Nghiên cứu thiết lập kỹ thuật seminested PCR phát hiện nấm Candida albicans

Chia sẻ: Nguyễn Thị Thanh Triều | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

72
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm xác định các điều kiện của kỹ thuật seminested PCR phát hiện nấm Candida albicans và thử nghiệm áp dụng kỹ thuật seminested PCR đ xác định một s ch ng nấm Candida albicans phân lập Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu thiết lập kỹ thuật seminested PCR phát hiện nấm Candida albicans

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP KỸ THUẬT SEMINESTED PCR PHÁT HIỆN NẤM CANDIDA ALBICANS Đỗ Ngọc Ánh*; Hoàng Cao Sạ** Đoàn Ngọc Giang Lâm***; Phạm Văn Minh* TÓM TẮT Mục tiêu: xác định điều kiện và thử nghiệm áp dụng kỹ thuật seminested PCR phát hiện nấm Candida albicans. Phương pháp: thiết lập kỹ thuật seminested PCR trên cơ sở gen đích mã hóa ® rARN của chủng nấm Candida albicans ATCC 90028 và đánh giá thử trên 27 chủng nấm Candida albicans phân lập ở Việt Nam. Kết quả: xác định đƣợc điều kiện phản ứng PCR1, PCR2 cũng 2+ nhƣ ngƣỡng phát hiện, tính đặc hiệu của kỹ thuật. PCR 1: nồng độ Mg 1,5 mM, dNTPs 150 µM, o 2+ nồng độ mồi 0,2 - 0,3 pmol/µl và nhiệt độ gắn mồi là 55 C. PCR2: nồng độ Mg 2,0 mM, dNTPs o 200 µM, nồng độ mồi 0,2 pmol/µl và nhiệt độ gắn mồi 55,2 C. Kỹ thuật seminested PCR có khả năng phát hiện chính xác nấm C. abicans ở ngƣỡng ≥ 10 pg/µl. Sau khi đƣợc thiết lập, đánh giá kỹ thuật trên ADN của 27 chủng C. albicans phân lập ở Việt Nam, kết quả cho thấy, cả 27 chủng đều cho band đặc hiệu có kích thƣớc 410 bp nhƣ mong đợi. Kết luận: kỹ thuật seminested PCR thu đƣợc cho phép xác định chính xác nấm Candida albicans. * Từ khóa: Candida albicans; Seminested PCR. Development of Seminested PCR for Detection of Candida Albicans Summary Aims: To establish and evaluate a system of seminested polymerase chain reaction (PCR) ® assays to identify Candida albicans. Methods: DNA of Candida albicans ATCC 90028 and 27 samples from Vietnam was extracted and used as a template in PCR assays targeting the ribosomal DNA of Candida albicans. Results: PCR1 and PCR2 assays were optimized to 2+ detect exactly rRNA gene of Candida albicans. PCR1 with 1.5 mM Mg , 150 µM of each o deoxyribonucleotide, 0.2 - 0.3 pmol/µl of each primer and annealing temperature 55 C. PCR2 2+ with 1.5 mM Mg , 200 µM of each deoxyribonucleotide, 0.2 pmol/µl of each primer and annealing o temperature 55.2 C. The limited concentration for detection of C. albicans was not less than 10 pg per µl DNA of C. albicans in total volume of PCR1 assay. We obtained positive reactions for all 27/27 samples from patients who had been previously diagnosed with Candidiasis of C. albicans by conventional techniques. Conclusions: The seminested PCR assays described here can support the diagnosis of Candida albicans. * Key words: Candida albicans; Seminested PCR. * Học viện Quân y ** Bệnh viện Đa khoa Nam Định *** Bệnh viện TWQĐ 108 Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Ngọc Ánh (dranhk61@gmail.com) Ngày nhận bài: 30/05/2015; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 09/07/2015 Ngày bài báo được đăng: 20/07/2015 27 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 ĐẶT VẤN ĐỀ Candida sp. là nấm men sống hội sinh trong đƣờng tiêu hóa và đƣờng sinh dục, có ở 70% dân số và ít nhất khoảng 75% phụ nữ bị nhiễm nấm này một lần trong đời [5, 6]. Tuy nhiên, ở những cơ thể có nhiều yếu tố thuận lợi, nấm này sẽ chuyển từ hội sinh sang gây bệnh. Bệnh do nấm Candida sp. có thể đƣợc phân thành hai nhóm: nhóm gây tổn thƣơng ở da, niêm mạc và nhóm gây bệnh nội tạng. Bệnh nấm Candida sp. nội tạng rất trầm trọng, chúng đe dọa mạng sống và tû lệ tử vong lên có thể lên tới 30% [9]. Đối với nhiễm Candida sp. máu, tỷ lệ tử vong có thể lên tới 50% [7, 8], đặc biệt đối với trẻ sơ sinh [10]. Vì những lý do trên, Candida sp. đã trở thành tác nhân gây bệnh nguy hiểm đối với ngƣời. Việc xác định chính xác căn nguyên gây bệnh đóng vai trò quan trọng trong lựa chọn phƣơng pháp điều trị. Do đó, ở ngƣời nghi nhiễm Candida sp., nấm và loài nấm gây bệnh cần đƣợc phát hiện, xác định sớm để có biện pháp điều trị kịp thời. Trong số các Candida sp., Candida albicans là loài nấm phổ biến nhất. Một số nấm khác có thể gặp nhƣng ít hơn là Candida glabrata, Candida krusei, Candida dubliniensis, Candida parapsilosis và Candida tropicalis [4]. Các phƣơng pháp xét nghiệm chẩn đoán nấm đƣợc sử dụng chủ yếu hiện nay là: phƣơng pháp xét nghiệm trực tiếp, phƣơng pháp nuôi cấy, phƣơng pháp huyết thanh. Ƣu điểm của phƣơng pháp xét nghiệm trực tiếp bằng soi tƣơi là nhanh, đơn giản, dễ thực hiện, độ đặc hiệu cao nhƣng độ nhạy thấp. Nuôi cấy có độ chính xác cao 28 hơn soi tƣơi nhƣng phải sau 3 - 5 ngày mới có kết quả [3]. Phát hiện kháng nguyên vỏ tuy độ nhạy cao hơn nhƣng độ đặc hiệu thấp, tỷ lệ dƣơng tính giả và âm tính giả cao. Mặt khác, trong trƣờng hợp nấm gây bệnh ở máu, mô chẩn đoán bằng các phƣơng pháp này gặp nhiều khó khăn. Hơn nữa, ngay cả khi đã phân lập đƣợc nấm, việc xác định loài nấm đó là loài gì bằng phƣơng pháp truyền thống cũng gặp nhiều khó khăn, cần nhiều thời gian [3]. Hiện nay, công nghệ sinh học phân tử phát triển đã giúp xác định nhanh loài của một vi sinh vật với độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Tuy nhiên, vấn đề ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán nấm ở Việt Nam còn mới mẻ. Nhằm góp phần phát triển kỹ thuật sinh học phân tử vào chẩn đoán nấm ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm: - Xác định các đi u kiện c a k thuật seminested PCR phát hiện nấm Candida albicans. - Th nghiệm áp dụng k thuật seminested PCR đ xác định một s ch ng nấm Candida albicans phân lập Việt Nam. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Đối tượng nghiên cứu. - 01 chủng nấm chuẩn Candida albicans ATCC®90028. - 27 chủng nấm Candida albicans phân lập từ máu, dịch âm đạo ở Việt Nam. 2. Vật liệu nghiên cứu. - Dụng cụ: máy PCR (Eppendorf, Đức), máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettech, Đức), TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 máy soi và chụp gel Dolphin Doc (Wealtec, Mỹ), bộ điện di. - Sinh phẩm hóa chất: môi trƣờng Sabouraud, dung dịch NaCl 0,9%, dung dịch mực tàu, bộ kít tách ADN tổng số (QIAGEN, Mỹ), gel agarose, dung dịch TBE 0,5%, dung dịch enzym giới hạn MspI (Fermentas), các hóa chất cần thiết khác. - Cặp mồi cho phản ứng PCR: cặp mồi ITS1 (forward, 5’-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3’) và ITS4 (reverse, 5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’) đã đƣợc chọn (SH Mirhendi và CS, 2001) đƣợc sử dụng cho vòng 1, kích thƣớc đoạn gen thu đƣợc 535bp. Đoạn gen này chứa một phần đoạn 18S, một phần đoạn 28S, toàn bộ các đoạn giao gen ITS1, 5.8S và ITS2. Cặp mồi CalF (5’-TCAACTTGTCACACCAGATTATT-3’) và ITS4 đƣợc sử dụng cho vòng 2, kích thƣớc đoạn gen thu đƣợc 410 bp. 3. Phƣơng pháp nghiên cứu. * Phân lập mẫu nấm s nghiên cứu: dụng trong mix, ADN tổng số, mồi và nƣớc cất khử ion vừa đủ 25 μl. Thời gian chạy phản ứng PCR1 nhƣ sau: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút; 25 chu kỳ mỗi chu kỳ gồm 95oC/45 giây, 55oC/45 giây, 72oC/1 phút; 1 chu kỳ 72oC/10 phút. Sản phẩm phản ứng PCR1 đƣợc bảo quản ở 4oC cho tới khi thực hiện phản ứng PCR2. Phản ứng PCR2 có điều kiện tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR1, nhƣng nhiệt độ gắn mồi 55,2oC và số chu kỳ 30 lần. * Ki m tra sản phẩm PCR: Điện di sản phảm PCR và sản phẩm cắt giới hạn trên thạch agarose 1,2% và 2% trong môi trƣờng đệm TBE với thời gian 45 phút ở điện thế 100V. * Ki m tra ngưỡng phát hiện: Pha ADN nấm thành các dung dịch treo có nồng độ từ 10 -7 - 10-1 ng/µl. Lấy 2 µl dung dịch ADN ở trên chạy PCR trong điều kiện nhƣ nhau. Ngƣỡng phát hiện là giới hạn thấp nhất mà kết quả PCR2 còn nhìn rõ bằng mắt thƣờng trên điện di. * Ki m tra tính đặc hiệu: Nấm C. albicans chuẩn đƣợc phân lập từ ống chứa theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất (ATCC, Mỹ). Các chủng nấm C. albicans của Việt Nam đƣợc phân lập từ máu và dịch âm đạo cña bệnh nhân nhiễm nấm bằng cách cấy trên môi trƣờng thạch sabouraud có kháng sinh. Thực hiện phản ứng PCR1 với cặp mồi ITS1 và ITS4 trên ADN của các vi nấm men Candida non-albicans và vi khuẩn S. aureus, A. baumannii, K. pneumoniae, E. coli, P. aeruginosa, M. tuberculosis, ADN của virut viêm gan B và của ngƣời… để kiểm tra tính đặc hiệu. * Tách ADN và nhân đoạn gen đặc hiệu: 4. Địa điểm và thời gian nghiên cứu. Tách chiết ADN nấm C. albicans theo quy trình của Hãng QUIAGEN (Mỹ). Sau đó, dùng ADN làm khu«n cho phản ứng PCR. Thành phần phản ứng PCR gồm: master - Địa điểm nghiên cứu: labo Trung tâm Nghiên cứu Y Dƣợc học Quân sự và labo nấm Bộ môn Ký sinh trùng, Học viện Quân y. 29 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 - Thời gian nghiên cứu: từ 4 - 2013 đến 5 - 2015. 5. Phân tích và xử lý số liệu. - Kết quả đo nồng độ ADN trên máy NanoDrop 1000. Các kết quả đƣợc ghi chép, lƣu trữ và quy đổi theo đơn vị khác nhau. - Điện di và phân tích kết quả phản ứng PCR cùng với thang ADN chuẩn (100 bp). - So sánh và phân tích kết quả giải trình tự trên Ngân hàng Gen http://blast. ncbi.nlm.nih.gov. - Xây dựng cây phả hệ bằng phần mềm PHYLIP. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 1. Kết quả xác định điều kiện cho phản ứng PCR. * Kết quả xác định đi u kiện cho phản ứng PCR vòng ngoài (PCR1): Đ i với phản ứng PCR1, chúng tôi đã nghiên cứu và xác định được đi u kiện cho phản ứng này thực hiện t t, ổn định khi nồng độ Mg2+ 1,5 mM, dNTPs 150 µM, mồi 0,2 - 0, 3 pmol/µl và nhiệt độ gắn mồi 55oC… [1]. * Kết quả xác định đi u kiện cho phản ứng PCR vòng trong (PCR2): Sau khi xác định đƣợc các điều kiện cho phản ứng PCR1 nhƣ trên, thực hiện phản ứng PCR1 nhƣng với 25 chu kỳ và lấy sản phẩm bằng thực hiện phản ứng PCR2 để xác định các điều kiện. - Kết quả xác định nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+: Để tối ƣu nhiệt độ gắn mồi Ta, chúng tôi dựa theo lý thuyết Ta = Tm ± 5°C [2]. Với cặp mồi CalF và ITS4, ta có Tm = 56 58°C và Ta = 51 - 63°C. Thực tế, chúng tôi chọn nhiệt độ gắn mồi Ta = 52 - 58°C. Để xác định nhiệt độ gắn mồi, chuẩn bị 11 phản ứng seminested PCR giống nhau về thành phần (trong đó [Mg2+ = 2.0 mM]) nhƣng chạy PCR theo gradient nhiệt độ gắn mồi mặc định cài đặt trên máy PCR. Hình 1: Kết quả PCR với nhiệt độ gắn mồi 52 - 58°C và nồng độ Mg2+= 2,0 mM. 30 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 6-2015 Ở dải nhiệt độ 52 - 58°C, tất cả các giếng đều lên band đặc hiệu có kích thƣớc 410 bp. Quan sát kỹ thấy, giếng 7 tƣơng ứng với nhiệt độ gắn mồi 55,2°C cho band đặc hiệu sáng và rõ nét nhất. Hình 3: Kết quả PCR2 với nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ khác nhau. Hình 2: Kết quả PCR với nhiệt độ gắn mồi 55,2°C với nồng độ Mg2+ = 2,0 mM. Dựa trên kết quả thu đƣợc, chúng tôi sử dụng nhiệt độ gắn mồi 55,2°C để đánh giá lại sự ổn định của phản ứng PCR2. Để thực hiện điều này, chuẩn bị 4 phản ứng seminested PCR giống nhau và chạy PCR1 và PCR2 trong điều kiện nhƣ nhau với nhiệt độ gắn mồi PCR2 là 55,2°C. Kết quả cho thấy cả 4 giếng đều lên 1 band đặc hiệu duy nhất. Vì vậy, 55,2°C đƣợc chọn làm nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng PCR2. Trong các điều kiện nhiệt độ gắn mồi và nồng độ Mg2+ khác, phản ứng PCR2 không ổn định hoặc có band phụ. - Kết quả xác định các đi u kiện nồng độ mồi, dNTPs, Taq DNA polymerase: Các đi u kiện khác đ phản ứng PCR2 thực hiện t t là: nồng độ mồi trong hỗn dịch đem thực hiện phản ứng 0,2 pmol/µl, nồng độ Taq ADN polymerase 0,025 UI/µl và dNTPs là 200 µM. * Kết quả xác định ngưỡng phát hiện và tính đặc hiệu: Để kiểm tra ngƣỡng phát hiện của kỹ thuật seminested PCR, tiến hành pha loãng để tạo panel nồng độ ADN của nấm Candida albicans giảm dần theo lũy thừa 10 từ 1 - 10-5ng/µl và đƣa vào thực hiện phản ứng PCR1, PCR2 với các điều kiện đã tối ƣu nhƣ trên. 31