Biệt hóa ba dòng tế bào máu từ tế bào gốc dòng tạo máu ở người

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> BIỆT HÓA BA DÒNG TẾ BÀO MÁU TỪ TẾ BÀO GỐC<br /> DÒNG TẠO MÁU Ở NGƯỜI<br /> Nguyễn Thụy Loan Chi*, Miri Nezhad Ayda**, Fichelson Serge**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Máu cuống rốn là một trong những nguồn cung cấp chính của tế bào gốc dòng tạo máu. Ngày<br /> nay, liệu pháp sử dụng tế bào gốc dòng tạo máu đang được ứng dụng để điều trị những bệnh lý huyết học.<br /> Những tế bào này vốn là tế bào gốc đa năng nên chúng có khả năng biệt hóa thành hầu hết các dòng tế bào máu<br /> khi được nuôi trong môi trường có bổ sung những tác nhân biệt hóa thích hợp. Do đó, trong nghiên cứu này,<br /> chúng tôi thử nghiệm sử dụng ba hỗn hợp cytokine để biệt hóa tế bào CD34+ thành ba dòng tế bào tủy (myeloid<br /> linages): dòng hồng cầu (erythrocytic), dòng bạch cầu hạt (granulocytic) và dòng tiểu cầu (megakaryocytic).<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Đây là nghiên cứu thực nghiệm. Những tế bào gốc dòng tạo<br /> máu được thu nhận nhờ biểu hiện kháng nguyên CD34+ trên bề mặt tế bào. Sau đó, chúng được nuôi cấy trong<br /> môi trường IMDM, 15% BIT có bổ sung những cytokine thích hợp.<br /> Kết quả: Quần thể tế bào phân lập được từ máu cuống rốn có mật độ tế bào CD34+ tối thiểu là 85%. Cuối<br /> quá trình biệt hóa thực nghiệm, sự biến mất của CD34 và đồng thời tăng rõ rệt những kháng nguyên bề mặt đặc<br /> hiệu đã chứng minh các tế bào CD34+ đều được biệt hóa thành công.<br /> Kết luận: Công trình này mở ra hướng ứng dụng trong tương lai cho ngành huyết học và truyền máu cụ<br /> thể như việc sản xuất máu ngoài cơ thể nhằm cung cấp nguồn máu “sạch” và ổn định cho bệnh nhân.<br /> Từ khóa: tế bào gốc dòng tạo máu, tế bào CD34+, biệt hóa tế bào.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> DIFFERENTIATE HUMAN HEMATOPOIETIC STEM CELLS<br /> INTO THREE LINAGES OF BLOOD CELLS<br /> Nguyen Thi Loan Chi, Miri Nezhad Ayda, Fichelson Serge<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 18 - 23<br /> Background: One of the important sources of hematopoietic stem cells (HSCs) is umbilical cord blood.<br /> Nowadays, HSC cell-based therapies are applied in treatment of hematological disorders. HSCs are multipotent,<br /> so these cells have ability to differentiate into all hematopoietic linages very effectively in culture under different<br /> combinations of cytokines. Therefore, in this study, we aimed to apply three mixtures of cytokines to differentiate<br /> HSCs into three myeloid linages of blood cells: erythrocytic, granulocytic and megakaryocytic linage.<br /> Material and method: This is an experimental study. HSCs were isolated by CD34+ antigenes expressed<br /> on their surfaces. Then, they were cultured in IMDM plus 15% BIT and supplied by suitable cytokines.<br /> Results: We collected a CD34+ population with more than 85% of purification from cord blood. At the end<br /> of the differentiation experiments, all of the cultured cells were matured into three linages of blood cells because<br /> CD34+ antigenes disappeared and the differentiation markers strongly increased.<br /> Conclusion: This study opened future applications for medicine of Hematology and Blood transfusion ,<br /> especially, the ex-vivo production of blood cells will supply a non-infected, stable and donorless source of blood.<br /> Key words: Hematopoietic stem cells, HSC, CD34+ cells, differentiaion.<br /> *<br /> <br /> Bộ môn Hóa Sinh - Sinh Học Phân Tử - ĐHYK Phạm Ngọc Thạch; ** Khoa Huyết Học - Viện Cochin -Paris, Pháp<br /> <br /> Tác giả liên lạc: BS. Nguyễn Thụy Loan Chi<br /> <br /> 18**<br /> <br /> Email: ngloanchi@gmail.com<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Tế bào gốc dòng tạo máu (Hematopoietic<br /> stem cell- HSC) là một quần thể rất ít những tế<br /> bào, mang đặc tính của tế bào gốc, nghĩa là<br /> chúng có khả năng tự nhân lên và biệt hóa<br /> thành mọi dòng tế bào máu trong suốt đời sống<br /> con người. Do đó, chúng hoàn toàn có khả năng<br /> được sử dụng trong ghép tủy để điều trị những<br /> bệnh ác tính về máu(4). Đồng thời, trong tương<br /> lai, giới khoa học mong muốn có thể sản xuất<br /> máu nhân tạo với số lượng lớn, hứa hẹn một<br /> cuộc cách mạng cho ngành y tế, bởi nó mang lại<br /> một nguồn cung máu ổn định và giảm nguy cơ<br /> truyền nhiễm do truyền máu.<br /> Những tế bào gốc này thường lưu trú trong<br /> tủy xương- nơi diễn ra quá trình tạo máu, tuy<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> nhiên chúng ta cũng có thể phân lập chúng<br /> trong máu cuống rốn. Một số dấu ấn trên màng<br /> (như CD34+, CD133+) giúp chúng ta có thể phân<br /> lập những tế bào này.<br /> Sự tạo máu là quá trình sản xuất ra các loại<br /> tế bào máu từ tế bào gốc dòng tạo máu đa chức<br /> năng. Một tế bào này có thể đi theo hai hướng<br /> biệt hóa: hướng dòng tủy và hướng dòng<br /> lympho để hình thành những tế bào đầu dòng<br /> tủy (common myeloid progenitor cell- CMP) và<br /> những tế bào đầu dòng lympho (common<br /> lymphoid progenitor cell- CLP). Những CMP sẽ<br /> biệt hóa tiếp tục thành bạch cầu hạt, hồng cầu và<br /> tiểu cầu. Trong khi đó, những CLP sẽ hình<br /> thành nên tế bào lympho T, B và tế bào NK<br /> (Natural killer cell) (Hình 1).<br /> <br /> Hình 1: Quá trình tạo máu và vai trò của các cytokine trong sự biệt hóa in-vivo(5). SCF= Stem Cell Factor, IL= Interleukin,<br /> GM-CSF= Granulocyte-Macrophage-Colony Stimulating Factor, G-CSF=Granulocyte-Colony Stimulating Factor, M-CSF=<br /> Monocyte-macrophage-Colony Stimulating Factor, EPO= Erythropoietin, TPO= Thrombopoietin). HSC= Hematopoietic<br /> stem cell: tế bào gốc dòng tạo máu, Multipotent stem cell: tế bào gốc đa năng, CMP= common myeloid progenitor cell: tế bào<br /> đầu dòng của dòng tủy, CLP= common lymphoid progenitor: tế bào đầu dòng của dòng lympho, BCP= B-cell progenitor: tế<br /> bào đầu dòng B, EP= erythroid progenitor: tế bào đầu dòng hồng cầu, GMP= granulocyte–macrophage progenitor: tế bào đầu<br /> dòng bạch cầu hạt- đại thực bào; MEP= megakaryocyte erythroid progenitor= tế bào đầu dòng hồng cầu- tiểu cầu, MkP=<br /> megakaryocyte progenitor: tế bào đầu dòng tiểu cầu, TNK= T-cell natural killer cell progenitor: tế bào đầu dòng NK và<br /> lympho T; Primitive progenitor cell: tế bào đầu dòng nguyên thủy; Commited precursor cell: tế bào đầu dòng tiền phân hóa;<br /> Lineage commited cell: tế bào đã biệt hóa theo dòng.<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> 19<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Sự tăng trưởng của những tế bào gốc dòng<br /> tạo máu theo hướng dòng tủy (myeloid linages)<br /> đã được chứng minh nhờ vào một số cytokine<br /> chính yếu sau (Hình 1):<br /> - Yếu tố tế bào gốc (stem cell factor- SCF):<br /> điều hòa giai đoạn đầu của quá trình tạo máu.<br /> - Yếu tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt:<br /> Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF).<br /> - Interleukin 3 (IL-3): liên quan đến sự tăng<br /> sinh và biệt hóa của nhiều tế bào đầu dòng<br /> trong quá trình tạo máu.<br /> - Interleukin 6 (IL-6): kích thích những tế bào<br /> vẫn còn khả năng biệt hóa thành dòng tủy, ức<br /> chế hướng biệt hóa dòng lympho(2).<br /> - Ngoài ra, Erythropoietin (EPO) cần thiết để<br /> những CMP biệt hóa thành hồng cầu và<br /> Thrombopoietin giúp những CMP biệt hóa<br /> thành mẫu tiểu cầu (megakaryocyte).<br /> Cũng theo y văn, trong những phương pháp<br /> nuôi cấy in vitro tế bào gốc dòng tạo máu, việc<br /> sử dụng hỗn hợp những cytokine tỏ ra hữu hiệu<br /> và an toàn. Đồng thời, chúng cũng thúc đẩy sự<br /> biệt hóa của những tế bào gốc và tế bào tạo máu<br /> đầu dòng (hematopoietic precusors). Do đó,<br /> trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng những<br /> tổ hợp cytokine để nuôi cấy và biệt hóa các tế<br /> bào CD34+ thành ba dòng tế bào: hồng cầu, bạch<br /> cầu hạt và tiểu cầu.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Thu nhận máu cuống rốn<br /> Máu cuống rốn được thu nhận từ các sản<br /> phụ đã được xét nghiệm âm tính với HIV, HBV,<br /> HCV… ở khoa sản Viện Cochin (Paris). Sau khi<br /> thai nhi vừa được sinh ra, tiến hành kẹp phần<br /> cuống rốn gần bụng và cắt trên vị trí kẹp 1 cm.<br /> Dùng kim tiêm của túi thu máu (có chứa sẵn<br /> chất chống đông máu) đưa vào cuống rốn ở vị<br /> trí gần nhau thai. Máu cuống rốn sẽ theo kim và<br /> ống dẫn chảy vào túi thu máu. Khi máu hết<br /> chảy, rút kim ra và mang túi chứa máu về<br /> phòng thí nghiệm.<br /> <br /> 20<br /> <br /> Nuôi cấy và biệt hóa tế bào<br /> Những tế bào CD34+ phân lập từ máu cuống<br /> rốn được nuôi cấy trong môi trường IMDM, bổ<br /> sung BIT 15% (StemCell Technologies) vốn là<br /> hỗn hợp gồm huyết thanh bò (Bovine serum<br /> albumin- BSA), Insulin và Transferrin. Đồng<br /> thời, các tế bào gốc này trưởng thành và biệt hóa<br /> với sự hiện diện của những cytokine tái tổ hợp:<br /> SCF; IL-3, EPO, IL-6 (cho dòng hồng cầu)(3); IL-3,<br /> G-CSF, Flt-3 (cho dòng bạch cầu hạt)(1,7); TPO<br /> (cho dòng tiểu cầu)(6). Hàng ngày, các tế bào<br /> được đếm số lượng, bổ sung môi trường và<br /> cytokine khi cần thiết.<br /> Môi trường nuôi cấy cũng được bổ sung<br /> Penicillin (100 U/ml), Streptomycin (100 μg/ml)<br /> và L- Glutamine (2 mM). Những tế bào được<br /> nuôi và biệt hóa ở điều kiện 370C, 5% CO2. Hàng<br /> ngày, các tế bào đều được đếm số lượng với<br /> buồng đếm và dưới kính hiển vi quang học để<br /> theo dõi sự tăng trưởng của chúng.<br /> <br /> Phân lập tế bào CD34+ từ máu cuống rốn<br /> Về nguyên tắc, máu trong cuống rốn luôn<br /> chứa ba loại tế bào chính: tế bào gốc tạo máu<br /> (HSC), tế bào máu trưởng thành và tế bào gốc<br /> trung mô. Các tế bào gốc trung mô và tế bào gốc<br /> tạo máu thuộc quần thể các tế bào đơn nhân.<br /> Tiến hành thu nhận quần thể tế bào đơn nhân<br /> bằng phương pháp li tâm trên gradient nồng độ<br /> Ficoll (Lymphoprep®, Thụy Điển) ở tốc độ 1.700<br /> vòng/phút, trong 30 phút. Sau đó, thu nhận<br /> phân đoạn chứa các tế bào đơn nhân nằm giữa<br /> lớp Ficoll và lớp huyết tương bên trên. Rửa tế<br /> bào với PBS và ủ 30 phút ở 4oC với FcR blocking<br /> solution và kháng thể kháng CD34. Phân lập các<br /> tế bào CD34+ nhờ hệ thống cột lọc MACS LS<br /> (Miltenyi Biotech, Đức).<br /> <br /> Phân tích tế bào bằng kỹ thuật tế bào dòng<br /> chảy (Flow cytometry)<br /> Kỹ thuật tế bào dòng chảy được thực hiện<br /> trên máy FACS Calibur cytometer (Becton<br /> Dickinson) với phần mềm Cell Quest. Kỹ thuật<br /> này cho phép đánh giá mật độ tế bào CD34+<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> phân lập từ máu cuống rốn và theo dõi động<br /> học của những dấu ấn miễn dịch CD34, CD36,<br /> GPA, CD14, CD15, CD11b, CD41a và CD42b tại<br /> ngày thứ 0, 4, 7, 11, 14 của quá trình biệt hóa tế<br /> bào gốc dòng tạo máu. Mỗi mẫu khảo sát gồm<br /> khoảng 20.000 tế bào nuôi cấy được rửa sạch với<br /> PBS-BSA. Ủ các tế bào cần khảo sát với kháng<br /> thể đặc hiệu cho từng dòng tế bào (hồng cầu,<br /> bạch cầu hạt, tiểu cầu) trong 20 phút, ở 4oC trước<br /> khi phân tích qua máy.<br /> <br /> KẾT QUẢ- BÀN LUẬN<br /> Hiệu quả của kỹ thuật phân lập tế bào<br /> CD34+ từ màu cuống rốn<br /> Để đánh giá tỷ lệ tế bào CD34+ trong quần<br /> thể tế bào phân lập được từ máu cuống rốn,<br /> 20.000 tế bào sau phân lập từ máu cuống rốn<br /> được ủ trực tiếp với kháng thể kháng CD34 có<br /> gắn allophycocyanine (APC). Kết quả phân tích<br /> qua máy FACS cho biết tỷ lệ tế bào CD34+ thực<br /> sự trong quần thể tế bào sau phân lập thường<br /> dao động trong khoảng 80%-95%. Chỉ những<br /> quần thể có tỷ lệ tế bào CD34+ trên 85% mới<br /> được tiến hành nuôi cấy và biệt hóa.<br /> <br /> Hình 2: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết quả tỷ lệ tế<br /> bào CD34+ phân lập từ máu cuống rốn.<br /> <br /> Biệt hóa thành dòng hồng cầu<br /> Những tế bào CD34+ trên được nuôi cấy<br /> trong môi trường IMDM, BIT 15%. Chúng nhân<br /> lên và biệt hóa dưới sự tác dụng của những<br /> cytokines tái tổ hợp: SCF, IL3, IL6. Vào ngày thứ<br /> 7 của quá trình biệt hóa, EPO được bổ sung vào<br /> môi trường nuôi giúp hoàn chỉnh sự biệt hóa<br /> dòng hồng cầu.<br /> Số lượng tế bào được đếm hằng ngày cho<br /> thấy có sự tăng khoảng gấp đôi dân số tế bào<br /> sau 24 giờ nuôi cấy.<br /> Kết quả phân tích những dấu ấn trên bề mặt<br /> tế bào bằng kỹ thuật tế bào dòng chảy cho thấy<br /> hàm lượng dấu ấn tế bào gốc là CD34 giảm dần<br /> và biến mất vào ngày thứ 11. Trong khi đó, GPA<br /> (dấu ấn đặc trưng cho dòng hồng cầu) và CD36<br /> (protein trên màng hồng cầu) lại dần tăng lên;<br /> bắt đầu tăng mạnh từ ngày thứ 7 và 11; cuối<br /> cùng, đạt tương ứng 88% và 100% ở ngày 14 của<br /> quá trình biệt hóa. Điều đó chứng minh rằng, tế<br /> bào đã mất dần tính năng tế bào gốc và biệt hóa<br /> hoàn toàn thành dòng hồng cầu sau 14 ngày<br /> nuôi cấy.<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br /> 21<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> percentage<br /> <br /> percentage<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Hình 3: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết quả tỷ lệ<br /> phần trăm của các dấu ấn CD34, GPA, CD36 trên bề<br /> mặt tế bào được biệt hóa từ tế bào CD34+ thành dòng<br /> hồng cầu vào ngày 0, 4, 7, 11, 14 của quá trình biệt hóa.<br /> <br /> Biệt hóa thành dòng bạch cầu hạt<br /> Chúng tôi sử dụng môi trường IMDM và bổ<br /> sung tổ hợp cytokine SCF, IL3, Flt-3 và G-CFS<br /> để hướng các tế bào CD34+ biệt hóa thành dòng<br /> bạch cầu hạt.<br /> Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy<br /> khi đếm quần thể tế bào được biệt hóa thành<br /> <br /> Hình 4: Kỹ thuật Flow cytometry cho kết quả tỷ lệ<br /> phần trăm của các dấu ấn CD34, CD15, CD14,<br /> CD11b trên bề mặt tế bào được biệt hóa từ tế bào<br /> CD34+ thành dòng bạch cầu hạt vào ngày 0, 4, 7, 11,<br /> 14 của quá trình biệt hóa.<br /> <br /> Biệt hóa thành dòng tiểu cầu<br /> Hỗn hợp cytokine bổ sung vào môi trường<br /> nuôi cấy để biệt hóa tế bào CD34+ thành dòng<br /> tiểu cầu bao gồm SCF và TPO.<br /> Số lượng tế bào cũng tăng lên gấp đôi sau 24<br /> <br /> dòng bạch cầu: số lượng tế bào nhân lên gấp đôi<br /> <br /> giờ nuôi cấy. Tuy nhiên, đến ngày 14-15, các tế<br /> <br /> sau 24 giờ. Tuy nhiên, đến ngày 24-26 của quá<br /> <br /> bào có dấu hiệu ngừng tăng trưởng và chết.<br /> <br /> trình biệt hóa, các tế bào không thể tiếp tục phát<br /> triển hay biệt hóa thêm.<br /> <br /> Chúng tôi theo dõi sự biệt hóa của các tế bào<br /> thành dòng megakaryocyte bằng nhóm kháng<br /> <br /> Phân tích động học các kháng thể trên màng<br /> <br /> nguyên: CD41a, CD42b. Phân tích các dấu ấn bề<br /> <br /> những tế bào này trong suốt quá trình biệt hóa<br /> <br /> mặt cho thấy: CD34 giảm rất nhanh trong quá<br /> <br /> cho thấy: CD34 giảm dần và biến mất vào ngày<br /> <br /> trình biệt hóa nhưng đến ngày 14 vẫn còn hiện<br /> <br /> 11; ngược lại, những dấu ấn chính của dòng<br /> <br /> diện 4,6%; trong khi đó, CD41a và CD42b tăng<br /> <br /> bạch cầu hạt như: CD14, CD15, CD11b tăng<br /> <br /> chậm trong 7 ngày đầu và cuối cùng đạt CD41a<br /> <br /> chậm trong 7 ngày đầu tiên, sau đó tăng rõ rệt<br /> <br /> 74%, CD42b 40% ở ngày 14 của quá trình biệt<br /> <br /> tiến đến 50%. Như vậy, quần thể tế bào gốc ban<br /> <br /> hóa. Như vậy, những tế bào này đã được biệt<br /> <br /> đầu đã được biệt hóa thành công thành những<br /> <br /> hóa hướng về dòng tiểu cầu.<br /> <br /> tế bào đầu dòng của dòng bạch cầu hạt.<br /> <br /> 22<br /> <br /> Hội Nghị KH KT Đại Học Y Phạm Ngọc Thạch Năm 2011<br /> <br />