Đánh giá và kiểm soát nhiễm ADN trong sinh thiết phôi phục vụ chẩn đoán và sàng lọc tiền làm tổ

TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> <br /> ĐÁNH GIÁ VÀ KIỂM SOÁT NHIỄM ADN TRONG SINH THIẾT<br /> PHÔI PHỤC VỤ CHẨN ĐOÁN VÀ SÀNG LỌC TIỀN LÀM TỔ<br /> Hoàng Văn Lương*; Nguyễn Duy Bắc*; Trần Ngọc Anh*<br /> Nguyễn Thanh Tùng*; Nguyễn Văn Điều*; Nguyễn Duy Ánh**<br /> Nguyễn Thị Sim**; Phạm Đức Minh***; Đàm Linh Phương*; Đặng Tiến Trường**<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: thiết lập kỹ thuật multiplex PCR phục vụ đánh giávà kiểm soát nhiễm trong sinh<br /> thiết phôi phục vụ sàng lọc và chẩn đoán phôi tiền làm tổ. Đối tượng và phương pháp: xây dựng<br /> phản ứng multiplex PCR trên mẫu gADN; tiến hành đánh giá trên 96 tế bào sinh thiết và 96<br /> mẫu dung dịch rửa tương ứng. Kết quả: thiết lập được phản ứng multiplex PCR đủ mạnh; kết<br /> quả đánh giá nhiễm ADN cho thấy 13,54% số mẫu media blank bị nhiễm và 87,5% số mẫu tế<br /> bào sinh thiết phôi có chứa ADN. Kết luận: thiết lập được phản ứng multiplex PCR đủ mạnh,<br /> đánh giá trạng nhiễm ADN ngoại lai trong sinh thiết và sàng lọc trước chuyển phôi đơn giản và<br /> hiệu quả. Chất lượng quá trình sinh thiết và kiểm soát nhiễm đã được cải thiện đáng kể.<br /> * Từ khóa: Kiểm soát nhiễm; Sinh thiết phôi; Multiplex PCR.<br /> <br /> Access and Control DNA Contamination in Embryo Biopsy<br /> Procedure for Preimplantation Genetic Diagnosis/Screening<br /> Summary<br /> Objectives: To establish a multiplex PCR method for contamination and quality control of<br /> embryo biopsy in PGD/PGS. Subjects and methods: Establish multiplex PCR on gDNA;<br /> evaluation of embryo biopsy on 96 single cells along with 96 media blank samples biopsied<br /> from the same embryos. Results: Established efficiency multiplex PCR; evaluation of embryo<br /> biopsy showed that 13.54% of media blank samples were contaminated and 87.5% of total<br /> single cells samples contained DNA. Conclusion: Successfully established a simple but<br /> effective DNA contamination and quality control method by multiplex PCR in embryo biopsy and<br /> PGS. The quality of embryo biopsy procedure and DNA were approval.<br /> * Keywords: DNA contamination control; Embryo biopsy; Multiplex PCR.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> giá tình trạng bất thường về di truyền ở<br /> Trong chẩn đoán và sàng lọc trước cấp độ gen đến toàn bộ nhiễm sắc thể;<br /> chuyển sinh (PGD/S - Preimplantation Genetic lựa chọn các phôi không bất thường<br /> Disgnosis/Screening), các phôi được đánh trước khi chuyển vào tử cung và có thai.<br /> * Học viện Quân y<br /> ** Bệnh viện Phụ sản Hà Nội<br /> ** Trường Đại học Khoa học Công nghệ Hà Nội<br /> Người phản hồi (Corresponding): Đặng Tiến Trường (truongdtvmmu@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 27/07/2017; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 30/08/2017<br /> Ngày bài báo được đăng: 05/09/2017<br /> <br /> 219<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017<br /> Các phôi tạo từ quy trình thụ tinh trong<br /> ống nghiệm (IVF-In vitro fertilization) được<br /> sinh thiết và thu nhận một hoặc một số tế<br /> bào phôi phục vụ phân tích di truyền bằng<br /> nhiều phương pháp, trong đó hầu hết đều<br /> có giai đoạn khuếch đại bằng phản ứng<br /> chuỗi (PCR - Polemerase Chain Reaction).<br /> Đặc trưng của PCR trong PGD và PGS là<br /> cực nhạy nên rất dễ nhiễm ADN ngoại lai<br /> và khả năng mất alen (ADO - allele Dropout)<br /> [7, 9]... Trong đó, nhiễm ADN ngoại lairất<br /> khó kiểm soát dẫn đến chẩn đoán sai.<br /> Nguồn ADN ngoại lai rất phong phú, nhưng<br /> chủ yếu xảy ra trong giai đoạn trước tiến<br /> hành PCR, đó là sinh thiết phôi và rửa tế<br /> bào phôi [10]; ADN ngoại nhiễm có thể từ<br /> kỹ thuật viên sinh thiết phôi hoặc ADN<br /> trong khu vực sinh thiết, rửa tế bào. Mẫu<br /> media blank xuất hiện ADN cũng có thể<br /> do quá trình sinh thiết phôi không thành<br /> công khiến tế bào bị vỡ làm thất thoát<br /> ADN vào giọt rửa. Bên cạnh đó, thành<br /> công của sinh thiết và rửa tế bào được<br /> đánh giá bằng sinh thiết được tế bào,<br /> không bị vỡ; rửa tế bào đảm bảo không bị<br /> nhiễm ADN ngoại lai. Hiện nay, có nhiều<br /> phương pháp kiểm soát nhiễm: không sử<br /> dụng lại vật tư cho các lần sinh thiết phôi<br /> tiếp theo; mặc đồ bảo hộ, rửa tế bào<br /> trong tủ hút vô trùng đặt trong phòng sạch<br /> riêng biệt [7]; lau bề mặt thiết bị bằng khử<br /> ADN [6]; sử dụng đầu côn có cột lọc;<br /> dùng đèn cực tím để khử nhiễm trong tủ<br /> hút [1, 2, 8, 3].. Tuy nhiên, các phương<br /> <br /> pháp này chưa thể khẳng định có sự xuất<br /> hiện ADN ngoại nhiễm hay không?. Đến<br /> nay, các trung tâm PGD trên thế giới đều<br /> tiến hành thử nghiệm đánh giá kết quả<br /> sinh thiết và rửa tế bào phôi trước khi tiến<br /> hành PGD trên lâm sàng nhằm đảm bảo<br /> chất lượng kết quả chẩn đoán [4]. Ở Việt<br /> Nam, đã có một số báo cáo về chẩn đoán<br /> trước chuyển phôi nhưng chưa thấy có<br /> nội dung nào đề cập vấn đề này. Nghiên<br /> cứu này, kỹ thuật multiplex PCR đủ nhạy<br /> được thiết lập và thực hành đánh giá quá<br /> trình sinh thiết phôi, rửa tế bào thành<br /> công và không bị nhiễm ADN ngoại lai.<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> NGHIÊN CỨU<br /> 1. Vật liệu nghiên cứu.<br /> - ADN tổng số của đối tượng nam, nữ;<br /> mẫu tế bào phôi và mẫu dung dịch rửa<br /> cuối cùng của mẫu tế bào phôi tương ứng.<br /> - Primer được tổng hợp bởi IDT (Mỹ)<br /> (bảng 1); KOH (Sigma); tricine (Sigama);<br /> 2x PCR Master mix Solution i-Taq, PBS<br /> (Sigma), nước tinh khiết (Invitrogen),<br /> agarose (Merk); Redsafe (Intron).<br /> - Thiết bị nghiên cứu: máy PCR ProFlex<br /> (Thermo Fisher Scientific, Mỹ), máy ly tâm<br /> lạnh Mikro 22R (Heltich, Đức), máy điện di<br /> (Cleaver Scientific, Anh), máy chụp ảnh<br /> gel OmniDOCi (Cleaver Scientific, Anh) và<br /> các thiết bị khác tại Phòng Phân tích ADN,<br /> Bộ môn Giải phẫu, Học viện Quân y.<br /> <br /> Bảng 1: Thông tin 2 cặp mồi trong phản ứng multiplex PCR.<br /> o<br /> <br /> Tên mồi<br /> <br /> Trình tự 5’-3’<br /> <br /> Tm ( C)<br /> <br /> FIIX-4F [5]<br /> <br /> ATGGGCTTGGACTTGGTATG<br /> <br /> 60,4<br /> <br /> FIIX-4R [5]<br /> <br /> AGCAGCTCCTCACCAGGAT<br /> <br /> 62,3<br /> <br /> DYS14F [11]<br /> <br /> GGGCCAATGTTGTATCCTTCTC<br /> <br /> 62,7<br /> <br /> DYS14R [11]<br /> <br /> GCCCATCGGTCACTTACACTTC<br /> <br /> 64,5<br /> <br /> 220<br /> <br /> Sản phẩm<br /> 318 bp<br /> 84 bp<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> 2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br /> * Giai đoạn tối ưu hóa: xác định nhiệt<br /> độ gắn mồi tối ưu của 2 cặp mồi trong<br /> phản ứng multiplex PCR trên 20 ng ADN<br /> toàn hệ gen, sau đó tiến hành phản ứng<br /> multiplex PCR trên 200 pg và 20 pg ADN<br /> toàn hệ gen để xác định chu trình nhiệt<br /> phù hợp và đánh giá khả năng thành<br /> công của phản ứng multiplex PCR trên<br /> mẫu tế bào sinh thiết từ phôi.<br /> * Giai đoạn đánh giá quy trình sinh<br /> thiết phôi: tiến hành phản ứng multiplex<br /> PCR trên mẫu tế bào sinh thiết từ phôi và<br /> mẫu media blank tương ứng nhằm xác<br /> định sự xuất hiện của ADN. Thành phần<br /> phản ứng multiplex PCR thể tích 25 µl<br /> gồm: 1x PCR Master mix Solution; 0,5 µM<br /> mỗi mồi trong cặp FIIX-4; 0,75 µM mỗi<br /> mồi trong cặp DYS14, 20 pg gADN<br /> (chứng dương) hoặc mẫu tế bào trong 2<br /> µl dung dịch PBS được ly giải bằng 1,5 µl<br /> <br /> KOH 0,6M; trung hòa bằng 1,5 µl tricine<br /> 0,6M; nước tinh khiết tùy chỉnh để phù<br /> hợp với thể tích phản ứng là 25 µl.<br /> Quá trình này gồm 4 lần đánh giá, mỗi<br /> lần đánh giá trên 24 mẫu tế bào sinh thiết<br /> từ phôi cùng với 24 mẫu media blank tương<br /> ứng. Tế bào sau khi sinh thiết phôi đặt<br /> trong 2,5 µl dung dịch PBS vào mỗi ống<br /> PCR, sau đó bổ sung 1,5 µl KOH 0,6 M, ủ<br /> 65oC trong 10 phút để ly giải tế bào và sau<br /> đó bổ sung 1,5 µl trisine 0,6 M để trung hòa.<br /> * Địa điểm và thời gian nghiên cứu:<br /> - Trung tâm Công nghệ Phôi, Học viện<br /> Quân y; Bệnh viện Phụ sản Hà Nội; Bệnh<br /> viện Phụ sản Trung ương.<br /> - Thời gian: 12 - 2016 đến 6 - 2017.<br /> * Đạo đức trong nghiên cứu:<br /> Nghiên cứu được Hội đồng Đạo đức<br /> trong nghiên cứu y sinh của Học viện<br /> Quân y phê duyệt.<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN<br /> 1. Kết quả tối ƣu hóa phản ứng multiplex PCR trên mẫu ADN.<br /> <br /> (Hình 1: Ảnh minh họa kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi DYS14<br /> ((-): chứng âm ; 55, 60, 61, 62, 65 lần lượt là các băng sản phẩm của phản ứng ở Ta<br /> lần lượt là 55oC, 60oC, 61 oC, 62 oC, 65oC; M50, M100: Marker 50 bp, 100 bp)<br /> 221<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ-2017<br /> <br /> Hình 2: Ảnh minh họa kết quả tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi FIIX-4<br /> ((-): chứng âm ; 55, 60, 61, 62, 65 lần lượt là các băng sản phẩm của phản ứng ở Ta<br /> lần lượt là 55oC, 60oC, 61 oC, 62 oC, 65oC; M100: Marker, 100 bp)<br /> Để thiết lập được phản ứng PCR đủ nhạy nhằm xác định sự có mặt các đoạn ADN<br /> ngoại lai, lượng ADN tương đương của một hoặc một vài tế bào, nghiên cứu đã sử<br /> dụng cặp mồi DYS14 có 9 amplicon và Cặp mồi FIIX-4.<br /> - Xác định Ta của các primer và Ta của phản ứng multiplex PCR.<br /> Hình 1 và hình 2 cho kết quả nhiệt độ gắn mồi tối ưu của 2 cặp mồi DYS14 và FIIX4 đều là 60oC.<br /> <br /> Hình 3: Hình ảnh minh họa phản ứng multiplex PCR trên các mẫu ADN<br /> có nồng độ 10 pg/µl khác nhau.<br /> (F1-F5: sản phẩm các phản ứng PCR trên 20 pg ADN của nữ; M1-M5: sản phẩm các<br /> phản ứng PCR trên 20 pg ADN của nữ; (-): chứng âm; M100: marker 100 bp)<br /> 222<br /> <br /> TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017<br /> Có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng tới kết<br /> quả phản ứng PCR như nhiệt độ gắn mồi,<br /> thời gian gắn mồi, thời gian kéo dài chuỗi,<br /> hoạt động của enzym, nồng độ dNTP,<br /> nồng độ Mg2+…Khi tối ưu hóa phản ứng<br /> PCR, cần phải tối ưu hóa tất cả những<br /> yếu tố đó để đạt kết quả tốt nhất. Tuy<br /> nhiên, công việc này mất nhiều thời gian,<br /> công sức và hóa chất. Vì vậy, thực tế tối<br /> ưu hóa phản ứng PCR thường tiến hành<br /> lựa chọn thành phần phản ứng tiêu chuẩn<br /> và tối ưu hóa nhiệt độ gắn mồi (Ta) đầu<br /> tiên. Nghiên cứu này, đã sử dụng 2x<br /> Master mix Solution của INtRON để tiết<br /> kiệm thời gian và chi phí tối ưu hóa các<br /> yếu tố liên quan tới thành phần phản ứng.<br /> Ta của phản ứng phụ thuộc vào nhiệt độ<br /> <br /> nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi và<br /> thường hơn kém Tm từ 5-10oC. Căn cứ<br /> vào Tm (bảng 1), chúng tôi tiến hành thử<br /> nghiệm tối ưu hóa ở dải nhiệt 55 - 65oC.<br /> Sau đó, tiến hành phản ứng multiplex<br /> PCR trên mẫu ADN có nồng độ 10 ng/µl<br /> và giảm dần xuống 100 pg/µl, 20 pg/µl kết<br /> hợp với điều chỉnh chu trình nhiệt phù<br /> hợp cho phản ứng multiplex PCR, kết quả<br /> thể hiện ở hình 3; ở các mẫu g ADN của<br /> nữ (F1 đến F5) xuất hiện sản phẩm có<br /> kích thước 318 bp; xuất hiện 2 băng (84<br /> bp và 318 bp) ở các mẫu gADN của nam<br /> (M1 đến M5).<br /> Qua nhiều thử nghiệm khác, chúng tôi<br /> xác định được thành phần phản ứng và<br /> chu trình nhiệt của phẩn ứng như bảng 1.<br /> <br /> Bảng 1: Chu trình nhiệt tối ưu hóa của phản ứng multiplex PCR.<br /> Bắt đầu<br /> <br /> Biến tính<br /> <br /> Gắn mồi<br /> <br /> Kéo dài<br /> <br /> Kết thúc<br /> <br /> Bảo quản<br /> <br /> 95<br /> <br /> 95<br /> <br /> 60<br /> <br /> 72<br /> <br /> 72<br /> <br /> 11<br /> <br /> Thời gian<br /> <br /> 15 phút<br /> <br /> 20 giây<br /> <br /> 30 giây<br /> <br /> 20 giây<br /> <br /> 3 phút<br /> <br /> +∞<br /> <br /> Số chu kỳ<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1<br /> <br /> 1<br /> <br /> o<br /> <br /> Nhiệt độ ( C)<br /> <br /> 45<br /> <br /> 2. Kết quả thực nghiệm trên các tế bào sinh thiết từ phôi dƣ.<br /> Quá trình đánh giá gồm 4 giai đoạn khảo sát, giữa các giai đoạn có hiệu chỉnh và bổ<br /> sung các biện pháp để làm tăng tỷ lệ thu được tế bào và giảm tỷ lệ nhiễm ADN ngoại lai.<br /> <br /> Hình 3: Hình ảnh minh họa kết quả kiểm soát ADN ngoại nhiễm và đánh giá quá<br /> trình sinh thiết phôi ở lần 1.<br /> (M50: marker 50 bp; 1AN, 2AN…: các mẫu media blank của các phôi số 1, 2…; 1A,<br /> 2A: các mẫu chứa tế bào sinh thiết từ các phôi 1, 2…; NC (negative control): đối chứng<br /> âm; PC (positive control): đối chứng dương)<br /> 223<br /> <br />