Tóm tắt luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm - Hà Minh Hiền

Chia sẻ: Tieppham Tieppham | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:14

Thêm vào BST

Báo xấu

202
lượt xem 27
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tóm tắt luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm do Hà Minh Hiền thực hiện nhằm mục tiêu: Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u mọc ở Việt Nam bằng một số kỹ thuật sắc ký và phổ nghiệm để chọn chất điểm chỉ dùng trong kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm từ dược liệu Mù u, nghiên cứu thiết lập 01 chất chuẩn đối chiếu để định tính và 01 dùng cho định lượng trong số các hợp chất phenol phân lập được, ứng dụng chất đối chiếu đã thiết lập để kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm từ dược liệu Mù u.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt luận án Tiến sĩ Dược học: Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả mù u để ứng dụng trong kiểm nghiệm - Hà Minh Hiền

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HÀ MINH HIỂN NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT PHENOL TỪ NHỰA VÀ VỎ QUẢ MÙ U ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC Mã số: 62.73.15.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP Hồ Chí Minh-Năm 2014
Công trình được hoàn thành tại: DANH MỤC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH 1. Hà Minh Hiển, Phạm Ngọc Dung, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn Thị, Võ Thị Bạch Huệ (2009), “Phân lập một số hợp chất phenol từ nhựa Mù u dư phẩm”, Tạp chí Dược học, số 395, tr. 33-36. Người hướng dẫn khoa học: 2. Ha Minh Hien, Tran Thi Thuy Tien, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Viet Kinh, PGS TS. NGUYỄN KHẮC QUỲNH CỨ “Phenolic compound and other constituents determined from crude ethyl TS. NGUYỄN VĂN THỊ acetate extract of fruit peels of Calophyllum inophyllum L.”, Analytica Vietnam Conference Proceedings 3/2009, Ho Chi Minh City, Vietnam, pp. 228-232. 3. Minh Hien Ha, Van Thi Nguyen, Khac Quynh Cu Nguyen, Emily LC Phản biện 1: GS.TSKH. Nguyễn Công Hào Cheah, Paul WS Heng (2009), “Antimicrobial activity of Calophyllum Viện Công nghệ Hóa học TP. Hồ Chí Minh inophyllum crude extracts obtained by Pressurized Liquid Extraction”, Phản biện 2: PGS.TS. Trịnh Văn Quỳ Asian Journal of Traditional Medicine, 4 (4), pp. 141-146. 4. Ha Minh Hien, Vo Thi Bach Hue, Nguyen Khac Quynh Cu, Nguyen Van Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Thi, Francoise NEPVEU, “Antimicrobial and antioxidant activities of Phản biện 3: PGS.TS. Phạm Đình Hùng methanolic extract obtained from resin of Calophyllum inophyllum L. nut Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh oil”, Proceedings of the Sixth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences 12/2009, Hue, Vietnam, pp. 64-68. 5. Hà Minh Hiển, Paul WS Heng, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn Thị, Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp Võ Thị Bạch Huệ (2011), “Nghiên cứu thiết lập chất đối chiếu calophyllolid dùng trong kiểm nghiệm và nghiên cứu dược liệu Mù u tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Calophyllum inophyllum L.” Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, số 3.2011, tr. 15- Vào hồi giờ ngày tháng năm 19. 6. Ha Minh Hien, Paul WS Heng, Nguyen Van Thi, Nguyen Khac Quynh Cu, Vo Thi Bach Hue (2011), “Development and Validation of a GC-MS Có thể tìm hiểu luận án tại: Method for Rapid Determination of Calophyllolide in Calophyllum - Thư viện Quốc gia Việt Nam inophyllum L.: A Quality Control Approach”, Chinese Journal of Natural Medicines, 9 (6), pp. 429-434. - Thư viện Khoa học Tổng hợp TP. Hồ Chí Minh 7. Hà Minh Hiển, Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Nguyễn Văn Thị, Võ Thị Bạch - Thư viện Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Huệ, Bùi Thị Thu Thảo (2013), “Nghiên cứu xác định calophyllolid bằng phương pháp HPLC-DAD ứng dụng trong kiểm nghiệm dung dịch thuốc từ dược liệu có dầu Mù u”, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc, số 2.2013, tr. 14-18.
đầu dò PDA SPD-M20A; phần mềm xử lý dữ kiện LCsolution. Cột 1. Đặt vấn đề Zorbax 250 mm × 4,6 mm, 5 μm, pha động acetonitril-dung dịch acid Cây Mù u có tên khoa học là Calophyllum inophyllum L. Clusiaceae, acetic 2% với chế độ rửa giải gradient: acetonitril 20-80%: dung từ lâu đã được dùng các bộ phận như: hạt, dầu hạt, nhựa cây, rễ, lá đ ể dịch acid acetic 2% 80-20% trong 30 phút. Tốc độ dòng 1 ml/phút và chữa bệnh nhất là ghẻ, nấm tóc, bệnh ngoài da, nhiễm trùng xương, o nhiệt độ cột 40 C. Phát hiện tại bước sóng 270 nm. Thể tích tiêm bỏng, thấp khớp….Tại Việt Nam, Mù u khai thác bằng cách đập quả mẫu 10 µl”. Hàm lượng calophyllolid (kl/kl) trong chế phẩm “Dầu bỏ vỏ, lấy hạt để ép dầu. Tinh chế dầu thô bằng cách tách loại nhựa Mù u Inopilo” thu được là 0,47 ± 0,01% (g/100 g). để thu được dầu Mù u dược dụng. Nhựa loại ra khi tinh chế dầu Mù u KIẾN NGHỊ và vỏ quả Mù u Việt nam chưa được nghiên cứu để sử dụng. - Tiếp tục áp dụng các phương pháp GC-MS, HPLC-DAD để xác Dầu Mù u được dùng riêng hoặc phối hợp với các dược liệu khác định calophyllolid, 4-hydroxyxanthon trong các thuốc từ dược trong các chế phẩm được sử dụng rộng rãi để trị bỏng, viêm loét da, liệu Mù u nhằm nâng cấp tiêu chuẩn cơ sở. làm mau lành các vết thương…Đề tài: “Nghiên cứu xác định hợp - Khảo sát tác dụng sinh học của hợp chất N3 (hợp chất tự nhiên chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u để ứng dụng trong kiểm mới): kháng khuẩn, kháng virus, chống ung thư... nghiệm” được thực hiện với các mục tiêu nghiên cứu sau: - Tiếp tục nghiên cứu độ ổn định của chất chuẩn đối chiếu - Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u calophyllolid nhằm cải tiến qui trình chiết xuất, phân lập, tinh mọc ở Việt Nam bằng một số kỹ thuật sắc ký và phổ nghiệm để chọn chế đã xây dựng. chất điểm chỉ dùng trong kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm từ - Bổ sung chất chuẩn đối chiếu calophyllolid vào Dược điển Việt dược liệu Mù u. Nam xuất bản lần thứ 5 và nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược - Nghiên cứu thiết lập 01 chất chuẩn đối chiếu để định tính và 01 liệu có hoạt chất tương ứng như dầu Mù u thành tiêu chuẩn quốc dùng cho định lượng trong số các hợp chất phenol phân lập được. gia. - Ứng dụng chất đối chiếu đã thiết lập để kiểm nghiệm nguyên liệu và chế phẩm từ dược liệu Mù u. 2. Tính cấp thiết của đề tài Tiêu chuẩn cơ sở của dầu Mù u cũng như các thuốc từ Mù u tuy đã có nhưng chưa đáp ứng với các nguyên tắc, tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất thuốc đối với cơ sở sản xuất thuốc từ dược liệu của tổ chức Y tế thế giới (GMP-WHO) mà Bộ Y tế đã đưa ra lộ trình áp dụng kể từ ngày 01/01/2014 vì không xác định thành phần hoạt chất hoặc chất
điểm chỉ do thiếu chất đối chiếu và phương pháp phân tích, kiểm tiêu: tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ nghiệm tin cậy. Các dược điển: Hoa kỳ 2012, Anh 2013, châu Âu chính xác, độ đúng thực hiện tại Đại học Quốc gia Singapore (NUS). 7.0, Nhật 2006, Quốc tế 4, Trung quốc 2010 đều chưa thấy có chuyên Điều kiện sắc ký: “Máy sắc ký khí GC-2010 ghép đầu dò phổ khối luận về các bộ phận dùng cũng như thuốc từ dược liệu Mù u. Tiêu GCMS-QP 2010 Shimadzu; bộ chích mẫu tự động AOC-20i; phần chuẩn quốc gia của dầu Mù u theo dược điển Việt Nam 4 chưa có chỉ mềm xử lý dữ kiện LabSolutions GCMSSolution phiên bản 2.5. Cột: tiêu định tính, định lượng chất điểm chỉ. DB-5MS 25 m x 0,22 mm ID, df = 5 µm. Chương trình nhiệt độ: 80 o Việc nghiên cứu xác định các hợp chất phenol và ứng dụng trong C-300 oC/9 phút (40 oC/phút); nhiệt độ buồng tiêm mẫu: 250 oC, kiểm nghiệm này cũng nhằm mở ra triển vọng khai thác, tận thu bằng không chia dòng; nhiệt độ đầu dò phổ khối: nguồn ion: 250 oC; giao cách xác định giá trị của nhựa cũng như vỏ quả là những phần được diện: 200 oC; ion hóa bằng bắn phá điện tử; tốc độ dòng khí mang: xem là dư phẩm trong quá trình sản xuất dầu Mù u dược dụng. 1,43 ml/phút; khoảng phổ: 50-450 amu. Kiểu thu dữ liệu: SCAN và 3. Những đóng góp mới của luận án SIM (ion đích: m/z 401; ion tham chiếu: m/z 83,55). Thể tích tiêm Về mặt hóa học: Lần đầu tiên công bố việc phân lập được các hợp mẫu 1 µl”. Hàm lượng calophyllolid (kl/kl) trong cao methanol chiết chất phenol gồm có: từ nhựa Mù u là 0,67 ± 0,01% (g/100 g). Từ nhựa: hợp chất N1 (1,5-dihydroxyxanthon C13H8O4), N2 (4- Từ phương pháp GC-MS đã thiết lập, tiếp tục xây dựng và thẩm định hydroxyxanthon C13H8O3) thuộc nhóm xanthonoid và hợp chất N3: phương pháp GC-MS để xác định calophyllolid trong vỏ quả Mù u. inocalophyllin C (tên đề nghị) C37H48O6 là một hợp chất tự nhiên Chuẩn bị mẫu thử bằng cách chiết lỏng dưới áp suất (PLE). hoàn toàn mới (Xác định nhờ phổ MS, NMR và X-ray). Điều kiện sắc ký chỉ thay đổi : Chương trình nhiệt độ: 80 oC-300 o Từ vỏ quả: hợp chất V1 (calophyllolid C26H24O5) thuộc nhóm C/12 phút (40 oC/phút). Hàm lượng calophyllolid (kl/kl) trong vỏ neoflavononid. quả Mù u là 0,0255 ± 0,0005% (g/100 g). Về mặt thiết lập chất đối chiếu: Lần đầu tiên công bố nghiên cứu Phương pháp HPLC-DAD thiết lập 2 chất đối chiếu: 4-hydroxyxanthon dùng cho định tính; Đã xây dựng phương pháp HPLC-DAD pha đảo và thẩm định theo calophyllolid dùng cho định lượng . ICH với các chỉ tiêu: tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, tính Về mặt kiểm nghiệm thuốc: Lần đầu tiên công bố các phương pháp tuyến tính, độ chính xác, độ đúng thực hiện tại Viện Kiểm nghiệm GC-MS và RP-HPLC-DAD xác định calophyllolid (từ nhựa Mù u, thuốc thành phố Hồ Chí Minh để xác định calophyllolid trong dung vỏ quả Mù u và chế phẩm chứa dầu Mù u). dịch thuốc từ dược liệu có dầu Mù u với các điều kiện thực nghiệm là: “Máy HPLC Shimadzu: bộ kiểm tra hệ thống CBM-20Alite; bơm LC-20AD; bộ chích mẫu tự động SIL-20AC, buồng cột CTO-20AC;
- Trong vỏ quả Mù u: 4. Bố cục của luận án  Từ 4 kg vỏ quả Mù u, đã chiết xuất bằng EtOAc thu được 20 g cao, Luận án gồm: 113 trang, mở đầu 3 trang, tổng quan 22 trang, đối từ đó phân lập được 26,0 mg hợp chất V 1 xác định là calophyllolid tượng và phương pháp nghiên cứu 15 trang, kết quả nghiên cứu 55 (C26 H24O5). trang, bàn luận 14 trang, kết luận và kiến nghị 4 trang. Luận án có 32 2. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu bảng, 23 hình, 11 sơ đồ, 3 đồ thị, 123 tài liệu tham khảo (12 tiếng Đã xây dựng được bộ dữ liệu nhận dạng chất bao gồm: phổ UV-VIS, Việt, 110 tiếng Anh và 1 tiếng Pháp), và 16 phụ lục. phổ IR, phổ MS, phổ NMR, điểm chảy của các chất calophyllolid và NỘI DUNG LUẬN ÁN 4-hydroxyxanthon. Chương 1: TỔNG QUAN Đã xây dựng và thẩm định theo ICH quy trình xác định tạp chất hữu Trình bày những vấn đề sau: cơ đi kèm với calophyllolid trong quá trình chiết xuất bằng kỹ thuật 1.1. Sơ lược về cây Mù u. HPLC-DAD với các chỉ tiêu: tính phù hợp của hệ thống, tính đặc 1.2. Sơ lược về hợp chất phenol. hiệu, tính tuyến tính, độ chính xác, giới hạn phát hiện. 1.3. Tình hình nghiên cứu về hợp chất phenol từ quả Mù u. Lần đầu tiên đã thiết lập chất đối chiếu calophyllolid (chuẩn chính) 1.4. Một số phương pháp phân tích hợp chất phenol từ Mù u. loại dùng cho định lượng theo hướng dẫn của WHO, ISO với tiêu 1.5. Một số khái niệm về chất chuẩn đối chiếu. chuẩn chất lượng bao gồm các chỉ tiêu: cảm quan; định tính: UV-Vis, Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU IR, MS, NMR; điểm chảy; độ tinh khiết: tạp chất hữu cơ, tạp chất vô 2.1. Đối tượng nghiên cứu cơ, tạp chất bay hơi; định lượng. Số lượng chất đối chiếu thiết lập Các hợp chất phenol. được tổng cộng 100 lọ 10 mg với hàm lượng 95,27% . 2.2. Nguyên vật liệu Ngoài ra, còn thiết lập chất đối chiếu 4-hydroxyxanthon dùng cho  Nhựa tách loại khi tinh chế dầu thô ép từ hạt Mù u: chất lỏng có định tính với số lượng 9 lọ 5 m g với hàm lượng 93,91%. màu xanh lá đậm, mùi đặc trưng do Khoa Dược-Đại học Y Dược TP. 3. Ứng dụng chất đối chiếu thiết lập để kiểm nghiệm HCM cung cấp năm 2008. calophyllolid từ nhựa, vỏ quả Mù u và chế phẩm từ Mù u  Vỏ quả Mù u do công ty Natural Pro thu tại tỉnh Bến tre cung Phương pháp GC-MS cấp năm 2008. Đã xây dựng một phương pháp nhanh, phù hợp, chính xác và đặc  Chế phẩm dầu Mù u Inopilo của công ty TNHH thương mại hiệu để xác định calophyllolid từ nhựa Mù u bằng kỹ thuật sắc ký khí & sản xuất dược phẩm Bình Minh. mao quản ghép khối phổ (GC-MS). Thẩm định theo ICH với các chỉ
2.3. Phương pháp nghiên cứu KẾT LUẬN 2.3.1. Nguyên liệu - Dung môi, hóa chất - Trang thiết bị Đề tài “Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù - Dung môi, hóa chất sử dụng loại kỹ thuật dùng cho chiết xuất, loại u để ứng dụng trong kiểm nghiệm” đã hoàn thành các nội dung phân tích và sắc ký (Merck và JT Baker) dùng cho các kỹ thuật TLC, nghiên cứu để đạt được mục tiêu đề ra và đưa ra những kết luận sau: UV-Vis, IR, GC-MS, LC-MS, ICP-MS, deteuri hóa (Merck) dùng 1. Xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u cho kỹ thuật NMR,…. Bằng một số kỹ thuật sắc ký như: sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng chân - Các chủng vi khuẩn đối chiếu do ATCC cung cấp; đĩa kháng sinh không, sắc ký lỏng (phân tích và điều chế), sắc ký khí và một số kỹ chuẩn của hãng Oxoid Ltd (Anh). thuật phổ nghiệm như: phổ UV-Vis, phổ IR, phổ khối lượng, phổ - Thiết bị chiết xuất và phân tích đặt tại Khoa Dược -Đại học Y Dược NMR một và hai chiều, phổ nhiễu xạ tia X, đã chiết xuất, phân lập, TP.HCM, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam, Viện Kiểm tinh chế và xác định cấu trúc một số hợp chất phenol như sau: nghiệm thuốc TP.HCM, Khoa Hóa-Đại học Khoa học Tự nhiên, - Trong nhựa Mù u: Khoa Hóa và Khoa Dược-Đại học Quốc gia Singapore.  Từ 3 kg nhựa Mù u, đã chiết xuất bằng n -hexan thu được 40 g cao, 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu từ đó phân lập được 8,1 mg hợp chất N 1 xác định là 1,5- 2.3.2.1. Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả dihydroxyxanthon (C13H8O4) và 105,0 mg hợp chất N 2 xác định là 4- Chiết xuất hợp chất phenol từ nhựa Mù u hydroxyxanthon (C13H8O3). Phương pháp dùng dung môi kém phân cực có thay đổi pH  Từ 4 kg nhựa Mù u, đã chiết xuất bằng hỗn hợp MeOH -nước (9:1) Kiềm hóa bằng các dung dịch kiềm khác nhau như natri carbonat thu được 50 g cao, từ đó phân lập được 135,0 mg hợp chất N 3 dề (TT), natri hydroxyd (TT), amoniac (TT) đến các pH 7-8 và 8-9. Acid nghị tên inocalophyllin C (C37H48O6) và 98,0 mg hợp chất N 4 xác hóa dịch kiềm đến pH 3-4 rồi chiết bằng dung môi kém phân cực. định là calophyllolid (C26 H24O5). Phương pháp dùng dung môi phân cực không thay đổi pH Hợp chất N 3 với tên khoa học: ethyl 3-((2R,3R)-4-hydroxy-2,3- Khảo sát tỉ lệ methanol/nước phù hợp nhất và phương pháp loại dầu. dimethyl-6-(5-methyl-2-(prop-1-en-2-yl)hex-4-enyl)-6-(3- Khảo sát quy trình loại dầu dựa vào độ phân cực: methylbut-2-enyl)-5,7-dioxo-3,5,6,7-tetrahydro-2H-chromen-8- - Chiết lỏng - lỏng dịch chiết MeOH/nước với ether dầu hỏa. yl)-3-phenylpropanoat là một hợp chất tự nhiên mới, chưa từng - Làm giảm nồng độ dung môi có trong dịch chiết MeOH/nước. công bố trong các nguồn dữ liệu tra cứu tại thư việ n Đại học Quốc Chiết xuất hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u gia Singapore (NUS): ScienceDirect, Scopus, PubMed, SciFinder Phương pháp chiết lỏng dưới áp suất (PLE) (Chemical Abstracts), Patent Databases.
GC-MS dùng cột thủy tinh với pha tĩnh OV 1 hoặc OV 17 3% tẩm Dung môi chiết là n-hexan (TT) và methanol (TT); áp suất 1500 psi; trên Gas Chrom Q. Tuy nhiên, tác giả đã không mô tả điều kiện sắc nhiệt độ 120 oC; thời gian chiết: 15 phút; chu kỳ chiết: 1; thể tích rửa: ký cũng như nguồn gốc chất đối chiếu calophyllolid đã sử dụng. 60%; thời gian làm sạch hệ thống bằng nitrogen: 90 giây. Phương pháp sắc ký khí mao quản ghép khối phổ (GC-MS) đề xuất Phương pháp chiết soxhlet của chúng tôi tuy là phương pháp ngoại chuẩn do không tìm được nội Dung môi chiết là methanol (TT); thời gian chiết: 8 giờ. chuẩn đồng vị hoặc chất có cấu trúc tương tự với calophyllolid Phương pháp ngấm kiệt nhưng độ tin cậy chấp nhận được do sử dụng bộ tiêm mẫu tự động và Vỏ quả Mù u xay thành bột, được ngấm kiệt ngược dòng với cồn quy trình chuẩn bị mẫu không phức tạp. Kết quả là lần đầu tiên đã 96% thu được dịch chiết cồn. Cô cách thủy dịch chiết này đến cắn sệt công bố trên tạp chí quốc tế phương pháp GC-MS xác định nhanh như sirô. Thêm nước vào cắn này với tỷ lệ thích hợp rồi chiết với calophyllolid. Phương pháp này sau đó làm cơ sở để xác định ethyl acetat. Cô dịch chiết ethyl acetat dưới áp suất giảm ở 40 oC. calophyllolid có trong vỏ quả Mù u. Thử tác dụng kháng khuẩn 4.4.2. Phương pháp HPLC-DAD Dùng phương pháp khuếch tán trên thạch, tiêu chuẩn của CLSI theo Khi xác định calophyllolid trong chế phẩm có chứa dầu Mù u, do khuyến cáo của FDA. Kháng sinh chuẩn và vi khuẩn thử nghiệm: mẫu thử sau khi xử lý có nước nên không áp dụng phương pháp GC- carbenicilin 100 µg cho Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027; MS. Nghiên cứu của Frederic và cộng sự năm 2008 đã xác định các methicilin 5 µg cho Staphylococcus aureus ATCC 6538 P; coumarin kể cả calophyllolid trong cao lá Mù u bằng kỹ thuật HPLC- streptomycin 10 µg đối với Mycobacterium smegmatis ATCC 14468. o DAD pha thuận dùng cột silica lỗ sốp 120 A , hạt 5 µm, kích thước Phân lập 250 mm x 4,6 mm. Chương trình dung môi: i-propanol-i-octan từ 1- Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng chân không (với silica gel 0,040- 20% (tt/tt) trong 25 phút, từ 20/80 (tt/tt) trong 25 phút, sau đó cân 0,063 mm) để tách các hợp chất phenol tinh khiết. bằng trong 15 phút. Tuy nhiên, sắc ký đồ cho thấy calophyllolid kém Tinh chế phân giải và phương pháp chưa được thẩm định. Chưa thấy công bố Sử dụng phương pháp kết ti nh lại trong dung môi thích hợp và phương pháp HPLC-DAD pha đảo xác định calophyllolid với độ tin phương pháp sắc ký lỏng điều chế. cậy cao do sử dụng chất đối chiếu đã thiết lập. Với nghiên cứu của Xác định cấu trúc hóa học chúng tôi, các chỉ tiêu thẩm định đều đạt yêu cầu. Xác định cấu trúc bằng cách đánh giá phối hợp kết quả các phổ: UV- Vis, IR, MS (EI-MS, HRESI-TOFMS), NMR (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC), X-ray.
2.3.2.2. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu thế và danh pháp. Ngoài ra, còn tìm thấy hợp chất acid Chiết xuất, phân lập, tinh chế brasiliensophyllic C từ Calophyllum brasiliense Cambess Clusiaceae Chất đối chiếu phân lập từ các cao hợp chất phenol toàn phần chiết từ có cấu tạo tương tự N 3 ngoại trừ nhóm chức acid thay vì ester và nhựa Mù u. Sử dụng các kỹ thuật sắc ký lỏng chân không, kết tinh mạch nhánh có thêm một carbon. lại, sắc ký lỏng điều chế để đạt độ tinh khiết cao nhất. 4.3. Thiết lập chất chuẩn đối chiếu Định tính Chưa thấy có nhà sản xuất hay phân phối chất chuẩn đối chiếu như Đối chiếu các phổ UV-Vis; phổ IR; phổ MS; phổ NMR của các chất ChromaDex, Sigma Aldrich, USP, Cerilliant hoặc hai Viện kiểm nghiên cứu với các phổ từ tài liệu tham khảo . nghiệm thuốc trung ương và TP.HCM cung cấp calophyllolid và 4- Đánh giá chất điều chế làm chất đối chiếu hydroxyxanthon. Hiện chưa có các quy định về độ tinh khiết của chất Điểm chảy: phương pháp 1 theo DĐVN IV. đối chiếu là hợp chất tự nhiên phân lập từ dược liệu. Do Tạp chất vô cơ: phương pháp ICP-MS theo DĐTQ 2010. calophyllolid là chất có các hoạt tính như: ức chế elastas (IC 50 = 8,4 Tạp chất bay hơi: phương pháp phân tích nhiệt trọng lượng TGA µM); kháng viêm (LD50 = 2,5 g/kg); độc tính tế bào ( IC50 = 3,5 theo USP. µg/ml), kháng khuẩn và là thành phần chính của nhiều bộ phận dùng Tạp chất hữu cơ: phương pháp HPLC-DAD. Thẩm định phương từ Mù u ở Việt nam và trên thế giới nên đáp ứng với tiêu chuẩn lựa pháp: theo hướng dẫn của ICH ban hành vào tháng 11 năm 2005. chọn làm chất điểm chỉ. Theo tổng kết của FHH (Forum for the Đánh giá đồng nhất lô trong quá trình đóng gói chất đối chiếu Harmonization of Herbal Medicine) năm 2005, Dược điển Hàn quốc Lấy mẫu: Sử dụng cách lấy mẫu ngẫu nhiên theo phần mềm Excel, 8 quy định độ tinh khiết phải trên 95%. Đây là cơ sở để xây dựng số lọ được lấy để kiểm tra là g = N +1 lọ, N là số lọ đóng được. mức chất lượng cho chỉ tiêu định lượng calophyllolid làm chất chuẩn Xác định độ tinh khiết: Áp dụng phương pháp xác định tạp chất hữu đối chiếu. cơ HPLC-DAD đã xây dựng và thẩm định theo ICH. 4.4. Các phương pháp ghép nối sắc ký-phổ nghiệm ứng dụng xác Đánh giá độ đồng nhất giữa các lọ: Đánh giá bằng kỹ thuật thống kê định calophyllolid trong nhựa, vỏ quả và chế phẩm từ Mù u ANOVA một yếu tố. Các lọ là đồng nhất khi Ftn < Ftc (P = 0,05). 4.4.1. Phương pháp GC-MS Đánh giá chất chuẩn đối chiếu thông qua liên phòng thí nghiệm Khi thử hòa tan cao methanol trong hỗn hợp MeCN -nước với các tỷ Tiến hành xác định độ tinh khiết tại ba phòng thí nghiệm độc lập đạt lệ khác nhau thấy có hiện tượng mẫu bị đục làm ảnh hưởng đến quá tiêu chuẩn GLP hoặc ISO/IEC17025. trình phân tách và phát hiện nếu sử dụng phương pháp LC -MS hoặc Xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo HPLC-DAD. Năm 1972, Games DE đã công bố bài báo về định danh các hợp chất 4-phenyl coumarin trong Calophyllum inophyllum bằng
nhựa và vỏ quả Mù u . Thật vậy, năm 2003, Shen và cộng sự đã xác Xác định giá trị ấn định và độ không đảm bảo đo theo các phương định được từ hạt Calophyllum inophyllum ở Đài loan: 4 dẫn suất pháp thống kê dùng cho chương trình thử nghiệm thành thạo so sánh pyranocoumarin và calophyllolid. Sau đó vào năm 2004, Yimdjo và lien phòng thí nghiệm ISO 13528. cộng sự công bố phân lập được calophyllolid và các coumarin khác Định lượng như calaustralin, inophyllum C, E từ hạt Mù u ở Cameroon. Gần đây Hàm lượng % tính trên nguyên trạng: 100 – (% tạp chất hữu cơ) – (% nhất là công trình năm 2009 của Leu và cộng sự cũng chưa thấy phân tạp chất bay hơi) – (% tạp chất vô cơ) (theo hướng dẫn của WHO). lập được 1,5-dihydroxyxanthon và 4-hydroxyxanthon trong nhựa Mù 2.3.2.3. Ứng dụng chất đối chiếu đã thiết lập để kiểm nghiệm u tách loại khi tinh chế dầu ép từ hạt Mù u mọc ở Polynesia thuộc nguyên liệu (nhựa, vỏ quả) và chế phẩm từ Mù u. Pháp.. Phương pháp GC-MS Kết quả xác định hàm lượng calophyllolid từ cao nhựa tách loại chiết Khảo sát chọn nhiệt độ buồng cột: thay đổi nhiệt độ đầu và tốc độ với MeOH bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng: 0,68 ± 0,01 (g/100g) gia nhiệt, chọn điều kiện thời gian lưu ngắn và pic phân giải tốt. và từ vỏ quả chiết với MeOH bằng phương pháp PLE: 0,0255 ± Xác định các mảnh ion đặc trưng: xác định các mảnh ion phù hợp 0,0005 (g/100g) so với hàm lượng calophyllolid 0,47 ± 0,01 (g/100g) với cấu trúc hợp chất. trong chế phẩm Dầu Mù u Inopilo (chỉ định trị bỏng, u nhọt, viêm Thẩm định quy trình loét da, làm mau lành vết thương) cùng với tác dụng kháng S. aureus - Tính phù hợp của hệ thống và M. smegmatis đã sơ bộ cho thấy nhựa loại bỏ khi tinh chế dầu và Yêu cầu: hệ số đối xứng của pic  2; hệ số tương quan (r) của đường vỏ quả Mù u là đối tượng tiềm năng trong sử dụng làm thuốc. chuẩn > 0,995; độ lệch cường độ tương đối các mảnh ion đặc trưng 4.2. Kết quả xác định hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u (%) của pic chất đối chiếu và pic mẫu thử ± 20%. Từ nhựa 4 kg nhựa Mù u, đã chiết xuất được 50 g cao methanol và - Tính đặc hiệu: Kiểm tra độ tinh khiết của pic trong mẫu thử bằng phân lập được 135 mg hợp chất N 3 bằng phương pháp sắc ký lỏng phần mềm AMDIS 2.69 (NIST). chân không. Đây là một hợp chất tự nhiên hoàn toàn mới. Tham khảo - Tính tuyến tính: r > 0,995. tài liệu về chi Calophyllum cũng như các hợp chất đã công bố từ các - Độ chính xác: nguồn: ScienceDirect, Scopus, PubMed, SciFinder (Chemical  Độ lặp lại: %RSD ≤ 3,0 Abstracts), Patent Databases tại thư viện Đại học Quốc gia Singapore  Độ chính xác trung gian: Kết quả giữa các ngày khác (NUS) cho thấy: chỉ có hợp chất inocalophyllin A dimethylat có phân biệt không có ý nghĩa thống kê: test F (P = 0,05) tử lượng tương đương nhưng khác biệt về cấu tạo bao gồm: loại - Độ đúng: tỷ lệ phục hồi 98% - 102%; %RSD ≤ 2,0. ester, vị trí dioxo, vị trí C-4, 1-3-diketon enol, vị trí C-5, vị trí nhóm
Phương pháp HPLC-DAD 3.3.2.2. Khảo sát chọn quy trình chuẩn bị mẫu thử Khảo sát chọn chương tr ình dung môi: thay đổi tỷ lệ pha động và Chọn nhiệt độ làm ấm: 60 oC; hàm lượng methanol (TT): 90%; thời pH, chọn điều kiện để pic đạt độ phân giải tối thiểu 1,5. gian làm ấm: 10 phút; thời gian siêu âm: 15 phút. Khảo sát chọn quy trình chuẩn bị mẫu thử: thiết kế thí nghiệm để 3.3.2.3. Thẩm định quy trình chọn điều kiện chuẩn bị mẫu dựa vào nhiệt độ làm ấm mẫu, hàm Thẩm định quy trình theo các chỉ tiêu: lượng dung môi, thời gian làm ấ m và thời gian siêu âm. - Tính phù hợp của hệ thống Thẩm định quy trình Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống cho thấy sau 6 lần sắc ký - Tính phù hợp của hệ thống các thông số đều nằm trong giới hạn cho phép. Yêu cầu: hệ số đối xứng của pic 0,8  As  1,5; %RSD diện tích pic - Tính đặc hiệu: quy trình có tính đặc hiệu.  2,0; số đĩa lý thuyết ≥ 2000. - Tính tuyến tính: kết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy có sự - Tính đặc hiệu: Sắc ký đồ pha động và dung môi pha mẫu không tương quan tuyến tính giữa nồng độ calophyllolid đối chiếu cũng như xuất hiện tín hiệu trùng với thời gian lưu của chất cần phân tích trong calophyllolid trong mẫu và diện tích pic tương ứng với hệ số tương mẫu thử và mẫu đối chiếu. Độ tinh khiết của pic chất cần phân tích quan r > 0,995. trong sắc ký đồ mẫu thử: > 0,99. Độ phân giải giữa pic chất cần phân - Độ chính xác và độ đúng và các pic liền kề trong sắc ký đồ mẫu thử: ≥ 1,5. Kết quả thống kê cho thấy các quy trình có tỷ lệ hồi phục nằm trong - Tính tuyến tính: r > 0,995. giới hạn cho phép của tỷ lệ hồi phục lý thuyết 98% - 102%; %RSD: - Độ chính xác: < 2,0 và %RSD < 2 đối với độ lặp lại; %RSD < 3 đối với độ chính  Độ lặp lại: %RSD ≤ 3,0 xác trung gian.  Độ chính xác trung gian: Kết quả giữa các ngày khác CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN biệt không có ý nghĩa thống kê: test F (P = 0,05) 4.1. Xác định hợp chất phenol và thử tính kháng khuẩn các cao - Độ đúng: tỷ lệ phục hồi 98% - 102%; %RSD ≤ 2,0. chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Nghiên cứu của chúng tôi đã dùng phương pháp chiết xuất từ nhựa 3.1. Nghiên cứu xác định hợp chất phenol từ nhựa, vỏ quả Mù u Mù u Việt nam bằng n-hexan có thay đổi pH để phân lập được các 3.1.1. Chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u hợp chất xanthon kể trên. Đặc biệt, bằng phương pháp chiết với 3.1.1.1. Phương pháp dùng dung môi kém phân cực, thay đổi pH MeOH, đã phân lập được một hợp chất tự nhiên mới chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Chưa thấy có tác giả nào công bố xác định 1,5-dihydroxyxanthon và 4-hydroxyxanthon từ
3.3.1.2. Thẩm định quy trình Thẩm định quy trình theo các chỉ tiêu: - Tính phù hợp của hệ thống Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống cho thấy sau 6 lần sắc ký các thông số đều nằm trong giới hạn cho phép. - Tính đặc hiệu: các quy trình có tính đặc hiệu. - Tính tuyến tính: kết quả khảo sát tính tuyến tính cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ calophyllolid đối chiếu cũng như calophyllolid trong mẫu và diện tích pic tương ứng với hệ số tương Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u bằng n -hexan quan r > 0,995. - Độ chính xác và độ đúng 3.1.1.2. Phương pháp dùng dung môi phân cực không thay đổi pH Kết quả thống kê cho thấy các quy trình có tỷ lệ hồi phục nằm trong giới hạn cho phép của tỷ lệ hồi phục lý thuyết 98% - 102%; %RSD: < 2,0 và %RSD < 2 đối với độ lặp lại; %RSD < 3 đối với độ chính xác trung gian. 3.3.2. Xác định calophyllolid trong chế phẩm có dầu Mù u 3.3.2.1. Khảo sát chọn chương trình dung môi Cột Zorbax 250 mm × 4,6 mm, 5 μm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thể tích tiêm mẫu: 10 μl. Nhiệt độ cột: 40 oC. Bước sóng phát hiện 270 nm. Pha động: acetonitril-dung dịch acid acetic 2% với chương trình dung môi như sau: Sơ đồ chiết xuất các hợp chất phenol từ nhựa Mù u bằng MeOH-nước Thời gian (phút) Acetonitril (%) Dung dịch acid acetic 2% (%) 3.1.2. Chiết xuất các hợp chất phenol từ vỏ quả Mù u 0 20 80 3.1.2.1. Phương pháp chiết lỏng dưới áp suất (PLE) 30 80 20 Từ 5 g bột vỏ quả bằng n-hexan (TT) và methanol (TT) đã chiết được 35 20 80 lần lượt 0,05 g chất chiết sánh như dầu, màu vàng, hiệu suất 0,96% 40 20 80 và 0,5 g chất chiết dầu nhầy, màu nâu đậm , hiệu suất 9,98%.
1 3.1.2.2. Phương pháp chiết soxhlet Phổ NMR H-NMR (CD3Cl3, 300 MHz): 7,26 m x 2; 7,40 m x 2; 0,97 s x 2; 1,9 d (6,3); 2,01 s; 5,48 d (9,9); 6,02 s; 6,45 d (9,6), 6,57 q (6,0). Từ 2 g bột vỏ quả bằng n-hexan (TT) và methanol (TT) đã chiết được 13 C-NMR (CD3Cl3, 75 MHz): 10,7; 15,2; 26,8 x 2; 63,0; 77,4; 105,6; lần lượt 0, 02 g chất chiết rắn, màu vàng (hiệu suất 0,95%) và 0,08 g 110,7; 114,2; 115,0; 115,9; 127,2 x 2; 127,5 x 2; 127,7; 129,0; 139,5; chất chiết sánh như dầu, màu vàng sậm (hiệu suất 4,05%). 139,9; 144,2; 151,7; 152,0; 155,0; 155,8; 159,4; 194,3. 3.1.2.3. Phương pháp ngấm kiệt Điểm chảy 154-156 oC. Từ 4 kg bột vỏ quả bằng ethyl acetat đã chiết được 20 g cao ethyl Tạp chất hữu cơ Không ít hơn 96,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng. acetat, hiệu suất 0,5%. Cao này được dùng cho phân lập kế tiếp. Tạp chất bay hơi Không quá 1,0 %. 3.1.3. Thử tác dụng kháng khuẩn các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Tạp chất vô cơ Không quá 20 ppm. Định lượng Không ít hơn 95,0%. Bảng 3.2. Kết quả thử tác dụng kháng khuẩn của cao nhựa và vỏ quả 3.3. Ứng dụng chất đối chiếu đã thiết lập để kiểm nghiệm nguyên Đường kính vòng kháng khuẩn liệu (nhựa, vỏ quả Mù u) và chế phẩm từ dầu Mù u. mẫu thử (100 g/đĩa)/mẫu chuẩn % (n =2) 3.3.1. Xác định calophyllolid trong nhựa và vỏ quả Mù u Chủng vi sinh vật thử nghiệm S. aureus Ps. aeruginosa M. smegmatis 3.3.1.1. Khảo sát nhiệt độ cột và xác định mảnh ion đặc trưng ATCC 6538 P ATCC 9027 ATCC 14468 Bảng 3.16. Khảo sát chương trình nhiệt độ cột Đĩa kháng sinh chuẩn Methicillin 5 µg Carbenicillin 100 µg Streptomycin 10 µg Bộ Cao Phương Nhiệt độ buồng cột Tốc độ gia nhiệt Thời gian lưu Mảnh ion đặc trưng (m/z) phận pháp chiết o ( C/phút) (phút) n-Hexan Dung môi 41,0 Âm tính 36,0 15 21,98 ± 0,01 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, Nhựa Methanol Dung môi 45,3 - 48,4 [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 o Methanol PLE 58,1 - 47,0 60-300 C/9 phút 20 18,5 ± 0,006 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, Vỏ quả EtOAc Ngấm kiệt 58,0 - 47,0 [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 n-Hexan PLE 53,8 - 37,5 25 16,43 ± 0,01 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, Methanol Soxhlet 50,0 - 45,5 [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 Các cao chiết từ nhựa và vỏ quả Mù u có tác dụng kháng khuẩn trên 30 15,06 ± 0,012 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, S. aureus và M. smegmatis, không có tác dụng trên Ps. aeruginosa. [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 40 13,2 ± 0,01 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, 3.1.4. Phân lập các hợp chất phenol từ nhựa và vỏ quả Mù u [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 3.1.4.1. Phân lập các hợp chất phenol từ nhựa o 80-300 C/9 phút 40 12,83 ± 0,006 [M]+ 416, [M-CH3]+ 401, Từ 40 g cao n -hexan đã phân lập được: hợp chất N1 = 8,1 mg; hợp [C5H7O]+ 83, [C4H7]+ 55 chất N2 = 105,0 mg. Kết quả: Chọn chương trình nhiệt độ: 80 -300 oC/9 phút, tăng 40 oC/phút.
3.2. Nghiên cứu thiết lập chất chuẩn đối chiếu (ĐC) Chiết xuất, phân lập và tinh chế để thu được hợp chất đủ tinh khiết làm chất chuẩn đối chiếu. Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng với mức chất lượng, chỉ tiêu , phương pháp thử theo hướng dẫn của WHO và ISO. Bảng 3.3. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của 4-hydroxyxanthon (ĐC) Sơ đồ phân lập N1, N2 bằng sắc ký lỏng chân không Chỉ tiêu Mức chất lượng Từ 50 g cao methanol đã phân lập được: hợp chất N3 = 135,0 mg; Tính chất Tinh thể hình kim, không màu , dễ tan trong aceton, methanol hợp chất N4 = 98,0 mg. Định tính Phổ UV -Vis Phải có các cực đại hấp thu ở 231, 248, 278 và 348 nm. Phổ IR Phải có các đỉnh có số sóng: 3197, 1652, 1589, 1292, 754, 729 cm -1. Phổ khối lượng Phải có các pic có m/z 212 [M]+ (pic căn bản), 184, 155, 128, 102, 63 1 Phổ NMR H-NMR (CD3OD, 500 MHz): 7,73 dd (8,0; 2,0); 7,25 t (8,0); và 7,31 dd (8,0; 1,5); 7,68 dd (8,5; 0,5); 7,83 dt (8,5; 1,5); 7,44 dt (7,5; 1,0); và 8,26 dd (8,0; 2,0) 13 C-NMR (CD3OD, 125 MHz): 179,2; 157,4; 147,9; 147,1; 136,4; 127,3; 125,3; 125,1; 123,6; 122,5; 121,5; 119,4; 117,1 Điểm chảy 228-230 oC. Sơ đồ phân lập N 3, N4 bằng sắc ký lỏng chân không Tạp chất hữu cơ Không ít hơn 94,0% tính theo chế phẩm nguyên trạng. Tạp chất bay hơi Không quá 1,0 %. 3.1.4.2. Phân lập các hợp chất phenol từ vỏ quả Định lượng Không ít hơn 90,0%. Từ 20 g cao EtOAc đã phân lập được: hợp chất V1 = 26,0 mg. Bảng 3.4. Tóm tắt tiêu chuẩn chất lượng của calophyllolid (ĐC) Chỉ tiêu Mức chất lượng Tính chất Tinh thể không màu, dễ tan trong aceton, benzen, ether ethylic, alcol Định tính Phổ UV-Vis Phải có các cực đại hấp thu ở 235, 270 và 295 nm. Phổ IR Phải có các đỉnh có số sóng: 1726, 1662, 1579, 1133, 759, 702 cm -1. Phổ khối lượng Phải có các pic có m/z 416 [M]+, 401 (pic căn bản), 83, 55 Sơ đồ phân lập V 1 bằng sắ c ký lỏng chân không
13 3.1.5. Xác định cấu trúc các hợp chất phenol phân lập được C-NMR (CDCl3, 125 MHz): 12,4; 14,1; 17,8; 18,1; 19,3; 25,5; 25,6; 35,2; 35,6; Các hằng số vật lý và dữ liệu phổ của N1, N2 tóm tắt trong bảng sau: (C, ppm) 36,8; 40,9; 41,7; 44,6; 60,1; 77,2; 109,7; 113,7; 115,2; 115,6; 117,1; N1 (1,5-dihydroxyxanthon) N2 (4-hydroxyxanthon) 122,4; 125,6; 127,7; 128,1; 132,2; 143,6; 147,4; 163,1; 187,3; 187,4; Mô tả Bột màu vàng, vô định hình Tinh thể hình kim, không màu 195,7; 200,3. Điểm chảy 245-247 oC 228-230 oC 4' 5'' 4'' 5' 3' 3" UV (MeOH) 248, 315, 370 nm, 235 nm (sh) 231, 248, 348 nm 2' 6' 7''' 6''' IR (KBr, cm-1) 3421, 1647, 1577, 1279, 792, 724 3197, 1652, 1589, 1292, 754, 729 13 1' O 1" 2" 12 1''' 3''' 5''' 9 EI-MS m/z 228 (100), 212 (1,37), 200 (11,12), 212 (100), 184 (22,76), 155 (7,28), 10 7 6 2''' 4''' 8 O (rel. int.,%) 171 (11,46), 115 (23,3), 92 (13,75) 128 (21,91), 102 (9,05), 63 (11,19) 11 8a 5 8''' 1 O O 4a O H-NMR (CD3OD và DMSO-d6, 500 MHz): (CD3OD, 500 MHz): 7,73 dd (8,0; 2 4 9''' 10''' 3 (H, ppm; J, Hz) 7,72 t (8,0); 6,82 dd (8,0; 1,0); 7,12 2,0); 7,25 t (8,0); 7,31 dd (8,0; 1,5); OH dd (7,5; 0,5); 7,36 dd (7,5; 2,0); 7,30 7,68 dd (8,5; 0,5); 7,83 dt (8,5; 1,5); t (7,5); 7,74 dd (8,0; 1,5) 7,44 dt (7,5; 1,0); 8,26 dd (8,0; 2,0) Công thức cấu tạo của N 3 Cấu trúc của N3 (nhiễu xạ tia X) 13 C-NMR (CD3OD và DMSO-d6, 125 MHz): (CD3OD, 125 MHz): 179,2; 157,4; Các hằng số vật lý và dữ liệu phổ của N4 và V1 tóm tắt trong bảng (C, ppm) 183,8; 162,9; 157,5; 147,7; 147,0; 147,9; 147,1; 136,4; 127,3; 125,3; sau: 138,2; 125,3; 122,6; 122,2; 116,5; 125,1; 123,6; 122,5; 121,5; 119,4; N4 (calophyllolid) V1 (calophyllolid) 111,2; 109,7; 108,4. 117,1 Mô tả Tinh thể hình lăng trụ, không màu Tinh thể hình phiến, không màu o Các hằng số vật lý và dữ liệu phổ của N3 tóm tắt trong bảng sau: Điểm chảy 155 C 155,5 oC N3 (Tên đề nghị: Inocalophyllin C) UV (EtOH) 235, 270, 295, 325 nm (sh) 235, 270, 295, 325 nm (sh) -1 Mô tả Tinh thể hình phiến, không màu IR (KBr, cm ) 1726, 1663, 1580, 1133, 757, 698 1728, 1663, 1580, 1133, 757, 698 o EI-MS m/z 416 (15,42), 401 (100), 83 (5,62), 416 (11,65), 401 (100), 83 (1,94), Điểm chảy 98,2-100,5 C UV (MeOH) 239, 311 nm (rel. int.,%) 55 (30,60) 55 (6,95) -1 1 IR (KBr, cm ) 3440, 2926, 2855, 1732, 1603, 1447, 1376, 1257, 1031 H-NMR (CD3Cl3, 300 MHz): 7,26 m x 2; (CD3Cl3, 500 MHz): 7,19 m x 2; EI-MS m/z 588 (7,45); 573 (1,77); 519 (10,81); 485 (1,58); 465 (2,65); 452 (11,92); (H, ppm; J, Hz) 7,40 m x 2; 0,97 s x 2; 1,9 d (6,3); 7,33 m x 2; 0,90 s x 2; 1,83 d (rel. int.,%) 419 (4,49); 411 (7,77); 397 (100); 379 (1,51); 363 (14,88); 323 (14,06); 2,01 s; 5,48 d (9,9); 6,02 s; 6,45 d (7,0); 1,94 s; 5,40 d (10,0); 5,95 s; 289 (7,51); 267 (9,63); 235 (7,75); 177 (14,47); 135 (37,54); 121 (8,65); (9,6), 6,57 q (6,0) 6,38 d (10,0), 6,49 m 13 105 (32,88); 97 (13,43); 69 (70,31); 55 (37,42); 45 (6,43) C-NMR (CD3Cl3, 75 MHz): 10,7; 15,2; 26,8 (CD3OD, 125 MHz): 10,7; 15,1; HRMS (ESI-TOF) 588,3400 (C, ppm) x 2; 63,0; 77,4; 105,6; 110,7; 114,2; 26,9; 27,8; 62,9; 77,4; 105,6; + 115,0; 115,9; 127,2 x 2; 127,5 x 2; 110,7; 114,3; 115,1; 116,0; 127,3 [M] (tính toán: 588,3401) 1 127,7; 129,0; 139,5; 139,9; 144,2; x 2; 127,5 x 2; 127,8; 129,2; H-NMR (CDCl3, 500 MHz): 16,5 s; 7,37 d (7,5) x 2; 7,22 t (7,5) x 2; 7,11 t (7,5); (H, ppm; J, Hz) 4,36 s; 4,92 m; 4,95 m; 3,21 dd (11,0; 7,0); 3,32 dd (10,5; 7,0); 1,75 s; 151,7; 152,0; 155,0; 155,8; 159,4; 139,6; 140,0; 143,9; 151,8; 152,0; 1,65 s; 1,5 s; 1,48 s; ,25 d (6,0); 1,3 d (6,0); 1,29 t (3,5); 4,1 q (4,5) 194,3. 154,9; 155,9; 159,4; 194,2.