hội để tích lũy các đột biến thuật mPCR chứa IC xác định B. anthracis trên thực DNA bị hạn chế, dẫn đến sự biến đổi dí truyền tương địa và chế tạo bộ kit mPCR đa mồi chẩn đoán chính đối íỉ [7]. Từ đó, việc thiết kế kỹ thuật PCR chẩn đoán xác B. anthracis. B. anthracis và thư nghiệm dựa írên các chủng phân Lời cảm ơn: Công trinh này được hoàn thành nhờ lập trong nước hoàn toàn có thể chần đoán với chùng sự tài trợ kinh phí cùa Chương trình CNSH phục vụ An từ các khu vực khác trên thế giới. Đột biến mới ninh, Quốc phỏng do Bộ Quốc phòng chủ quan thông (A->G)1Q48 được xác định ờ gen capA trên chủng B. qua nhiệm vụ “Nghiên cứu chế tạo kit PCR đa mồi xác ànthracỉs Ba1 co íhề có ý nghĩa về đa dạng di truyền định nhanh đồng thời hai tác nhân vi khuẩn than và gen capA, nên đưực quan tâm khi nghiên cứu, lựa dịch hạch”. Mã số: 2013.75.58. chọn chủng cho nhiều mục đích khác nhau. TÀI LIỆU THAM KHẢO Đến nay, rất ít công bố về các phương pháp chẩn 1. Nguyễn Ngọc Bảo, Đoàn Trọng Tuyên, Nguyễn đoán phân tư đề cập đen chứng nội tại IC [6,8]. Chứng Xuân Thanh. Nghiến cứu đặc điểm di truyền phan tư mội nội tại ià cần thiết và gần như bắt buọc trong các phàn số yếu tố độc lực cùa chủng Baciiỉus anthracis lưu hành ơ ứng chẩn đoán dựa trên PCR. Một số công trình cũng khu vực mien núi phía Bắc Việt Nam. Hội nghị khoa học đã nghiên cứu IC nhưng thường ià bổ sung trong giài Công nghệ Sinh họctọàn quốc 2013. 2013. pp. 594-8. đoạn phản ứng khuếch đại nên không kiểm soát được 2. Đinh Thị Thù Hằng, Sơn Nguyễn Thái. Nghiên cứu quá trỉnh tách chiết acid nucleic [10,12]. Trong công toàn bộ trình tự gen pagA trên một số chủng Bacillus anthracis phân lập ở miền Bắc Việt Nam. Tạp chí Y Dược trình này, để kiểm soát toàn bộ các công đoạn xềí học Quân sự. 2015. 40(3), pp. 135-143. nghiệm, lò được bổ sung vào mấu trong quá trinh tách 3. Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng chiết với một iượng tối thiểu có thể phat hiện được Tuyên và c s . Thiết kể chửng nội tại tái tổ hợp trong phản nhằm loại bổ tối đa anh hưởng đến hiệu quả ỉẩch chiết ứng multiplex PCR chần đoán Bacillus anthracis. Tạp chí cũng như mPCR. Nồng độ ỈC được sử dụng ià Y Dược học Quân sự. 2015.40(6), pp. 17-26. 5x104copies/phản ứng (chi tiết quá trinh tối ưu mPCR 4. Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thối Sơn, Minh chứa IC đã được công bố trong bài báo gần đây cùa Nghiêm Ngọc, Phát triền phản ứng multiplex PCR chứa nhóm nghiên cưu [4]). Sản phẩm IC xuấỉ hiện ở tất cả chứng nội tại ỉái tổ hợp xác định đồng thời vi khuẩn các mẫu trên bản điện di, điều này chứng tổ quá trinh Bacillus anthracis và Yersinia pesíis. Tạp chí Y học Dự tách chiết và mPCR đảm bảo, theo đó các kết quả xác phòng. 2015. XXV(8 (168)), pp. 239-246. _ định là đáng tin cậy (Hình 2). 5. Candela, I., Mock M., and Fouet A. CapE, a 47- Có nhiều phương pháp từ đơn giàn đến phức tạp amino-acid peptide, is necessary for Bacillus anthracis được sử dụng để phát hiện B. anthracis. Nuôi cấy, poiygiutamate capsule synthesis. J Bacterioi. 2005. định danh trên môi trường thạch máu đòi hỏi nghiêm 187(22), pp. 7765-72. ngặt về vấn đề an toàn sỉnh học. Một số phương pháp 6. Eíỉerbrok, H., Nattermann H.t Oze! M., et a!. Rapid mien dịch như phát hiện kháng nguyên và độc tố B. and sensitive identification of pathogenic and apathogenic anthracis có ứng dụng hạn chế do đọ nhạy và độ đặc Bacillus anthracis by real-time PCR. FEMS Microbiol Lett. hiệu thấp. Phản ứng mPÒR trong công trình này được 2002. 214(1), pp. 51-9. 7. Hugh-Jones, M. and Blackburn J. The ecology of thực hiện đơn giản đã cho phép xác định nhanh, chính Bacillus anthracis. Mol Aspects Med. 2009. 30(6), pp. xác B. anthracis gây bệnh trong tự nhiên. Điểm đặc 356-67. biệt ờ chỗ, mPCR có chứa ba cặp mồi dùng đề khuếch 8. Kiee, s. R., Ozel M., Appel B., et a!. đại đồng thời bốn sản phẩm gom ba gen đích vrrA, Characterization of Bacillus anthracis-like bacteria isolated pagA, capẠ của B. anthracis và một gen IC. Phản ứng from wild great apes from Cote d'Ivoire and Cameroon. J này đã khắc phục được hiện tượng đương tính gia Bacteriol. 2006. 188(15), pp. 5333-44. trong trường hợp chủng B. anỉhracis không đay đủ độc 9. Letant, s. E., Murphy G. A., Alfaro T. M., et a!. lực, giúp giam giá thành và thời gian chẩn đoán so với Rapid-viabiiity PCR method for detection of live, virulent việc phai thực hiện các phản ứng đơn. Mặt khác, IC tái Baciiius anthracis in environmental samples. Appl Environ ỉồ hợp được bổ sung vào mẫu trong quá trình tách Microbiol. 2011. 77(18), pp. 6570-8. _ chiết ADN và khuếch đại đồng thời trong phản ứng 10. Loiez, c., Herwegh s., Wallet F,, et al. Detection of 483
Yersinia pesiis in sputum by real-time PCR. J Clin Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Đoàn Trọng Microbiol. 2003. 41 (10) pp. .4873-5. _ Tuyên và CS. Thiết kế chửng nội tại tái tổ hợp trong phản 11. Lovchik, J. A., Drysdale M., Koehler T. M , et aỉ. ứng multiplex PCR chẩn đoan Bacillus anthràcis. Tạp chí Expression of either lethal toxin or edema toxin by Bacillus Y Dược học Quân sự. 2015.40(6), pp. 17-26. anthracis is sufficient for virulence in a rabbit model of Đinh Thị Thu Hằng, Nguyễn Thái Sơn, Nghiêm Ngọc inhalational anthrax. Infect Immun. 2012. 80(7), pp. 2414- Minh. Phát triền phàn ưng multiplex PCR chứa chửng nội 25. tại tải tổ hợp xác định đổng thời vi khuẩn Bacillus 12. Ngan, G. J „ Ng L. M., Lin R. I ., et a!. a n iu ia ^ iS VO to r s in ic a p c ? d ik > . i