Xác định đột biến gen p53 trong carcinôm tuyến đại trực tràng bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Chia sẻ: Trần Thị Hạnh | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

60
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài trình bày về: Gen p53 là gen ức chế khối u có 11 exon, trong đó exon 2-11 mã hóa protein dài 393 acid amin. Các nghiên cứu trước đây cho rằng ña số đột biến gen p53 thường gặp trong vùng exon 5-8 từ acid amin thứ 126 đến 306 và có liên quan với tiên lượng xấu của bệnh ung thư hại - trực tràng ở giai đoạn sau. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm xác định tỉ lệ và các kiểu đột biến gen p53 trong carcinôm tuyến đại trực tràng trên bệnh nhân Việt Nam.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Xác định đột biến gen p53 trong carcinôm tuyến đại trực tràng bằng kỹ thuật giải trình tự chuỗi DNA

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN P53 TRONG CARCINÔM TUYẾN ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI DNA Hoàng Anh Vũ*, Phùng Ngọc Thùy Linh**, Đỗ Thị Thanh Thủy*, Hứa Thị Ngọc Hà* TÓM TẮT Mục tiêu: Gen p53 là gen ức chế khối u có 11 exon, trong ñó exon 2-11 mã hóa protein dài 393 acid amin. Các nghiên cứu trước ñây cho rằng ña số ñột biến gen p53 thường gặp trong vùng exon 5-8 từ acid amin thứ 126 ñến 306 và có liên quan với tiên lượng xấu của bệnh ung thư ñại - trực tràng ở giai ñoạn sau. Nghiên cứu này ñược thực hiện nhằm xác ñịnh tỉ lệ và các kiểu ñột biến gen p53 trong carcinôm tuyến ñại trực tràng trên bệnh nhân Việt Nam. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Genomic DNA ñược tách chiết từ 100 mẫu mô vùi nến của carcinôm ñại trực tràng. Exon 5 – 8 của gen p53 ñược khuếch ñại bằng PCR và ñược giải trình tự trực tiếp. Kết quả: Đột biến gen p53 ở ung thư ñại trực tràng là 50%. Đột biến xảy ra cao nhất ở exon 5 (48%) và exon 8 (28%), tại 5 hotspots R273 (14%), R175 (10%), R282 (8%), R158 (6%) và G245 (6%). 82% là ñột biến nhầm nghĩa, 12% ñột biến dịch khung và 4% ñột biến vô nghĩa. Đột biến xảy ra chủ yếu ở các nucleotid loại G (48%) và C (34%); ñột biến chuyển vị chiếm 70%, chủ yếu là chuyển vị G → A (36%); ñột biến chuyển dạng chiếm 30%, chủ yếu là chuyển dạng G → T (10%); 70% ñột biến xảy ra trong vùng trình tự bảo tồn của gen. Từ khóa: Đột biến gen p53, giải trình tự trực tiếp, ung thư ñại trực tràng ABSTRACT DETERMINE P53 MUTATIONS IN CARCINOMA COLORECTAL CANCER BY USING DIRECTED SEQUENCING METHOD. Hoang Anh Vu, Phung Ngoc Thuy Linh, Hua Thi Ngoc Ha * Y Hoc TP. Ho Chi Minh – Vol.14 - Supplement of No 4 – 2010: 689 - 696 Purpose: p53 gene is one of tumor suppressor genes having 11 exons, in which exon 2-11 encode 393 amino acid protein. Previous study showed that most of p53 mutations occurred at 126 - 306 residue in exon 58 region and p53 mutation had been associated with poor prognosis of colorectal cancer in later stage. This study was performed to determine frequency and types of p53 mutations in Vietnamese patients with carcinoma colorectal cancer. Material and method: Genomic DNA was extracted from 100 paraffin-embedded colorectal carcinoma tissues. Exons 5-8 of the p53 gene were amplified with PCR, and were sequenced by using directed sequencing method. Results: p53 mutations were detected in 50% of colorectal carcinoma samples. Most of the mutations occurred in exon 5 (48%) and exon 8 (28%), at 5 hotspots including R273 (14%), R175 (10%), R282 (8%), R158 (6%) and G245 (6%). There were 82% missense mutations, 12% frameshift mutations and 4% nonsense mutations. Mutations mainly occured at guanine (48%) and cytosine (34%), 70% mutations were transitions, in which 36% were G→A transitions; 30% were transversions, in which 10% were C→ T transversions. 70% mutations appeared in consensus sequence of gene. Key words: p53 mutation, direct sequencing, colorectal cancer. ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư là bệnh di truyền tế bào do hàng loạt các biến ñổi vật liệu di truyền ở tế bào gây ra, chủ yếu là ñột biến gen. Riêng ở bệnh ung thư ñại - trực tràng, có khoảng 85% các khối u ñại - trực tràng (ĐTT) ñược hình thành theo con ñường mất ổn ñịnh nhiễm sắc thể (CIN). Theo ñó, hàng loạt ñột biến ñược tích lũy và diễn ra theo một thứ tự, khởi ñầu là các biến ñổi xảy ra trên gen Apc, gen Kras, Dcc, Smad và sau ñó là ñột biến gen p53 và các biến ñổi nhiều gen khác. Đặc biệt, khi mới xuất hiện các ñột biến Apc hay Kras ở giai ñoạn ñầu của bệnh ung thư ñại - trực tràng, tế bào ñã có sự biểu hiện vượt mức protein p53(2,7). Nhờ ñó, ñột biến gen p53 cũng ñược xem là dấu hiệu tiên lượng xấu của bệnh ung thư ñại - trực tràng ở giai ñoạn sau(2). Gen p53 có 11 exon, 689 Chuyên ñề Ung Bướu * ** Đại học Y dược TP. HCM; Đại học Khoa học tự nhiên TP. HCM Địa chỉ liên lạc: BS. Phùng Ngọc Thùy Linh. Email: pntlinh0207@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 trong ñó exon 2-11 mã hóa protein dài 393 acid amin. Các nghiên cứu trước ñây cho rằng ña số ñột biến p53 xuất hiện trong vùng gen bảo tồn cao qua quá trình tiến hóa và có chức năng quan trọng, chủ yếu trong exon 5-8 từ acid amin thứ 126 - 306(8). Vì vậy, ña số các nghiên cứu về ñột biến p53 thường giới hạn trong phạm vi vùng exon 5-8(3,11).Theo Thierry Soussi (2007), ở các nước phát triển thì tỉ lệ ñột biến gen p53 của ung thư ñại - trực tràng là khoảng 45%, còn ở các nước ñang phát triển thì tỉ lệ này thấp hơn(10), trong ñó các ñột biến ở exon 5-8 chiếm tỉ lệ ñến 87%(3). Ở Việt Nam, theo nghiên cứu ở Bệnh viện 108 của Hoàng Kim Ngân và Trịnh Tuấn Dũng năm 2007 thì tỉ lệ dương tính với kháng nguyên của protein p53 ở ung thư ñại - trực tràng là 54,55%(4), nhưng các số liệu về ñột biến gen p53 ở ung thư ñại - trực tràng vẫn chưa ñược xem xét và ñánh giá ñầy ñủ. Trong nghiên cứu này chúng tôi tiến hành phương pháp giải trình tự trực tiếp (direct sequencing) các exon 5-8 của ñoạn gen p53 với mục tiêu xác ñịnh tỉ lệ và các kiểu ñột biến gen p53 ở ung thư ñại - trực tràng. ĐỐI TƯỢNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu 100 mẫu mô vùi nến của carcinôm tuyến ñại trực tràng ñược chẩn ñoán tại Bộ môn Giải phẫu bệnh - Đại học Y Dược TP. HCM từ tháng 10/2008 ñến 04/2009. Phương pháp Tách chiết genomic DNA từ mô carcinôm tuyến ñại - trực tràng: Chúng tôi dùng bộ kit DNeasy Mini Kit QIAgen theo hướng dẫn của nhà sản xuất. PCR khuyếch ñại ñoạn gen p53 chứa exon 5 – 8. Dùng lần lượt 2 cặp mồi p53g5F2 (5’GGTTGCAGGAGGTGCTTACA-3’) và p53g.5-6R (5’-CACTGACAACCACCCTTAAC-3’), p53seq7F (5’-GGCCTCCCCTGCTTGCCACA-3’) và p53g8R (5’-GTGCTAGGAAAGAGGCAAGG-3’) ñể khuyếch ñại ñoạn DNA chứa các exon 5-6 có kích thước 541 bp và ñoạn DNA chứa các exon 7-8 có kích thước 754 bp từ DNA ñã tách chiết. Thành phần phản ứng gồm có PCR buffer, dNTP (250 µM cho mỗi loại), 2 loại mồi xuôi và ngược (0,5 µM cho mỗi loại), TaKaRa TaqTM HotStart Polymerase (1,25 unit) và 20 ng genomic DNA. Chu kỳ luân nhiệt ñược thực hiện trên máy GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems, Hoa Kỳ) bao gồm giai ñoạn biến tính ban ñầu ở 980C trong 1 phút, theo sau Chuyên ñề Ung Bướu bằng 40 chu kỳ gồm biến tính ở 980C trong 10 giây, gắn mồi ở 600C trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 720C trong 1 phút và kết thúc bằng giai ñoạn kéo dài sản phẩm ở 720C trong 5 phút. Kiểm tra kích thước sản phẩm PCR: Sản phẩm PCR ñược phát hiện bằng ñiện di trên thạch agarose 1,2% có nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Pringraph (Atto, Nhật Bản) với thang chuẩn Ready-LoadTM 1 Kb Plus DNA Ladder. Tinh sạch sản phẩm PCR: Sử dụng QIAquick Gel Extraction kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất. PCR trước giải trình tự và kết tủa DNA bằng ethanol. Sản phẩm PCR ñã ñược tinh sạch sẽ ñược thực hiện phản ứng cycle sequencing với BigDye V3.1 từ Applied Biosystems, theo 2 chiều xuôi và ngược cho mỗi exon. Sản phẩm sau ñó ñược kết tủa bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formamide, biến tính ở 950C trong 2 phút trước khi làm lạnh ñột ngột. Trình tự DNA ñược ñọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems, Hoa Kỳ). Kết quả ñược phân tích bằng phần mềm SeqScape, so với trình tự chuẩn NC_000017.10 trên GenBank. Các dữ liệu ñột biến ñược tra cứu theo dữ liệu của IARC, dữ liệu về SNP của gen p53 ñược tra cứu trên hệ thống dữ liệu của NCBI. KẾT QUẢ Các tỉ lệ ñột biến gen p53 Có 33 loại ñột biến trong tổng số 50 ñột biến trên exon 5-8 của gen p53 ñược tìm thấy ở 50 mẫu trong tổng số 100 mẫu ung thư ñại trực tràng ñã thu thập ñược, chiếm tỉ lệ 50%. Số liệu của các ñột biến ñược liệt kê theo vị trí exon và theo mẫu bệnh phẩm ở bảng 1. Bảng 1. Thống kê các ñột biến ở từng exon 5 – 8 gen p53 KIỂU ĐỘT BIẾN MẪU BỆNH PHẨM Exon 5 SỐ TỈ LỆ LƯỢNG % 23/50 46% Y126H 121F 1 2% L130F 020F 1 2% F134L 070F 1 2% C135F 015F 1 2% P152delC 023F 1 2% 690 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 R156C 082F 1 2% P250delC 113F 1 2% V157F 116F 1 2% I255F 014F 1 2% R158L 010F 1 2% 14/50 28% R158H 053F, 123F 2 4% A161T 106F, 112F 2 4% H168R 086F 1 2% V173G 090F 1 2% R174delG 011F 1 2% R175H 038F, 039F, 062F, 088F, 098F 5 10% C176Y 081F 1 2% H179Q 049F 1 2% R181C 118F 1 2% 3/50 6% Exon 6 R213X 012F, 089F 2 4% Y220C 076F 1 2% 10/50 20% Exon 7 G227 ins CTGA 119F 1 2% Y234H 073F 1 2% S241F 074F 1 2% G245S 004F, 066F, 115F 3 6% 025F 1 2% R248insC Exon 8 R273C 042F, 056F 2 4% R273H 051F, 055F, 058F, 063F, 078F 5 10% C275F 111F 1 2% R282W 048F, 052F, 108F, 109F 4 8% E294X 092F 1 2% P300delC 087F 1 2% Tỉ lệ ñột biến gen theo vị trí exon: Trong tổng số 50 ñột biến, ñột biến gen p53 xuất hiện trên exon 5 là nhiều nhất, gồm 23 trường hợp, chiếm tỉ lệ 46%. Tỉ lệ ñột biến gen ở exon 8 và 7 lần lượt là 28% và 20%, tương ứng với 14 và 10 ñột biến. Cuối cùng, chỉ có 3 ñột biến trên exon 6, chiếm tỉ lệ 6%. Tỉ lệ ñột biến theo vị trí codon: Có 30 vị trí codon bị ñột biến trên suốt exon 5 ñến 8. Trong ñó, 3 vị trí acid amin ñột biến thường gặp nhất là Arg273, Arg175, và Arg282 với tỉ lệ lần lượt là 14%, 10% và 8%. Đột biến ở Gly245, Arg158 cùng chiếm tỉ lệ 6%, còn vị trí Arg248 và Ala161chỉ xuất hiện với tỉ lệ 4%. Ngoài ra, 23 vị trí ñột biến khác chỉ xuất hiện 1 lần, chiếm tỉ lệ 2%. Đáng chú ý là ở 2 codon Arg248 và Arg273, mỗi codon có 2 thể ñột biến khác nhau. Ở codon 248 có thể bị ñột biến chèn thêm 1 nucleotid Cytosine hoặc Arg bị ñột biến thành Tryptophan; ở codon 273 Arg có thể bị ñột biến thành Cys hoặc His. R248W 044F 1 2% Các kiểu ñột biến gen p53 Bảng 2. Phân loại các kiểu ñột biến theo vị trí exon trên gen p53 Các dạng biến ñổi Đột biến thay thế Số lượng Tỉ lệ % 21 3 7 13 44/50 88,0% Nhầm nghĩa 21 1 7 12 41/50 82,0% Vô nghĩa 0 2 0 1 3/50 6,0% 2 0 3 1 6/50 12,0% Mất 2 0 1 1 4/50 8,0% Thêm 0 0 2 0 2/50 4,0% Đột biến dịch khung Chuyên ñề Ung Bướu Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 691 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Đột biến ñiểm 23 3 9 14 49/50 98,0% Tại A 1 1 1 0 3/50 6,0% Tại T 4 0 1 0 5/50 10,0% Tại G 14 0 3 7 24/50 48,0% Tại C 4 2 4 7 17/50 34,0% Khác 0 0 1 0 1/50 2,0% Chuyển vị 15 3 6 11 35/50 70,0% A→G 1 1 0 0 2/50 4,0% G→A 10 0 3 5 18/50 36,0% C→T 3 2 2 6 13/50 26,0% T→C 1 0 1 0 2/50 4,0% 6 0 1 2 9/50 18,0% A→T 0 0 1 0 1/50 2,0% T→A 1 0 0 0 1/50 2,0% G→T 3 0 0 2 5/50 10,0% T→G 2 0 0 0 2/50 4,0% 23 3 10 14 50/50 100,0% 1 9 2 8 8 27/50 54,0% 2 12 1 1 6 20/50 40,0% 3 2 0 1 0 3/50 6,0% 23 3 10 14 50/50 100,0% Trong 11 2 5 11 29/50 58,0% Ngoài 12 1 5 3 21/50 42,0% Vùng trình tự bị ñột biến 23 3 10 14 50/50 100,0% Bảo tồn 14 0 9 12 35/50 70,0% II 4 0 0 0 4/50 8,0% III 10 0 0 0 10/50 20,0% IV 0 0 9 0 9/50 18,0% V 0 0 0 12 12/50 24,0% Không bảo tồn 9 3 1 2 15/50 30,0% Chuyển dạng Vị trí nucleotid ñột biến trong codon Vùng CpG Chuyên ñề Ung Bướu 692 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 4 * 2010 Các loại ñột biến gen p53 chủ yếu là dạng ñột biến thay thế chiếm tỉ lệ 88%, bao gồm ñột biến nhầm nghĩa và ñột biến vô nghĩa chiếm tỉ lệ lần lượt là 82% và 6%. Ngoài ra, ñột biến dịch khung chỉ chiếm tỉ lệ 12%, trong ñó ñột biến mất và thêm chiếm tỉ lệ lần lượt là 8% và 4%. Các nucleotid bị ñột biến có ñến 98% là ñột biến ñiểm, ñột biến tại nucleotid loại G chiếm tỉ lệ 48% cao nhất, còn các ñột biến ñiểm tại C, T, A còn lại lần lượt là 34%, 10% và 6%. Chỉ có ñột biến chèn 4 nucleotid CTGA ở codon 227 không ñược xem là ñột biến ñiểm. Trong 44 ñột biến thay thế, có ñến 35 ñột biến là ñột biến chuyển vị, chiếm tỉ lệ 70% tổng số ñột biến, và 9 ñột biến là ñột biến chuyển dạng, chiếm tỉ lệ 18%. Trong các ñột biến chuyển vị, chủ yếu là dạng GA với tỉ lệ 36%, các dạng chuyển vị khác như CT, TC và AG chiếm tỉ lệ lần lượt 26%, 4% và 4%. Trong các ñột biến chuyển dạng, ñột biến GT chiếm tỉ lệ cao nhất 10%, các ñột biến còn lại TG, AT, TA chiếm tỉ lệ lần lượt 4%, 2% và 2%. Các ñột biến dịch khung không ñược xem là ñột biến chuyển vị hoặc chuyển dạng, chiếm tỉ lệ 12%. Vị trí nucleotid bị ñột biến: Theo bảng 2 cho thấy tỉ lệ nucleotid bị ñột biến ở vị trí thứ 1 và thứ 2 trong codon lần lượt là 54% và 40%, chỉ có 6% ñột biến xảy ra ở nucleotid thứ 3 Vùng trình tự bị ñột biến: Các ñột biến gen p53 xuất hiện nhiều ở trong vùng CpG hơn là xuất hiện ở ngoài vùng CpG, với tỉ lệ 58% so với 42%. Mặt khác, ña số ñột biến nằm trong vùng trình tự bảo tồn, chiếm tỉ lệ 70%, chỉ có 30% ñột biến xuất hiện ở vùng trình tự không bảo tồn. Các ñột biến xảy ra nhiều nhất trong vùng bảo tồn V với tỉ lệ 24%, còn ñột biến ở vùng trình tự bảo tồn III, IV, II lần lượt là 20%, 18% và 8%. BÀN LUẬN Sự biến ñổi trình tự gen p53 Tỉ lệ ñột biến gen p53: Đột biến gen p53 chiếm tỉ lệ 50% tổng số 100 mẫu ñã giải trình tự gen, bao gồm 33 loại ñột biến khác nhau. Số liệu này không khác biệt với nghiên cứu của Greenblatt và c.s năm 1994, và gần giống các nghiên cứu khác ñược liệt kê ở bảng 3. Bảng 3. Tỉ lệ ñột biến gen p53 giữa các nghiên cứu khác nhau. Năm Tổng mẫu Số lượng ñột biến Tỉ lệ ñột biến Nghiên cứu này 2010 100 50 50% Greenblatt và c.s(3) 1994 960 480 50% 2005 3474 1449 42% 2009 13193 5708 43,3% Nhóm nghiên cứu Russo và c.s (9) IARC Vị trí exon bị ñột biến: Trong nghiên cứu này, tỉ lệ ñột biến gen p53 ở các exon 5, 6, 7, 8 lần lượt là 46%, 6%, 20% và 28%. Đột biến p53 trên exon 5 xảy ra với tỉ lệ cao nhất, cao hơn hẳn so với ñột biến xảy ra ở exon 8 và exon 7. Ngược lại, tỉ lệ ñột biến ở exon 7 chỉ là 20% sau cả tỉ lệ ñột biến trên exon 8 là 28%, trong khi exon 7 lại là vị trí xảy ra nhiều ñột biến nhất theo 2 nghiên cứu trên. Tỉ lệ ñột biến trên exon 6 là nhỏ nhất, khá phù hợp với 2 nghiên cứu trên. Bảng 4. Tỉ lệ các loại ñột biến gen p53 theo vị trí từng exon 5 - 8 Tổng số loại ñột Nhóm nghiên cứu Exon 5 Exon 6 Exon 7 Exon 8 biến Nghiên cứu này 33 17 51,5% 2 6% 8 24,2% 6 18,2% Rei Kikuchi-Yanosita và c,s, 24 9 37,5% 4 16,6% 7 29,2% 4 16,6% Chuyên ñề Ung Bướu 693