intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên tái tổ hợp Alpha-Fetoprotein

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST
Báo xấu
2
lượt xem 1
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ung thư gan nguyên phát mà điển hinh là ung thư biểu mô tế bào gan (HCC), một trong những bệnh lý phổ biến nhất trên toàn cầu, đặt ra những thách thức lớn đối với ngành y tế và cộng đồng. Nghiên cứu này nhằm mục tiêu: Tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên tái tổ hợp AFP trên chuột nhắt trắng thuần chủng BALB/c trong quy mô phòng thí nghiệm.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên tái tổ hợp Alpha-Fetoprotein

  1. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 539 - THÁNG 6 - SỐ CHUYẤN ĐỀ - 2024 NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG KHÁNG NGUYÊN TÁI TỔ HỢP ALPHA-FETOPROTEIN Hồ Trường Giang1, Võ Thị Bích Thủy2, Nghiêm Ngọc Minh2 TÓM TẮT 60 gây báng trên chuột BALB/c. Dịch báng được Mục tiêu: Tạo dòng tế bào lai sinh kháng thể đánh giá kháng thể cho kết quả hàm lượng kháng đơn dòng kháng kháng nguyên tái tổ hợp Alpha- thể đơn dòng trong dịch báng thu được từ hai Fetoprotein (AFP) trên chuột nhắt trắng thuần dòng tế bào AFP1 và AFP2 đều rất cao. Kết chủng BALB/c. Phương pháp nghiên cứu: Gây luận: Tạo thành công 2 dòng tế bào lai tiết kháng miễn dịch cho chuột nhắt trắng thuần chủng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ BALB/c, phục hồi tế bào myeloma, cấy chuyển hợp AFP là AFP1 và AFP2. và nhân giống tế bào myeloma, sàng lọc tế bào Từ khóa: Kháng thể đơn dòng kháng kháng lai có khả năng tiết kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ hợp AFP; gây báng trên chuột nguyên tái tổ hợp AFP, đánh giá và kiểm tra hiệu BALB/c; hai dòng tế bào AFP1 và AFP2. giá kháng thể bằng phương pháp ELISA, lựa chọn và gây báng trên chuột BALB/c, thu nhận SUMMARY dịch báng chuột và đánh giá hiệu giá kháng thể RESEARCH ON CREATION OF bằng phương pháp ELISA. Kết quả: Kháng HYBRABILOGIC CELL LINES nguyên tái tổ hợp AFP (nồng độ 400µg/ml) được PRODUCING MONOCLONE phối trộn với chất bổ trợ FIA, tiêm vào chuột với ANTIBODIES AGAINST tổng thể tích là 50µl/ con. Tách tế bào lympho B RECOMBINANT ANTIGENS ALPHA- từ hạch lách và hạch bẹn của chuột, Dung hợp tế FETOPROTEIN bào bằng chất xúc tác PEG và bổ sung môi Objective: To create a hybrid cell line trường DMEM, Dịch huyền phù tế bào sau dung producing monoclonal antibodies against hợp được nuôi trong đĩa 96 giếng, ngày thứ 10 recombinant Alpha-Fetoprotein (AFP) antigen in nuôi cấy tế bào đạt khoảng 80% độ phủ bề mặt. purebred BALB/c mice. Methods: Immunize Mỗi kháng nguyên tái tổ hợp chọn được 2 dòng purebred BALB/c mice, recover myeloma cells, sinh kháng đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ hợp transplant and proliferate myeloma cells, screen AFP, tăng số lượng tế bào và thu nhận thành hybrid cells capable of secreting antibodies công 2 dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng specific to recombinant AFP antigen, evaluate kháng lại kháng nguyên tái tổ hợp và sử dụng để and test antibody titers by ELISA method, select and induce ascites in BALB/c mice, collect mouse ascites fluid and evaluate antibody titers 1 Học viện Quân y by ELISA method. Results: Recombinant AFP 2 Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt nam antigen (concentration 400µg/ml) was mixed Chịu trách nhiệm chính: Võ Thị Bích Thủy with FIA adjuvant, injected into mice with a total Email: thuytbvo.igr@gmail.com volume of 50µl/ mouse. Lympho B cells were Ngày nhận bài: 18/4/2024 separated from the lymph nodes and spleen of the Ngày phản biện khoa học: 6/5/2024 mouse, cell suspension was made with PEG Ngày duyệt bài: 26/5/2024 437
  2. HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC THƯỜNG NIÊN HỘI HÌNH THÁI HỌC VIỆT NAM - 2024 catalyst and supplemented with DMEM medium, được sử dụng để đánh giá hiệu quả của các cell suspension was cultured in 96 wells plate, on liệu pháp điều trị, cũng như dự báo về kết the 10th day of culture, the cells reached about quả điều trị. Nghiên cứu liên quan đến AFP 80% surface coverage. Each recombinant antigen đã không ngừng phát triển từ đó. Nhiều selected 2 specific antibody-producing lines with nghiên cứu đã tập trung vào việc cải thiện độ recombinant AFP antigen, increased the number nhạy và độ đặc hiệu của AFP trong việc phát of cells and successfully obtained 2 hybrid cell hiện HCC [3, 4]. lines producing monoclonal antibodies against Hiện nay, kháng thể đơn dòng được sản recombinant antigen and used to induce ascites in xuất bằng công nghệ tế bào lai từ các kháng BALB/c mice. The ascites fluid was evaluated nguyên tái tổ hợp [5] là một phương pháp for antibodies, the results showed that the đang được phát triển để góp phần chẩn đoán monoclonal antibody content in the ascites fluid sớm sự có mặt của các biomarker đặc hiệu obtained from the two cell lines AFP1 and AFP2 cho bệnh, đặc biệt là HCC [6]. was very high. Conclusion: Successfully created Do đó, chúng tôi thực hiện nghiên cứu 2 hybrid cell lines secreting monoclonal này nhằm mục tiêu: Tạo dòng tế bào lai sinh antibodies specific to recombinant AFP antigen, kháng thể đơn dòng kháng kháng nguyên tái namely AFP1 and AFP2. tổ hợp AFP trên chuột nhắt trắng thuần Keywords: Monoclonal antibody against chủng BALB/c trong quy mô phòng thí recombinant antigen AFP; induce ascites in nghiệm. BALB/c mice; two cell lines AFP1 and AFP2. II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. ĐẶT VẤN ĐỀ 2.1. Đối tượng nghiên cứu Ung thư gan nguyên phát mà điển hinh là - Kháng nguyên tái tổ hợp AFP đã được ung thư biểu mô tế bào gan (HCC), một tinh sạch do Phòng Hệ Gen học Vi sinh trong những bệnh lý phổ biến nhất trên toàn thuộc Viện Gen – Viện Hàn Lâm Khoa Học cầu, đặt ra những thách thức lớn đối với Việt Nam cung cấp, được sử dụng để gây ngành y tế và cộng đồng. Tại Việt Nam số ca kích ứng cho động vật thí nghiệm. tử vong do ung thư biểu mô tế bào gan luôn - Chuột thuần chủng BALB/c 05 tuần dẫn đầu với số liệu mới nhất được công bố tuổi, khoẻ mạnh được chọn để gây kích ứng bởi GLOBOCAN (2022) là 23.333 ca [1]. Sự miễn dịch và thu nhận tế bào lympho B. gia tăng của số ca mắc mới HCC tại Việt 2.2. Hóa chất và dụng cụ nghiên cứu Nam (24.502 ca mắc mới trong năm 2022) - Hóa chất: Chất bổ trợ Freund’s [1] đã làm tăng đáng kể áp lực đối với hệ Complete Adjuvant (FCA), Chất bổ trợ thống y tế và yêu cầu những phương pháp Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA), Môi chẩn đoán và điều trị hiệu quả hơn. AFP là trường nuôi cấy tế bào DMEM; PBS kháng nguyên đặc trưng cho HCC trong (phosphats buffer saline), kháng sinh khoảng 70-95% các trường hợp [2]. Giá trị Gentamycin, penicillin, huyết thanh bê AFP tăng rất cao thường là dấu hiệu của (FBS), pristane (2,6,10,14- HCC. Điều này dẫn đến việc sử dụng AFP Tetramethyldecanoic acid) (Sigma, Hoa Kỳ), như một biomarker trong việc chẩn đoán và đệm PBS 10X pH 7.4 (sigma, Hoa Kỳ), cồn theo dõi sự phát triển của HCC. AFP cũng y tế 700, Tween 20 (Sigma, Hoa Kỳ), Bovine 438
  3. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 539 - THÁNG 6 - SỐ CHUYẤN ĐỀ - 2024 Serum Albumin lyophilized powder, ≥96% * Phương pháp nghiên cứu: (agarose gel electrophoresis), Goat anti- - Gây kích ứng cho chuột Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody- Gây miễn dịch lần 1: HRP, 1-Step™ Ultra TMB-Blotting Chuột được gây miễn dịch lần 1 với Solution, HCl, Carbonate-Bicarbonate Buffer kháng nguyên AFP bằng cách tiêm 50µl (Sigma, Hoa Kỳ), PBS (10X) pH 7.4 kháng nguyên AFP (pha loãng bằng PBS tới (Thermo Fisher), Skim milk, SDS-Sodium nồng độ 400 µg/ml) đã được phối trộn với dodecyl sulfate, glycerol, bromephenol blue nhũ tương Freund’s Complete Adjuvant (0,1%), DTT (1M), Acrylamide/Bis- (FCA) theo tỉ lệ 1:1. Hỗn hợp kháng nguyên acrylamide (30%/0.8% w/v), Tris-HCl (1M, và chất bổ trợ FCA sẽ được tiêm dưới da hai pH 6.8), Tris-HCl (0.5 M, pH 6.8), Tris-HCl bàn chân chuột để gây miễn dịch lần 1. (1.5 M, pH 8.8), Ammonium persulfate 10% Gây miễn dịch lần 2: (w/v) (APS), TEMED, Ethanol, Methanol, Sau 3 ngày gây miễn dịch lần 1, tiến Tris base, Glycine, Coomassie Brilliant Blue hành gây miễn dịch lần 2 bằng cách tiêm R-250, PageRuler™ Prestained Protein 50µl kháng nguyên tái tổ hợp đã được phối Ladder (protein marker), màng PDVF, giấy trộn với Freund’s Incomplete Adjuvant (FIA) lọc, Ponceau S, NaCl, PBS (10X) pH 7.4 ở nồng độ 400µg/ml theo tỷ lệ 1:1 vào 2 gan (Thermo Fisher). bàn chân của chuột. - Dụng cụ: Bơm kim tiêm vô trùng loại 1 Gây miễn dịch lần 3: ml, buồng đếm hồng cầu, micropipet các Sau 6 ngày gây miễn dịch lần 1, tiến loại, đầu tip 0,1 ml, đầu tip 0,2 ml, đầu tip 1 hành gây miễn dịch lần 3, tiêm nhắc lại 50µl ml ống fancol, ống eppendorf, găng tay, kháng nguyên AFP đã được phối trộn với bông cồn, bình ni tơ lỏng, Đĩa ELISA 96 FIA theo tỉ lệ 1:1 vào dưới da hai bàn chân giếng, đĩa petri vô trùng, chai nuôi cấy tế bào của chuột. Trước khi tiêm cần sát trùng vùng (loại T25, T75, T225), ống Falcon 15 ml, bàn chân chuột bằng bông cồn 70o. Khi tiêm ống Falcon 50 ml và các dụng cụ thí nghiệm các dịch nhũ tương, cần chú ý tránh các khác. mạch máu lớn của chuột. Cung cấp đủ thức - Thiết bị: Tủ cấy an toàn sinh học (Esco, ăn, nước uống cho chuột và theo dõi chuột Singapore); Tủ lạnh 4oC (LG, Việt Nam); Tủ mỗi ngày ít nhất 2 lần. Nếu vết tiêm có dấu lạnh -20oC (Kangaroo, Việt Nam); Tủ lạnh - hiệu hoại tử cần loại bỏ chuột và gây miễn 80oC; Dụng cụ nuôi chuột nuôi chuột; tủ dịch thay thế cho con khác. nuôi cấy tế bào, kính hiển vi soi ngược, máy - Phục hồi tế bào myeloma: Tế bào ly tâm (eppendorf, Đức), máy đọc ELISA, tủ Myeloma được rã đông trong cốc nước ấm ấm nuôi cấy tế bào, cân phân tích, cân kĩ 37oC. Sau đó chuyển huyễn dịch tế bào sang thuật, nồi hấp vô trùng, máy vortex, máy spin ống falcon 15ml có chứa sẵn 10ml môi down, bộ điện di đứng SDS-PAGE, bộ trường DMEM có bổ sung 10% FBS, xoáy chuyển màng, máy lắc ủ nhiệt, máy lắc chặt nắp ống, ly tâm ở tốc độ 1000 vòng thường. trong 5 phút. Loại bỏ dung dịch nổi chứa 2.2. Phương pháp nghiên cứu chất bảo quản phía trên, thu cặn tế bào. Hòa * Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu thực cặn tế bào trong 20ml môi trường DMEM nghiệm tại labo 10% FBS, dùng pipet đảo đều và chuyển 439
  4. HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC THƯỜNG NIÊN HỘI HÌNH THÁI HỌC VIỆT NAM - 2024 toàn bộ huyễn dịch tế bào vào trong chai dung dịch PBS bổ sung 0.05% Tween 20, lặp nuôi cấy T75. Quan sát dưới kính hiển vi soi lại 3 lần. Bổ sung 50 µl dịch nuôi cấy ở các ngược xem tỉ lệ sống của tế bào. Sau đó nuôi giếng có tế bào lại vào các giếng theo thứ tự cấy tế bào trong tủ nuôi cấy ở 37°C, 5% và ghi lại vị trí các giếng trong đĩa nuôi cấy CO2. Hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế tương ứng, ủ đĩa 37℃ trong 1h. Các giếng bào. được rửa bằng dung dịch PBS bổ sung - Cấy chuyển và nhân giống tế bào 0.05% Tween 20, lặp lại 3 lần. Bổ sung 50µl myeloma: Sau khi phục hồi tế bào khoảng 72 kháng thể cộng hợp (HRP-IgG Goat anti giờ, mật độ tế bào trong chai nuôi cấy đạt tới Mouse) vào mỗi giếng. Ủ nhiệt độ phòng 80-90% bề mặt chai nuôi. Để đảm bảo sự trong 1h. Các giếng được rửa bằng dung dịch phát triển của tế bào, cũng như đủ lượng tế PBS bổ sung 0.05% Tween 20, lặp lại 3 lần. bào để tiến hành dung hợp, cần nhân giống tế Bổ sung 50 µl cơ chất (TMB), 100 µl/giếng. bào ra các chai nuôi mới. Bỏ môi trường cũ Dừng phản ứng bằng 50 µl dung dịch HCl trong chai nuôi cấy, rửa lại với PBS 1X. Bổ 1M. Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA ở sung 1ml trypsin 0,25% láng đều mặt đáy, để bước sóng 450nm. khoảng 5-10 phút đến khi tế bào bong hết - Đánh giá và kiểm tra hiệu giá kháng khỏi mặt đáy, lắc mạnh chai nuôi cấy để các thể: Nuôi tăng sinh các dòng tế bào sinh tế bào tách khỏi đáy chai, bổ sung 15ml môi kháng thể đặc hiệu: Chỉ những dòng tế bào trường DMEM (5% FBS) vào chai nuôi cấy. được chứng minh là không có mầm bệnh từ Chuyển toàn bộ dịch tế bào sang ống falcon chuột và đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ 50ml. Ly tâm ở tốc độ 1000 vòng/5 phút. hợp mới được chọn để tạo báng trên chuột. Loại bỏ toàn bộ dịch tế bào ở trên. Hòa cặn Các dòng tế bào lai hybridoma được nuôi cấy tế bào trong 1ml môi trường DMEM có bổ tăng lượng trong chai nuôi cấy tế bào T75 sử sung 10% FBS. Đếm tế bào bằng buồng đếm dụng môi trường nuôi cấy tế bào DMEM có Neubauer. Pha loãng tế bào để đạt nồng độ 2x105 tế bào/ml môi trường. Sau khi pha bổ sung 5% FBS (huyết thanh bào thai bò). loãng đạt tới nồng độ trên, mỗi chai nuôi tế Một chai nuôi cấy tế bào T75 chứa đủ tế bào bào T75 bổ sung 20 ml tế bào. Đưa chai nuôi để tiêm 4-5 con chuột. Đảm bảo rằng các tế cấy vào trong tủ ấm 37oC, trong điều kiện có bào khỏe mạnh và chúng không bị nhiễm vi CO2. sinh vật. Lắc nhẹ chai nuôi cấy cho các tế - Sàng lọc tế bào lai có khả năng tiết bào lai bung ra khỏi bề mặt nuôi cấy, chuyển kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ toàn bộ huyền phù tế bào vào ống fancol 50 hợp: Kháng nguyên tái tổ hợp được pha ml. Ly tâm các tế bào trong ống ly tâm 50 ml loãng trong đệm Bicarbonate 0.05 M, pH 9.6 ở 1500 rpm trong 5 phút. Sử dụng phần dịch tới nồng độ 4 µg/ml. Bổ sung 100 µl vào mỗi nổi phía trên để kiểm tra chất lượng của tế giếng của đĩa ELISA. Ủ đĩa ở 37℃ trong 2h. bào lai sinh kháng thể bằng phương pháp Loại bỏ kháng nguyên thừa trong các giếng. ELISA. Các tế bào lai được huyền phù nhẹ Rửa các giếng bằng 200µl/giếng dung dịch nhàng trong đệm PBS vô trùng (nước muối PBS bổ sung 0.05% Tween 20, lặp lại 3 lần. đệm sinh lý) sao cho số lượng tế bào lai nằm Blocking bằng 100 µl dung dịch 0.5% BSA ở trong khoảng từ 1x105 đến 1x107 tế bào. Sử 37℃ trong 1h. Các giếng được rửa bằng 440
  5. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 539 - THÁNG 6 - SỐ CHUYẤN ĐỀ - 2024 dụng buồng đếm hồng cầu để đếm số lượng phần bụng chuột lên phía trên, da bụng được tế bào lai phù hợp dùng để tiêm chuột tạo nâng lên, sau đó sử dụng kéo và panh vô báng. Pha loãng tế bào lai bằng dung dịch trùng rạch một đường nhỏ qua da ở giữa đệm PBS sao cho thể tích tiêm vào là 0,5 ml xương chậu và mẩu ức. Dùng panh nhẹ có chứa 2x106 tế bào lai. Rút các tế bào lên nhàng giữ lấy lớp cơ và tạo một đường cắt trong một ống tiêm 1 ml. Các tế bào sẽ nhanh vào khoang bụng. Không làm tụt cơ, đưa một chóng lắng xuống, do đó, ngay trước khi ống tiêm 1 ml (không có kim) dọc theo thành tiêm chuột, hãy “lăn” ống tiêm một thời gian cơ và hút dịch báng. Dịch được cho vào ống ngắn để trộn đều chúng lên. fancol vô trùng. Vết cắt có thể được mở rộng - Lựa chọn và gây báng trên chuột để thuận tiện cho việc lấy dịch báng. Để dịch BALB/c: Chuột được sử dụng để sản xuất báng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Ly tâm dịch báng là chuột cái, trừ khi có quy định để tách huyết thanh khỏi các thành phần máu khác. Những chuột cái trưởng thành có ưu khác. Chuyển dịch màu vàng rơm (huyết thế hơn những con non vì việc chướng bụng thanh) vào ống bảo quản vô trùng bằng pipet khi mang thai tương tự như việc sản xuất hoặc ống tiêm vô trùng. Bảo quản ở -80℃ kháng thể đơn dòng (mAb), dẫn đến khối cho đến thời điểm tinh sạch. Các kháng thể lượng dịch báng thu được nhiều hơn và con đơn dòng hoặc đa dòng có thể được sử dụng vật ít bị đau hơn. Lựa chọn 5 chuột cái khỏe làm kháng thể bắt và phát hiện trong hệ mạnh 4-6 tuần tuổi, không mang bầu. Tiêm thống ELISA. Các kháng thể đơn dòng nhận 0,5 ml dung dịch pristane (2, 6, 10, 14 ra và bắt cặp với duy nhất một quyết định tetramethylpentadecane, Sigma) bằng kim kháng nguyên (epitop) cho phép định lượng tiêm vô trùng (cỡ kim 22) vào trong khoang những khác biệt nhỏ trong kháng nguyên. phúc mạc ở góc phần tư phía dưới bên phải Một kháng thể đa dòng thường được sử dụng của bụng mỗi chuột. Chờ 7-10 ngày và làm kháng thể giữ để kéo càng nhiều kháng không quá 30 ngày, sau đó tiêm 0,5 ml dòng nguyên càng tốt, trong kháng thể đa dòng tế bào lai chứa 2x106 tế bào vào khoang phúc này được cộng hợp với một chất chỉ thị là mạc của những con chuột đã được pristane enzyme. trước đó. Theo dõi chuột sau tiêm hằng ngày, quan sát và đánh giá tình trạng của mỗi III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN chuột, ghi lại thời điểm xuất hiện báng trong 3.1. Kết quả gây kích ứng miễn dịch xoang phúc mạc của chuột. Chuột được gây kích ứng miễn dịch lần - Thu nhận dịch báng chuột: Kỹ thuật vô đầu với kháng nguyên tái tổ hợp (nồng độ trùng nên được sử dụng trong việc lấy dịch 400ug/ml) phối trộn với chất bổ trợ FCA. báng. Sau 3-4 ngày xuất hiện báng, khi bụng Sau 24 giờ gây kích ứng miễn dịch lần 1 với chuột căng phồng, tiến hành lựa chọn các kháng nguyên AFP cho thấy chuột ăn uống, chuột để thu dịch báng. Gây mê chuột bằng hoạt động bình thường, cân nặng không thay chloroform, sau đó sát trùng bề mặt ổ bụng đổi, không có biểu hiện bệnh lý, lông mượt, chuột bằng cồn 70°. Cố định và để ngửa phản xạ tốt, khoẻ mạnh. 441
  6. HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC THƯỜNG NIÊN HỘI HÌNH THÁI HỌC VIỆT NAM - 2024 Hình 1. Chuột được gây kích ứng miễn dịch Tiếp tục gây kích ứng miễn dịch lần 2 lách và hạch bẹn hơi sưng chứng tỏ chuột có (sau 3 ngày gây kích ứng miễn dịch lần 1) và phản ứng miễn dịch với kháng nguyên tái tổ lần 3 (sau 6 ngày kích ứng miễn dịch lần 1). hợp được tiêm vào. So sánh với 01 chuột đối Kháng nguyên tái tổ hợp AFP (nồng độ chứng chỉ được tiêm nước cất vô trùng cho 400µg/ml) được phối trộn với chất bổ trợ thấy chuột đối chứng ăn uống, hoạt động FIA, tiêm vào chuột với tổng thể tích là 50µl/ bình thường, phát triển bình thường, không con. Sau 24 giờ mỗi lần gây kích ứng miễn có biểu hiện bất thường về bệnh lý. Cho thấy dịch, quan sát thấy chuột ăn uống, hoạt động nồng độ kháng nguyên tái tổ hợp cũng như bình thường, không thay đổi cân nặng, không chất bổ trợ FCA, FIA đưa vào chuột là phù có bất thường về biểu hiện bệnh lý, lông hợp, không gây độc cho chuột. mượt, phản xạ tốt, khoẻ mạnh. Không nhận 3.2. Kết quả dung hợp tế bào tế bào thấy sự bất thường và khác nhau về hình myeloma và tế bào lympho B dạng bên ngoài. Tách tế bào lympho B từ hạch lách và Kết quả sau ba lần gây kích ứng miễn hạch bẹn của chuột. Chuột sau khi được tiêm dịch của những con chuột BALB/c với kháng kháng nguyên tái tổ hợp sẽ được tiến hành nguyên tái tổ hợp cho thấy chuột ăn uống, mổ thu hạch lách và hạch bẹn để tách tế bào hoạt động bình thường, không thay đổi cân lympho B. nặng không có bất thường về bệnh lý. Hạch 442
  7. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 539 - THÁNG 6 - SỐ CHUYẤN ĐỀ - 2024 Hình 2. Tách tế bào lympho B từ hạch lách và bẹn của chuột A) thu hạch lách và bẹn của chuột; B) chuột. Kết quả thu được sau 5 và 10 ngày nghiền nhỏ hạch lách và hạch bẹn; C) Dung nuôi cấy được thể hiện như hình 3. hợp tế bào bằng chất xúc tác PEG và bổ sung Sau 5 ngày nuôi cấy nhận thấy đã có các môi trường DMEM; D) Dịch huyền phù tế tế bào lai mọc trên đĩa nuôi cấy. Quan sát bào sau dung hợp được nuôi trong đĩa 96 thấy các tế bào lai tập chung lại thành đám, giếng. tròn và phát triển nhanh và mạnh mẽ. Các tế Tế bào lympho B sau đó sẽ được dung bào thường sẽ mọc đơn lẻ, các tế bào lympho hợp với tế bào myeloma và nuôi cấy trong B và myeloma không được dung hợp sẽ teo môi trường HAT, ở đĩa 96 giếng, quan sát dần và chết. Ngày thứ 10 nuôi cấy, khi tế bào hàng ngày để phát hiện tế bào lai. Sau 7 ngày đạt khoảng 80% độ phủ bề mặt thì tiến hành nuôi cấy không phát hiện thấy tế bào lai sàng lọc các tế bào lai có khả năng tiết kháng hybridoma, nghiên cứu đã tiến hành dung thể đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ hợp hợp lại lần thứ 2 giữa tế bào myeloma và tế bằng phương pháp ELISA. bào lympho B thu được từ hạch lách của 443
  8. HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC THƯỜNG NIÊN HỘI HÌNH THÁI HỌC VIỆT NAM - 2024 A B Hình 3. Cụm tế bào lai được quan sát trên kính hiển vi quang học sau 5 ngày nuôi cấy (A) và 10 ngày nuôi cấy (B) 3.3. Gây báng trên chuột BALB/c đều đạt chất lượng, sinh kháng thể đơn dòng Trong quá trình sàng lọc, chúng tôi chọn đặc hiệu với kháng nguyên tái tổ hợp. Chúng được 2 dòng sinh kháng thể tốt nhất. Các tế tôi tiến hành tăng số lượng tế bào và thu bào lai này được kiểm tra đồng thời với nhận thành công 2 dòng tế bào lai sinh kháng kháng nguyên E.coli chủng BL21 cho kết thể đơn dòng kháng lại kháng nguyên tái tổ quả không đặc hiệu với kháng nguyên này. hợp và sử dụng để gây báng trên chuột Từ đó cho ta thấy rằng các dòng tế bào lai BALB/c. Bảng 1. Kết quả đọc ELISA kiểm tra tính đặc hiệu của các dòng tế bào lai sử dụng kháng nguyên gắn bản tương ứng và kháng nguyên E.coli chủng BL21 trước khi tiêm chuột tạo báng Kháng nguyên gắn bản Dòng tế bào lai Kháng nguyên tái tổ hợp Kháng nguyên E.coli chủng BL21 Dòng AFP1 1,4706 0,3152 Dòng AFP2 1,6747 0,3455 3.4. Đánh giá hiệu giá kháng thể Dung dịch báng chuột sau khi thu nhận sẽ được pha loãng thành các độ pha loãng tăng dần, mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 lần để đánh giá hiệu giá kháng thể. Độ pha loãng 100 200 400 800 1600 100 200 400 800 1600 Phản ứng ELISA a b Hình 4. Kết quả phản ứng ELISA kiểm tra hiệu giá kháng trong dịch báng chuột từ dòng tế bào AFP1 (a) và dòng tế bào AFP2 (b) tại các độ pha loãng khác nhau 444
  9. TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 539 - THÁNG 6 - SỐ CHUYẤN ĐỀ - 2024 Đối với dịch báng chuột thu nhận được từ GER/21 và Chương trình hỗ trợ Nghiên cứu tế bào lai dòng AFP2 cho kết quả hiệu giá viên cao cấp mã số NVCC40.01/23-24. kháng thể rất tốt. Tại độ pha loãng 200 lần cho giá trị OD rất cao tương ứng là 2,812, và TÀI LIỆU THAM KHẢO giá trị OD chỉ bắt đầu giảm tại độ pha loãng 1. https://gco.iarc.who.int/media/globocan/ 400 lần tương úng với giá trị OD đạt 1,954. factsheets/populations/704-viet-nam-fact- Còn đối với dịch báng chuột được thu sheet nhận từ tế bào lai dòng AFP1 kết quả đánh 2. Peter R. Galle, Friedrich Foerster, et al. giá hiệu giá kháng thể thu được cũng rất khả Biology and significance of alpha‐fetoprotein quan. Giá trị OD đo được vẫn ở mức cao tại in hepatocellular carcinoma. Liver Int, 2019 độ pha loãng 200 lần (2,894). Giá trị này Dec;39(12):2214-2229. cũng bắt đầu giảm tại độ pha loãng 400 là 3. Nobuhiro Tsuchiya, Yu Sawada, et al. 1,791. Từ đó cho ta thấy rằng hàm lượng Biomarkers for the early diagnosis of kháng thể đơn dòng trong dịch báng thu hepatocellular carcinoma. World J được từ hai dòng tế bào AFP1 và AFP2 đều Gastroenterol. 2015 Oct 7;21(37):10573-83. rất cao. doi: 10.3748/wjg.v21.i37.10573. 4. Yasi Pan, Huarong Chen, and Jun Yu. V. KẾT LUẬN Biomarkers in Hepatocellular Từ những kết quả nêu trên cho thấy, Carcinoma:Current Status and Future nghiên cứu đã tạo được 2 dòng tế bào lai tiết Perspectives. Biomedicines 2020, 8(12), kháng thể đơn dòng đặc hiệu với protein 576;doi.org/10.3390/biomedicines8120576. AFP. Kết quả này là cơ sở cho nghiên cứu 5. Roy Jefferis. Recombinant Proteins and tiếp theo chế tạo bộ kit kháng thể đơn dòng Monoclonal Antibodies. Adv Biochem Eng gắn nano DNA huỳnh quang đặc hiệu phục Biotechnol. 2021:175:281-318. doi: 10. vụ chẩn đoán sớm ung thư biểu mô tế bào 1007/10_2017_32. gan. 6. Guillermo D Mazzolini, Mariana Malvicini. Immunostimulatory monoclonal VI. LỜI CẢM ƠN antibodies for hepatocellular carcinoma Nhiệm vụ được tài trợ bởi Nhiệm vụ therapy. Trends and perspectives. Medicina Nghị định thư IGR-ZIM, mã số NĐT.102- (B Aires). 2018;78(1):29-32. 445
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2