Nghiên cứu định lượng nồng độ ADN BK polyomavirus bằng kỹ thuật Tagman probe real-time PCR

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018<br /> <br /> NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƢỢNG NỒNG ĐỘ ADN BK<br /> POLYOMAVIRUS BẰNG KỸ THUẬT TAQMAN PROBE<br /> REAL-TIME PCR<br /> Hoàng Xuân Sử*; Trịnh Thị Mỹ Anh**; Nguyễn Sỹ Lánh***<br /> Phan Quốc Toản****; Nguyễn Giang Hòa****; Đinh Thị Thu Hằng*<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: thiết lập được kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng nồng độ BK<br /> polyomavirus ADN. Vật liệu và phương pháp: kỹ thuật Taqman probe real-time PCR định lượng<br /> nồng độ BK polyomavirus ADN trong công trình này được nghiên cứu thiết lập với cặp mồi,<br /> probe đặc hiệu thiết kế để nhân gen VP1 sử dụng phần mềm Primer3plus, Bioedit và đánh giá<br /> bước đầu trên bộ mẫu chuẩn ADN cùng mẫu huyết tương, nước tiểu của 10 bệnh nhân sau<br /> ghép thận có BK polyomavirus (+) và 10 mẫu máu ngoại vi của người hiến máu tình nguyện BK<br /> polyomavirus (-). Kết quả và kết luận: phản ứng real-time PCR tối ưu có thành phần: 1X<br /> QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Đức); 0,2 μ mồi xuôi, mồi ngược mỗi loại, 0,05<br /> o<br /> μ probe, 5 μl ADN khuôn, điều chỉnh H2O khử ion đủ thể tích 20 μl, chu trình nhiệt: (50 C/2<br /> o<br /> o<br /> o<br /> o<br /> phút) (95 C/15 phút) (94 C/15 giây, 58 C/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7 C. Kỹ thuật Taqman<br /> probe real-time PCR đạt ngưỡng phát hiện 1 copy/µl trên panel mẫu với độ tin cậy 95%, bước<br /> đầu đánh giá cho kết quả tương đương khi so sánh với kit RealStar® BKV PCR 1.0 trên<br /> 20 mẫu bệnh phẩm lâm sàng, góp phần chủ động trong việc theo dõi và giám sát BK<br /> polyomavirus ở bệnh nhân sau ghép thận ở Việt Nam.<br /> * Từ khóa: BK polyomavirus; Bệnh thận do B<br /> Taqman probe real-time PCR.<br /> <br /> polyomavirus; Định lượng; Ghép thận;<br /> <br /> Quantification of BK Polyomavirus Load in Vietnamese Renal<br /> Transplant Recipients by an In-house Taqman Probe Real-time<br /> PCR Assay<br /> Summary<br /> Objectives: To establish an in-house real-time PCR assay using Taqman probe for detection<br /> and quantification of BKV DNA load in renal transplant recipients. Materials and methods: An inhouse quantitative real-time PCR assay was established with specific primer pairs and Taqman<br /> probe targeting VP1 gene of BKV using Primer3plus and Bioedit. We also initially evaluated<br /> performance of the developed assay on 10 fold serial dilutions of plasmid DNA inserted VP1<br /> gene sequence of BKV as well as clinical specimens collected from 10 recipients infected with<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia<br /> *** Bệnh viện Việt Đức<br /> **** Bệnh viện Quân y 103<br /> Người phản hồi (Corresponding): Đinh Thị Thu Hằng (hangdinhbio@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 27/02/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 17/05/2018<br /> Ngày bài báo được đăng: 30/05/2018<br /> <br /> 29<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018<br /> BKV after renal transplantation and peripheral blood samples from 10 healthy blood donors<br /> negative for BKV DNA. Results and conclusion: The optimization of real-time PCR assay had<br /> the following components: 1X QuantiTect Probe PCR Master Mix (Qiagen, Germany); 0 05 μM<br /> probe, 5 μl DNA template, and deionized H2O equals to 20 μl, was performed using the Rotoro<br /> o<br /> GeneQ instrument with the cycling conditions as follows: 50 C for 2 mins, denaturation at 95 C<br /> o<br /> o<br /> for 15 mins, followed by 45 cycles of amplification at 94 C for 15s, 58 C for 60s. In the<br /> developed assay, the limit of detection is 1 copy/µl on DNA panel at 95% confidence. In<br /> conclusion, this Taqman probe real-time PCR assay achieved a concordant result with the<br /> RealStar BKV PCR 1.0 kit on 20 clinical specimens contributes to monitoring and surveilance<br /> of BKV of kidney transplant recipients in Vietnam.<br /> * Keywords: BK polyomavirus; BK polyomavirus-associated nephropathy; Quantification;<br /> Renal transplantation; Taqman probe real-time PCR.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hơn 40 năm đã qua kể từ khi B<br /> polyomavirus (BKV) lần đầu tiên được<br /> phân lập từ nước tiểu của một bệnh nhân<br /> (BN) ghép thận (viết tắt là BK) bị hẹp niệu<br /> quản [2], nhưng loài virut cơ hội này vẫn<br /> cần được nghiên cứu để làm sáng tỏ cơ<br /> chế bệnh học của nhiều bệnh liên quan.<br /> BKV là thành viên của nhóm nhỏ<br /> Polyoma của Papovaviruses, bao gồm<br /> BKV, JC virut và Simian 40 virut (SV-40),<br /> là một loại virut khá phổ biến với tỷ lệ<br /> huyết thanh dương tính ở trẻ em trung<br /> bình 80% [4].<br /> Nhiễm B V thường không có triệu<br /> chứng lâm sàng, tuy nhiên một số triệu<br /> chứng cũng được ghi nhận là sốt và viêm<br /> đường hô hấp trên thể nhẹ [5]. Sau khi<br /> nhiễm nguyên phát, B V vẫn còn tiềm ẩn<br /> ở nhiều cơ quan trong cơ thể, đặc biệt<br /> trong các tế bào biểu mô niệu đạo và biểu<br /> mô thận. hi cơ thể trong tình trạng bị ức<br /> chế miễn dịch, suy giảm miễn dịch qua<br /> trung gian tế bào có liên quan đến tái hoạt<br /> động và sao chép của virut, dẫn đến kích<br /> hoạt một chuỗi phản ứng và phân giải tế<br /> bào [6]. Ở BN ghép thận, sau khi BKV<br /> nhân lên, đi vào các mao mạch, xuất hiện<br /> trong nước tiểu (viruria) và tấn công bộ<br /> 30<br /> <br /> phận ghép, dẫn đến tổn thương khác<br /> nhau. hoảng 1/3 số BN có viruria sẽ<br /> phát triển B V trong máu (viremia), nếu<br /> không được can thiệp kịp thời sẽ phát<br /> triển thành bệnh thận do B V (B Vassociated nephropathy, B VN) với tỷ lệ<br /> dao động 1 - 10%, dẫn đến thải ghép, mất<br /> chức năng thận ghép [5]. Việc tái hoạt<br /> động của BKV ở người nhận ghép thận<br /> với dấu hiệu thường gặp là virut phát tán<br /> trong nước tiểu với tỷ lệ 20 - 60% BN [6].<br /> Trong khi đó, ở những người khỏe mạnh<br /> hay BN có khả năng miễn dịch, hiện<br /> tượng tái hoạt động của B V và xuất hiện<br /> B V viruria rất hiếm. Ngoài liên quan đến<br /> thận ghép, B V thường gặp ở người<br /> nhận ghép tủy xương [7], hay một số báo<br /> cáo cũng cho thấy B V và B V viruria ở<br /> BN ghép tạng không phải thận như ghép<br /> tim, phổi và gan. Nhìn chung, BKV có mặt<br /> trong máu hoặc nước tiểu không liên<br /> quan đến suy giảm chức năng thận ở<br /> những BN này [4, 5, 8, 9].<br /> Như vậy, đến nay BKV được khẳng<br /> định là nguyên nhân quan trọng hàng đầu<br /> dẫn đến B VN ở BN sau ghép thận 4].<br /> Hiện tượng mất mô thận ghép thấy ở<br /> 45% BN BKVN [10]. Chính vì vậy, việc<br /> chẩn đoán sớm và ức chế hoàn toàn BKV<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018<br /> nhân lên sau ghép thận là đích điều trị<br /> cuối cùng nhằm hồi phục cả chức năng<br /> và hình thái của thận ghép. Định lượng<br /> nồng độ BKV ADN bằng real-time PCR có<br /> giá trị trực tiếp trong phát hiện tái hoạt<br /> động của virut cũng như giám sát điều trị<br /> [1]. BKV với hệ gen là ADN dạng vòng,<br /> kích thước 5,13 kb, trong đó gen VP1 mã<br /> hóa cho viral protein 1 thường sử dụng<br /> trong chẩn đoán. Cho đến nay, chưa có<br /> nghiên cứu phát triển kỹ thuật phân tử về<br /> B V được công bố ở Việt Nam. Một số<br /> cơ sở y tế đã sử dụng kít thương mại như<br /> Realstar BKV PCR (Altona Diagnostics,<br /> Đức), Artus® BK Virus RG PCR Kit<br /> (Qiagen, Đức)… xác định tải lượng BKV<br /> ADN, tuy nhiên giá thành các kít này rất<br /> cao, đòi hỏi đầu tư trang thiết bị đồng bộ<br /> và chưa đề cập đến khía cạnh các kít này<br /> có thể không phù hợp với một số chủng<br /> BKV ở Việt Nam. Chính vì vậy, chúng tôi<br /> thực hiện công trình này nhằm: Thiết lập<br /> được kỹ thuật Taqman probe real-time<br /> PCR định lượng nồng độ BKV ADN, góp<br /> phần chủ động trong việc theo dõi và<br /> giám sát BKV ở BN sau ghép thận.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Mẫu bệnh phẩm.<br /> Lựa chọn mẫu máu ngoại vi (06 mẫu,<br /> ký hiệu PB 1, 2, 5, 7, 8, 10), nước tiểu<br /> (04 mẫu, ký hiệu PBK3, 4, 6, 9) của<br /> 10 BN sau ghép thận có BKV (+), trong<br /> đó 1 BN B VN (PB 10) được khẳng định<br /> bằng mô bệnh học kết hợp với phân tích<br /> trình tự gen VP1 của BKV, 9 BN còn lại<br /> khẳng định bằng semi-nested PCR theo<br /> Arthur và CS [11] (nhóm bệnh) và 10 mẫu<br /> máu ngoại vi của người hiến máu tình<br /> <br /> nguyện BKV (-) (nhóm chứng). Các mẫu<br /> bệnh phẩm được cung cấp nhờ hợp tác<br /> nghiên cứu giữa Viện Nghiên cứu Y<br /> Dược học Quân sự, Học viện Quân y và<br /> Khoa Thận, Lọc máu - Bệnh viện Quân y<br /> 103, Học viện Quân y, Bệnh viện Hữu<br /> nghị Việt Đức và Bệnh viện Trung ương<br /> Huế.<br /> 2. Thiết lập kỹ thuật Taqman probe<br /> real-time PCR.<br /> 200 µl mẫu huyết tương, cặn nước<br /> tiểu được sử dụng để tách chiết BKV<br /> ADN theo quy trình bộ kit GeneJET<br /> Whole Blood Genomic DNA Purification<br /> Mini Kit (Thermo Scientific, Mỹ), thu<br /> 100 µl mẫu ADN. Cặp mồi, Taqman<br /> probe đặc hiệu thiết kế để nhân gen VP1<br /> sử dụng phần mềm Primer3plus và<br /> Bioedit dựa trên trình tự tham chiếu của<br /> gen VP1 BKV đã công bố trên Genbank<br /> có tên qBK-F/R, qBK-Pr và đặt Hãng IDT,<br /> Mỹ tổng hợp, có trình tự qBK-F: 5’TAGGCGCCAACCATTAGAC-3’; qB -R:<br /> 5’- ACGTAATGGCACTTGCTCG-3’; qB -Pr:<br /> 5’-FAM- GAGCAGCCGCAGCCCATATAGGCBHQ1-3’. Quá trình tối ưu kỹ thuật realtime PCR bao gồm khảo sát trên chu trình<br /> nhiệt, trong đó lần lượt đánh giá nhiệt độ<br /> gắn mồi khác nhau; tối ưu các thành<br /> phần tham gia trên cơ sở phản ứng realtime PCR tiêu chuẩn. Phản ứng real-time<br /> PCR có thành phần như sau: 1X<br /> QuantiTect Probe PCR Master Mix<br /> (Qiagen, Đức); 0,2 - 0,5 μ mồi xuôi, mồi<br /> ngược mỗi loại, 0,05 - 0,3 μ probe, 5 μl<br /> ADN khuôn, điều chỉnh H2O khử ion<br /> DNAase/RNAse free đủ thể tích 20 μl.<br /> Quá trình khuếch đại thực hiện trên máy<br /> real-time PCR Rotor-Gene Q (Qiagen,<br /> Đức) với chu trình: (50oC/2 phút)<br /> 31<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018<br /> (95oC/15 phút) (94oC/15 giây, 56 60oC/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7oC.<br /> Kết quả real-time PCR tối ưu được lựa<br /> chọn tại giá trị khảo sát cho chu kỳ<br /> ngưỡng thấp nhất.<br /> 3. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR<br /> định ƣợng nồng độ BKV ADN.<br /> * Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định<br /> lượng nồng độ BKV ADN trên bộ mẫu<br /> chuẩn ADN:<br /> Bộ mẫu chuẩn ADN được thiết lập từ<br /> mẫu plasmid tinh khiết pGEMT-VP1 pha<br /> loãng trong nước khử ion tạo dải nồng độ<br /> 100 - 108 (copy/µl). Plasmid pGEMT-VP1<br /> này thiết lập qua con đường tái tổ hợp,<br /> chứa trình tự gen VP1 của BKV phân lập<br /> từ BN BKVN và khẳng định bằng giải<br /> trình tự [2]. Bộ mẫu chuẩn ADN là cơ sở<br /> để đánh giá kỹ thuật real-time PCR thiết<br /> lập cũng như xác định nồng độ BKV ADN.<br /> * Đánh giá kỹ thuật real-time PCR định<br /> lượng nồng độ BKV ADN trên mẫu lâm<br /> sàng:<br /> Kỹ thuật real-time PCR được khảo sát<br /> trên 10 mẫu BKV ADN của BN sau ghép<br /> thận có BKV (+) và 10 mẫu BKV (-) là<br /> huyết tương người khỏe mạnh hiến máu<br /> tình nguyện đã xác định BKV (-) bằng<br /> semi-nested PCR theo Arthur và CS [11].<br /> Đồng thời, chúng tôi định lượng BKV<br /> ADN đối chứng với bộ kít thương mại<br /> RealStar® BKV PCR 1.0 (Altona<br /> Diagnostics, Đức) có chứng chỉ CE-IVD<br /> [12].<br /> Tất cả các thử nghiệm tối ưu và định<br /> lượng đều tiến hành lặp lại ít nhất 2 lần,<br /> xác định giá trị trung bình, mỗi lần chạy<br /> đều có chứng âm là nước khử ion và<br /> chứng dương.<br /> 32<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Thiết lập và tối ưu kỹ thuật real-time<br /> PCR định ƣợng nồng độ BKV ADN.<br /> Kỹ thuật real-time PCR được thiết lập<br /> và tối ưu trên mẫu chứng dương là huyết<br /> tương BN sau ghép thận bị BKVN. Sử<br /> dụng phần mềm chuyên dụng để thiết kế<br /> một bộ mồi, probe hoàn toàn mới cho kỹ<br /> thuật Taqman probe real-time PCR có<br /> khả năng xác định BKV ADN phù hợp với<br /> các chủng của Việt Nam và quốc tế. Để<br /> hiệu suất phản ứng real-time PCR lý<br /> tưởng, chúng tôi lần lượt tối ưu các điều<br /> kiện cũng như thành phần phản ứng.<br /> <br /> a.<br /> <br /> b<br /> Hình 1: Biểu đồ khuếch đại tối ưu kỹ thuật<br /> real-time PCR phát hiện BKV AND.<br /> (A: Tối ưu nồng độ mồi. 1 - 4: Nồng độ<br /> mồi tương ứng là 0,2; 0,3; 0,4 và 0,5 µM;<br /> dc: Đối chứng âm là nước kh ion; B: Tối<br /> ưu nồng độ probe từ 0,05 - 0,3 µM)<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018<br /> Từ kết quả hình 1A cho thấy: nồng độ<br /> mồi cho giá trị Ct sớm nhất 0,2 µ . Như<br /> vậy, đây là nồng độ mồi tối ưu cho phản<br /> ứng real-time PCR BKV. Trên cơ sở nồng<br /> độ mồi tối ưu, nồng độ probe được khảo<br /> sát ở các mức 0,05; 0,1; 0,2; 0,3 µM. ết<br /> quả cho thấy, nồng độ probe 0,05 µM là<br /> <br /> nồng độ thấp nhất mà vẫn cho kết quả<br /> đáng tin cậy. Do đó, nồng độ probe tối ưu<br /> được lựa chọn cho phản ứng real-time<br /> PCR BKV ADN là 0,05 µM (hình 1B). Chu<br /> trình nhiệt tối ưu được xác định như sau:<br /> (50oC/2 phút) (95oC/15 phút) (94oC/15 giây,<br /> 58oC/60 giây) x 45 chu kỳ, duy trì ở 7oC.<br /> <br /> Bảng 1: Thành phần tối ưu của kỹ thuật real-time PCR.<br /> Thành phần<br /> <br /> STT<br /> <br /> Nồng độ cuối<br /> <br /> Thể tích (µ )<br /> <br /> 1X<br /> <br /> 10<br /> <br /> 1<br /> <br /> QuantiTect Probe PCR master mix<br /> <br /> 2<br /> <br /> qBK-F/R 5 µM<br /> <br /> 0,2 µM<br /> <br /> 0,8<br /> <br /> 3<br /> <br /> Probe qBK-Pr 5 µM<br /> <br /> 0,05 µM<br /> <br /> 0,2<br /> <br /> 4<br /> <br /> Nước khử ion DNA/RNAase free<br /> <br /> -<br /> <br /> 4<br /> <br /> 5<br /> <br /> BKV ADN<br /> <br /> 5<br /> Tổng<br /> <br /> 2. Đánh giá kỹ thuật real-time PCR<br /> định ƣợng nồng độ BKV ADN.<br /> Trong công trình này, trên cơ sở có<br /> sẵn mẫu chuẩn dương plasmid tái tổ hợp<br /> chứa gen đích VP1, lựa chọn mẫu<br /> plasmid có nồng độ, độ tinh sạch cao<br /> (nồng độ 1010 copies/µl, A260/280: 2,01<br /> được xác định bằng máy đo quang phổ<br /> Nanodrop ND-1000) làm mẫu chuẩn.<br /> Theo cách này, bộ mẫu chuẩn có độ<br /> đồng bộ cao nhất và có thể pha loãng<br /> thành các nồng độ chính xác, cũng là<br /> hướng thiết lập được WHO và NIBSC<br /> (National<br /> Institute<br /> for<br /> Biological<br /> Standards and Control, Viện Quốc gia về<br /> Kiểm chuẩn Sinh học) khuyến cáo. Các<br /> mẫu plasmid có dải nồng độ 100 - 108<br /> (copies/µl) được chia nhỏ thành nhiều<br /> <br /> 20<br /> <br /> ống, mỗi ống chứa ADN plasmid đủ<br /> dùng cho 1 phản ứng, bảo quản ở điều<br /> kiện -20oC. Kỹ thuật real-time PCR sau<br /> khi tối ưu đánh giá trên bộ mẫu chuẩn<br /> BKV ADN này cho hiệu suất phản ứng<br /> PCR đạt 103,7%, sai số 0,005 - các giá<br /> trị gần như lý tưởng, cho thấy quy trình<br /> tối ưu real-time PCR cũng như thao tác<br /> kỹ thuật tốt, bộ mẫu chuẩn đạt nồng độ<br /> có độ chính xác cao. Theo tính toán,<br /> ngưỡng phát hiện của kỹ thuật real-time<br /> PCR trên mẫu chuẩn ADN thiết lập này<br /> có thể đạt 1 copy/µl với độ tin cậy 95% ngưỡng đạt được ở một số kít thương<br /> mại hiện nay (dữ liệu không trình bày).<br /> Đây là cơ sở để đánh giá kỹ thuật realtime PCR định lượng nồng độ BKV ADN<br /> trên các mẫu lâm sàng (hình 2).<br /> 33<br /> <br />