Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa ) ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ LƢU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA CÂY BẰNG LĂNG NƢỚC

(LAGERSTROEMIA SPECIOSA) Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – năm 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ LƢU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA CÂY BẰNG LĂNG NƢỚC

(LAGERSTROEMIA SPECIOSA) Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành : Hóa Hữu Cơ

Mã số : 60440114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. TRẦN VĂN LỘC

Hà Nội – năm 2015

LỜI CẢM ƠN!

Luận văn tốt nghiệp cao học này được hoàn thành, em xin bày tỏ lòng biết ơn

chân thành và sâu sắc tới Viện Hóa học-Viện Hàn Lâm Khoa Học Công Nghệ Việt

Nam và Đại học Khoa Học Tự Nhiên-Đại học Quốc Gia Hà Nội ,đặc biệt là

TS.Trần Văn Lộc đã trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ em với những chỉ dẫn

khoa học quý giá trong suốt quá trình triển khai, nghiên cứu và hoàn thành luận

văn.

Em xin chân thành cảm ơn các cô chú anh chị em trong phòng Tổng hợp Hữu

Cơ- Viện Hóa Học đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo giúp đỡ em hoàn thành được

luận văn .

Em gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo của trường Đại Học Khoa học Tự Nhiên

đã trực tiếp giảng dạy, truyền đạt những kiến thức khoa học chuyên ngành cho em

trong những năm tháng qua.

Em xin ghi nhận công sức và những đóng góp quý báu, nhiệt tình của các cô

chú anh chị em trong phòng Tổng hợp Hữu cơ, thầy cô giáo và các bạn học viên

lớp cao học K24 đã đóng góp ý kiến và giúp em triển khai luận văn này.

Em xin chân thành cảm ơn!

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Lƣu

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1

CHƢƠNG 1 ..................................................................................................................... 2

TỔNG QUAN .................................................................................................................. 2

1.1. Đặc điểm chung của họ Lythraceae .......................................................................... 2

1.2. Đặc điểm chung của chi Lagerstroemia (Bằng lăng)[3] ........................................... 2

1.2.1. Lagerstroemia quinquevalvis Koehne. (Bằng lăng 5-mảnh) .......................... 2

1.2.2. Lagerstroemia indica L. (Bằng lăng sẻ) ......................................................... 3

1.2.3. Lagerstroemia floribunda Jack.(Bằng lăng nhiều hoa) .................................. 3

1.2.4.Lagerstroemia calyculata Kurz.(Bằng lăng tía hay Săng lẻ)[1] ...................... 4

1.2.5. Lagerstroemia crispa Pierre ex Lan. (Bằng lăng ổi) ..................................... 5

1.2.6. Lagerstroemia tomentosa Presl. ( Bằng lăng lông ) ....................................... 6

1.2.7. Lagerstroemia micrantha Merr. ( Bằng lăng hoa nhỏ ) .................................. 6

1.2.8. Lagerstroemia duperreana Pierre ex Lan. (Bằng lăng láng) .......................... 6

1.2.9. Lagerstroemia loudonii Teijsm. & Binn.(Bằng lăng vàng) ............................ 6

1.2.10. Lagerstroemia speciosa ( Bằng Lăng Nước )[5]........................................... 7

1.3.Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Bằng lăng............................................... 7

1.3.1. Nghiên cứu ở nước ngoài ................................................................................ 7

1.3.2. Nghiên cứu ở trong nước .............................................................................. 10

1.4. Hoạt tính sinh học .................................................................................................... 12

CHƢƠNG 2 ................................................................................................................... 16

NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................... 16

2.1. Nguyên liệu, hóa chất .............................................................................................. 16

2.2. Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................... 16

2.2.1. Phương pháp điều chế các phân đoạn ........................................................... 16

2.2.2. Phương pháp tách và tinh chế chất ............................................................... 17

2.2.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất ................................... 17

CHƢƠNG 3 ................................................................................................................... 18

THỰC NGHIỆM .......................................................................................................... 18

3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm .................................................................................... 18

3.2. Dung môi, hóa chất .................................................................................................. 18

3.3. Mẫu lá cây Bằng lăng nước ..................................................................................... 18

3.4.Tách và tinh chế các chất trong lá Bằng lăng nước (Theo sơ đồ 1 và 2) ................. 18

3.4.1. Phân lập các chất từ dịch chiết n-hexan (sơ đồ 2) ......................................... 20

3.4.2. Phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc .......................................................... 20

3.4.3. Số liệu phổ của các chất tách được ............................................................... 21

CHƢƠNG 4 ................................................................................................................... 23

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................................... 23

4.1. Xác định cấu trúc của các chất phân lập được ........................................................ 23

4.1.1.chất 16(β-sitosterol) ....................................................................................... 23

4.1.2. Chất 17 : quercetin ........................................................................................ 27

4.1.3. Chất 18: Chất 18: β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (BL5.3) ............... 34

4.1.4. Chất 19 : axit asiatic ...................................................................................... 39

4.1.5. Chất 20: axit corosolic ................................................................................. 42

4.2. Định lượng axit asiatic và axit corosolic bằng sắc ký lỏng cao áp.......................... 50

4.2.1.Định lượng axit asiatic ................................................................................... 51

4.2.1.1. Chuẩn bị mẫu: ............................................................................................ 51

4.2.1.2. Kết quả định lương các mẫu phân tích: ..................................................... 52

4.2.2.Định lượng axit corosolic ............................................................................... 55

4.2.2.1.Chuẩn bị mẫu : ............................................................................................ 55

4.2.2.2. Kết quả định lương các mẫu phân tích: ..................................................... 56

KẾT LUẬN ................................................................................................................... 60

1. Kết luận ....................................................................................................................... 60

2. Kiến nghị .................................................................................................................... 60

TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 61

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

J : Hằng số tương tác (NMR)

δ : Độ dịch chuyển hóa học (NMR)

br : Broad (NMR)

COSY : Correlation Spectroscopy

d : Doublet (NMR)

DEPT : Distortionless enhancement by polarsation transfer

DMSO : Dimethyl sulfoxide

DMSO – d6 : DMSO đã được đơteri hóa

D2O : Nước đã được đơteri hóa

EtOAc : Ethyl acetate

FT : Fourier transform

IR : ( Phô hồng ngoại)

HMBC : Heteronuclear multiple bond correlation

HSQC : Heteronuclear single quantum coherence

m : Multiplet (NMR)

MS : Mass spectrometry

NMR : Nuclear magnetic resonance

ppm : Parts per million

Rf : Retention factor

s : Singlet (NMR)

t : Triplet (NMR)

UV : Utraviolet

DANH MỤC CÁC BẢNG

Nội dung Trang Số TT

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của các hợp chất DS8 (16) và Bảng 4.1: 23 β-sitosterol

29 Bảng 4.2: Số liê ̣u phổ 13C-NMR củ a chất 17 và Quercetin

Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của các chất 19, 20 axit Bảng 4.3: 43 corosolic và axit asiatic

Công thức các hợp chất phân lập được từ lá cây Bằng lăng Bảng 4.4: 49 nước

Bảng 4.5: Kết quả định lượng axit Asiatic chuẩn 51

Bảng 4.6: Kết quả định lượng axit Asiatic trong mẫu cao BL02 54

Bảng 4.7: Kết quả định lượng axit Corosolic chuẩn 55

Bảng 4.8: Kết quả định lượng axit Corosolic trong mẫu cao BL02 59

Hàm lượng corosolic axit và asiatic trong các mẫu cao Bằng Bảng 4.9: 59 lăng nước bằng phương pháp HPLC

DANH MỤC CÁC HÌNH

Số TT Nội dung Trang

Hình 1.1 Lagerstroemia indica L. 3

Hình 1.2 Lagerstroemia floribunda Jack. 3

Hình 1.3 Lagerstroemia calyculata Kurz. 4

Hình 1.4 Lagerstroemia crispa 5

Hình 1.5 Lagerstroemia tomentosa 6

Hình 1.6 Lagerstroemia macrocarpa 7

Hình 1.7 Lagerstroemia speciosa 7

Hình 4.8. 25 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất β-

Số TT Nội dung Trang

sitosterol

Hình 4.9 26 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất β- sitosterol

Hình 4.10. Phổ IR của chất Quercetin 30

Hình 4.11. Phổ 1H-NMR của chất Quercetin 31

Hình 4.12. Phổ 13C-NMR của chất Quercetin 32

Hình 4.13. Phổ DEPT và 13C-NMR của chất Quercetin 33

Hình 4.14. Phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) của chất 18 36

Hình 4.15. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của chất 18 37

Hình 4.16. Phổ DEPT và 13C-NMR của chất 18 38

Hình 4.17. 39 Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của chất 19 (Axit asiatic)

Hình 4.18. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 19 (Axit asiatic) 40

Hình 4.19. Phổ khối ESI-MS của chất 19 (Axit asiatic) 41

Hình 4.20. 45 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất axit corosolic

Hình 4.21. 46 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất axit corosolic

Hình 4.22. 47 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất axit corosolic

Hình 4.23. Phổ khối MS của chất axit corosolic 48

PHỤ LỤC SƠ ĐỒ

Số TT Nội dung Trang

19 1 Sơ đồ 1: Chiết, tách các chất từ dịch chiết cồn 70% của cây bằng lăng nước

19 2 Sơ đồ 2 : Chiết, tách các chất từ dịch chiết cồn 70% của cây bằng lăng nước

PHỤ LỤC PHỔ

Số TT Nội dung Trang

1 66

2 67

3 68

4 69

5 70

6 71

7 72

8 73

9 74

10 75

11 Phụ lục 1: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất β- sitosterol Phụ lục 2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất β-sitosterol Phụ lục 3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất β-sitosterol Phụ lục 4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất β-sitosterol Phụ lục 5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất β-sitosterol Phụ lục 6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất β-sitosterol Phụ lục 7. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR, DEPT của chất β-sitosterol Phụ lục 8. Phổ 1H-NMR của chất 17 Phụ lục 9. Phổ 1H-NMR của chất 17(giãn rộng) Phụ lục 10. Phổ 13C-NMR của chất 17 Phụ lục 11: Phổ DEPT và 13C-NMR của chất 17 76

Phụ lục 12. Phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) của chất 12 77 BL5.3

Phụ lục 13. Phổ 1H-NMR giãn (DMSO, 500 MHz) của chất 13 78 18

14 79 Phụ lục 14. Phổ 1H-NMR giãn (DMSO, 500 MHz) của chất 18

15 Phụ lục 15. Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của chất 18 80

16 81 Phụ lục 16. Phổ 13C-NMR giãn (CDCl3, 125 MHz) của chất 18

Phụ lục 17. Phổ 13C-NMR giãn (CDCl3, 125 MHz) của 17 82 chất 18

18 Phụ lục 18. Phổ DEPT và 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) 83

Số TT Nội dung Trang

của chất 18

Phụ lục 19. Phổ DEPT và 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) 19 84

20 85

của chất 18 Phụ lục 20. Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của (Axit asiatic) Phụ lục 21. Phổ 13C-NMR - DEPT của chất 19 (Axit asiatic) 21 86

22 87

23 88

24 89

25 90

26 91

27 92

28 93

29 94

30 95 Phụ lục 22. Phổ khối ESI-MS của chất 19 (Axit asiatic) Phụ lục 23. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất axit corosolic Phụ lục 24. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR giãn của chất axit corosolic Phụ lục 25. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR giãn của chất axit corosolic Phụ lục 26. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất axit corosolic Phụ lục 27. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR giãn của chất axit corosolic Phụ lục 28. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR giãn của chất axit corosolic Phụ lục 29. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR – DEPT của chất axit corosolic Phụ lục 30. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR – DEPT giãn của chất axit corosolic

31 Phụ lục 31. Phổ khối MS của chất axit corosolic 96

MỞ ĐẦU

Từ xưa đến nay, những cây thuốc dân gian đóng vai trò hết sức quan trọng

trong đời sống hàng ngày của chúng ta. Từ khi ngành hóa dược chưa phát triển,

nhiều cây cỏ trong tự nhiên đã được con người sử dụng rộng rãi để chữa bệnh.

Nhiều loại bệnh đã được chữa khỏi nhờ các loại thảo dược quý. Nhưng người sử

dụng chưa biết nhiều về những hợp chất tự nhiên chứa trong các loài thảo dược đó.

Vì thế là một nhà khoa học, chúng ta có nhiệm vụ nghiên cứu các hợp chất tự nhiên

có hoạt tính sinh học, để có phương pháp khai thác hợp lí, tránh tình trạng khai thác

bừa bãi làm cạn kiệt nguồn tài nguyên quý báu.

Bằng lăng là một loài thực vật có nhiều ở Việt Nam. Ngày nay, Bằng lăng

được trồng ngày một nhiều hơn, hầu như ở các công trình công cộng lúc nào cũng

có mặt cây Bằng lăng như một loài cây cảnh và để che bóng mát. Trong các loài

Bằng lăng thì cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa), một loài cây ở Đông

Nam Á thường được gọi là Banaba (tiếng Philippin), được truyền thống người

Philippin sử dụng dưới các hình thức khác nhau để điều trị bệnh tiểu đường và một

số bệnh liên quan. Trong những năm 1990, sự phát triển của thảo dược này bắt đầu

thu hút những nhà khoa học trên thế giới. Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên

cứu cô lập được nhiều hợp chất từ cây Bằng lăng nước. Trong đó, axit Corosolic

được cô lập từ lá Bằng lăng nước có hoạt tính chữa bệnh đái tháo đường. Chất trích

ly từ lá Bằng lăng nước thường tìm thấy trong các thuốc bổ sung đa thành phần để

chữa bệnh đái tháo đường, giảm béo[8]. Đến nay, thế giới đã công bố nhiều công

trình nghiên cứu về cây Bằng lăng nước, đặc biệt là ở một số nước phát triển như:

Mỹ, Nhật …Tuy nhiên, ở Việt Nam các nghiên cứu về loài thực vật này còn chưa

nhiều. Do đó, tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bằng lăng

nước (Lagerstroemia speciosa ) ở Việt Nam”.

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN

1.1. Đặc điểm chung của họ Lythraceae

Họ Lythracea là danh pháp của một họ thực vật có hoa. Họ này có khoảng

620 loài, 32 chi, chủ yếu là thân thảo, với một ít loài là cây bụi hoặc cây thân gỗ. Họ

Lythraceae phân bố phần lớn các loài ở vùng nhiệt đới, ít phổ biến hơn ở vùng khí

hậu ôn đới. Họ Lythraceae có hai tông lớn là: Lythreae và Lagerstroemia.

1.2. Đặc điểm chung của chi Lagerstroemia (Bằng lăng) [3]

Chi Lagerstroemia (Bằng lăng) là một chi thực vật quan trọng và phổ biến

trong họ Lythraceae. Đặc điểm chung của chi này là cây thường rụng lá sớm, thân

gỗ có nguồn gốc ở vùng Đông Nam Á. Chi này có nhiều loài được ứng dụng trong y

học cổ truyền để điều trị bệnh tiểu đường và khá nhiều bệnh khác như trị tiêu chảy,

chống ôxi hóa, giảm mỡ máu, kháng khuẩn. Ở nước ta, chi Lagerstroemia là chi

thảo mộc khá lớn, mọc nhiều nhất ở các rừng Đông Nam Bộ. Ngày nay, chi này

được trồng rải rác nhiều nơi dùng làm cây cảnh, che bóng mát....

Chi Lagerstroemia có trên 20 loài, xin giới thiệu khái quát vài nét của một số

loài đặc trưng đã và đang được nghiên cứu ở Việt Nam.

1.2.1. Lagerstroemia quinquevalvis Koehne. (Bằng lăng 5-mảnh)

Đại mộc nhỏ; thân có vài gai to; nhánh không gai. Lá có phiến xoan to 5-

7x3,5-5,5cm, mặt dưới trăng trắng, gân phụ 7cặp; cuống 5– 6mm. Chùm tụ tán cao

20cm, lúc mang trái, đài có lông dày hay như nhung, có 6 sóng cạnh. Nang xoan

cao 2 cm, có nhăn mịn dọc; mảnh 5; hột cao 15mm (luôn cánh).

1.2.2. Lagerstroemia indica L. (Bằng lăng sẻ)

Cây gỗ nhỏ cao 3 – 6m, vỏ

xám đen, nứt mịn. Lá có phiến

xoan, không lông, dài 3 – 3.5cm,

rộng 2.5 – 4cm. Chùm hoa ở ngọn

nhánh; nụ hoa tròn, không lông,

hoa màu hồng nhạt to 1,5 – 2cm,

dúng, có cuống 3 – 7mm; nhị

nhiều; bầu không lụng. Quả nang

hình cầu, 1cm, hạt dài 1cm, có

cánh. Ra hoa vào mùa hạ. Hình 1.1. Lagerstroemia indica L.

Cây có hoa đẹp thường được trồng

làm cây cảnh. Vỏ dùng trị sốt, phấn khích.

1.2.3. Lagerstroemia floribunda Jack.(Bằng lăng nhiều hoa)

Cây gỗ to, cao 10 -15m. Lá

phiến bầu dục, hai đầu tà, không

lông, dai, cứng. Chùm tụ tán đứng

ở ngọn nhánh với hoa trắng và hoa

tim tím trộn nhau, trục có lông

mịn, màu vàng; nụ hình bông vụ,

có 12 sóng thấp; cánh hoa 1,5cm,

dúng; tiểu nhụy nhiều. Nang tròn

dài, cao 12 – 16mm, nở làm 5

mảnh; hạt dài 11mm. Hình 1.2.Lagerstroemia floribunda Jack.

Cây có hoa đẹp được trồng

làm cây cảnh và cho gỗ tốt dùng trong xây dựng, đóng đồ đạc, làm ván, làm đồ mĩ

nghệ....

1.2.4.Lagerstroemia calyculata Kurz.(Bằng lăng tía hay Săng lẻ)[1]

Cây gỗ to, cao 20 – 30m,

cành non có cạnh và lông hình sao

màu hung, cành già hình trụ, nhẵn.

Lá mọc so le, hình mác, dài 7 –

14cm, rộng 2 – 5cm, gốc thuôn, đầu

nhọn, phiến dài, mặt trên lúc đầu có

lông hình sao, sau nhẵn mặt dưới

lông dày hơn, gân lá chằn chịt tạo

thành mạng rõ, cuống lá ngắn có

lông mịn. Hình 1.3.Lagerstroemia calyculata Kurz.

Cụm hoa tận cùng mọc

thành chùm, có lông màu vàng, dài 12 – 20cm, lá bắc rõ, hoa màu trắng tập hợp 6 –

8 cái ở một mấu, đài hình chuông, có lông, 6 thùy; cánh hoa 6, có móng; nhị nhiều

gần đều nhau; bầu có lông ở đỉnh, vòi nhụy dài.

Quả nang, hình trứng, dài 1,2cm, nằm sâu 1/3 trong đài, đầu có mũi nhọn,

khi chín nứt thành 6 mảnh. Mùa ra hoa quả tháng 5 – 7.

Bằng lăng tía là một trong số ít loài phân bố tương đối phổ biến ở một số tỉnh

Miền Bắc và Miền Nam như Sơn La, Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Bình, các tỉnh

Tây Nguyên và Tây Nam Bộ. Độ cao phân bố thường dưới 800m. Cây còn thấy

nhiều ở Lào, Campuchia.Cây ra hoa quả nhiều hàng năm, khả năng tái sinh từ hạt

và từ gốc sau khi chặt khá tốt.

Vỏ cây Bằng lăng tía có chứa alcaloid, flavonoid, saponin, tanin và sterol

tanin. Trong vỏ chủ yếu là tanin catechic 23% và một lượng nhỏ tanin gallic 7%.

Ngoài ra còn có đường, chất nhầy, gôm và pectin. Gôm và chất nhầy trong lá cao

hơn trong vỏ, thân, còn tỉ lệ tanin trong lá ít hơn trong vỏ. Do đó, Vỏ cây Bằng lăng

tía được thu hái quanh năm, tốt nhất vào mùa thu, đem về cạo vỏ ngoài, phơi hoặc

sấy khô.

Đồng bào các dân tộc Ba Na, Gia Rai ở Tây Nguyên đã dùng nước sắc vỏ

cây Bằng lăng tía để rửa đắp vết thương, vết bỏng, chữa lị và ghẻ lở. Nhân dân miền

Trung đã dùng cao Bằng lăng tía phối hợp với lá ổi, lá sim để chữa vết thương, chữa

hắc lào. Để chữa các bệnh ngoài da, dùng cao chiết với cồn 60% vỏ cây Bằng lăng

tía 15% bôi trên da nơi bị bệnh.

Một số bài thuốc được dân gian dùng chữa bệnh:

Chữa tiêu chảy, kiết lị: Vỏ, thân lá Bằng lăng tía (20-30 g) cắt nhỏ, phơi khô,

đem sắc với 400 ml nước còn lại khoảng 100 ml, uống ngày 2 lần. Có thể tán thành

bột hoặc nấu cao rồi bào chế thành viên để uống.Thời gian dùng khoảng 7 đến 10

ngày.

Chữa bỏng: Cân khoảng 300 g vỏ thân Bằng lăng tía tươi. Lấy 100g đun sôi

với nước cho đặc dùng để rửa vết thương. Lượng còn lại 200 g thái nhỏ, đun sôi với

nước rồi lọc và đem cô thành cao lỏng, ngày bôi 2 – 3 lần. Lớp cao bôi lên vết

thương sẽ se lại thành lớp màng mỏng, có độ mềm và dai, tránh được bụi bẩn bám

trên vết thương nên không cần phải băng, do đó tránh gây đau đớn cho người bị

thương lúc thay băng.

1.2.5. Lagerstroemia crispa Pierreex Lan. (Bằng lăng ổi)

Loài cây gỗ lớn, rụng lá vào mùa

khô, cao khoảng 35 m, thân to 60 cm;

nhánh non có 4 cạnh thấp, có lông mịn.

lá đơn, mọc đối, hình trứng rộng, thuôn,

dài 4 – 15 cm; rộng 3 – 5 cm. Phiến lá

dày, cứng, mặt trên xanh lục thẫm, mặt

dưới hơi nhạt hơn, có lông dày. Chùm

hoa ở ngọn nhánh, hẹp, cao 15 – 20 cm;

Hình 1.4.Lagerstroemia crispa đài không lông, cao 12 mm, có 6 cánh

dúng; cánh hoa dài 5 mm; tiểu nhụy

nhiều; noãn sào không lông. Nang tròn tròn, to 1 cm.

Bằng lăng ổi có hoa nhiều màu đẹp nên thường được trồng làm cây cảnh.

1.2.6. Lagerstroemia tomentosa Presl. ( Bằng lăng lông )

Cây gỗ lớn, rụng lá vào mùa khô

hàng năm, cao khoảng 15 – 20 m.Thân

thẳng tròn, gốc có nhiều múi. Tán lá

thưa, cành khẳng khiu, lá có phiến to,

dài 10 – 24 cm, mặt dưới đầy lông hình

sao vàng, gân phụ 8 – 12 cặp. Chùm tụ

tán cao khoảng 6 – 20 cm, đầy lông

vàng; lá hoa mau rụng; nụ có 12 sóng;

đài 6 thùy; cánh hoa 15 mm; noãn sào Hình 1.5.Lagerstroemia tomentosa có lông. Nang cao 12 – 17 mm; 6 mảnh;

hạt có cánh.Cây trồng nhiều ở Nghệ Tĩnh, Thanh Hóa, Quảng Bình, Huế. Cây cho

gỗ tốt thường dùng làm các sản phẩm hàng mỹ nghệ đồ mộc cao cấp như trạm trổ,

khắc tượng, đóng bàn ghế, tàu thuyền…

1.2.7. Lagerstroemia micrantha Merr. ( Bằng lăng hoa nhỏ )

Tiểu mộc. Lá có phiến nhỏ, dài 5 – 8 cm, lúc non có lông mịn, sau chỉ còn

lông ở gân chính, gân phụ 4 -6 cặp; cuống 3 mm. Chùm tụ tán ở ngọn, có lông nâu

nâu; nụ tròn, to 3 mm, có 12 sóng; đài 6 thùy; cánh hoa nhỏ 2 mm; noãn sào không

lông.

1.2.8. Lagerstroemia duperreana Pierre ex Lan. (Bằng lăng láng)

Cây gỗ cao khoảng 30 m; nhánh non tròn, không lông. Lá dày, dai, không

lông, đầu tròn hay lõm, gân phụ 9 – 13 cặp, từu từ hẹp trên cuống ngắn. Chùm tụ

tán cao đến 40 cm; nụ đầy lông, có 6 u nhỏ; đài có sọc mịn dọc, thùy có lông ở phần

trên; cánh hoa 15 mm, màu tím tím. Trái cỡ 15 mm, 6 mảnh, hột dài 1 cm.

1.2.9. Lagerstroemia loudonii Teijsm. & Binn.(Bằng lăng vàng)

Cây gỗ nhỏ, vỏ màu xám, nhành non vuông. Lá có phiến dày, không lông

mặt trên, có lông mịn vàng vàng mặt dưới, gân phụ làm thành một mạng mịn, lồi.

Chùm tụ tán ở chót nhánh, cao 20 – 30 cm; nụ tròn, đầy lông; cánh hoa hường, to

1,5 – 2 cm; noãn sào đầy lông. Nang cao 1,5 – 2,2 cm; hột luôn cánh dài 1,5 cm.

1.2.10. Lagerstroemia speciosa ( Bằng Lăng Nƣớc ) [5]

Bằng lăng nước có tên khoa học Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.thuộc họ

Bằng lăng (Lythraceae), Bằng lăng nước (tiếng Philippin: Banaba, tiếng

Campuchia: Banglang, tên Ấn Độ: Pride of India) hay còn được gọi là Bằng lăng

tiên. Cây gỗ lớn thân cao từ 10 – 15 m vỏ nứt màu nâu đen. Tán lá rậm, hình chóp,

rụng vào mùa khô (cành mềm hơi rũ xuống). Lá hình bầu dục, tròn ở gốc, nhọn

ngắn ở chóp, cứng nhẵn, dài 10 – 20 cm, rộng 5 – 9 cm, cuống to dài 5 – 7 mm.

Cụm hoa chùm, mọc ở đỉnh cành, hình tháp tán. Hoa có 5 – 6 đài dính, cánh tràng

màu hồng nhạt gồm 5 – 6 cánh dúng, tiểu nhụy nhiều. Quả nang, hình trứng, kích

thước 20 x18 mm. Hạt có cánh mềm. Quả nang cắt vách hơi tròn dạng trứng, lá đài

còn lại xòe ra, quả dài 1,5 – 2cm, rộng 1 – 1,5 cm cứng, bên ngoài hơi nhám, hạt có

cánh mỏng, có đường kính 12 – 15 mm. Ra hoa vào tháng 4.

Hình 1.6. Lagerstroemia macrocarpa Hình 1.7. Lagerstroemia speciosa

1.3.Nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Bằng lăng

1.3.1. Nghiên cứu ở nƣớc ngoài

Các loài thực vật thuộc chi Lagerstroemia phân bố rộng và có nhiều loài

được dùng trong Y học. Do vậy, đã có nhiều công trình nghiên cứu về chúng và chỉ

ra rằng, đây là một chi thực vật chứa nhiều tanin và ancaloit.

Theo dõi trên Chemical Abstract cho đến năm 1999 cho thấy: Phần lớn các công

trình nghiên cứu về cây Bằng lăng nước tập trung vào các hướng sau:

- Nghiên cứu thành phần hóa học của lá cây.

- Nghiên cứu công dụng của một số hợp chất có trong lá để chữa bệnh.

Năm 1961, Carew D.P và Chin T.F [11] đã làm các thí nghiệm để kiểm tra

một số nhóm chất có trong lá Bằng lăng nước ở Philippin và đã đi đến kết luận:

Trong lá có tanin, glucosit trợ tim, flavonoit và sterol không có ancaloit. Kết quả

của các nghiên cứu khác cho thấy, thành phần hóa học của chi Lagerstroemia

bao gồm: Axit béo và dẫn xuất, các tecpenoit, các ancaloit và tanin, v.v…

Một số nghiên cứu khác cho thấy, trong hạt cây Bằng lăng nước có chứa axit

(Z)-9-oxooctadec-11-enoic [19], trong lá có các amino axit như isoleuxin, alanin,

axit α-aminobutyric và methionin [11].

+ Tecpenoit

Từ cây Bằng lăng nước đã phân lập được một số tecpenoit như:

stigmast-4-en-3,6-diol, lagerstronolit, lagerenol, lagerenyl axetat [13].

+ Ancaloit [9,16,18]

Kết quả của những công trình nghiên cứu về loài Lagerstroemia indica Linn

cho biết, thành phần hóa học chủ yếu của loài này là các ancaloit. Một số ancaloit

đã được phân lập là: Lagerin , o-metyllagerin.

Khi nghiên cứu lá loài Lagerstroemia subcostata Iida. H. và CominsD.L đã

phát hiện một số ancaloit khác nhau: Subcosin I , lasubin I , lasubin II, subcosin II

[12].

+ Tanin

Trong lá, vỏ của cây Bằng lăng nước đều có chứa tanin với thành phần rất

phong phú và đa dạng, nhất là ở lá. Những tanin được phân lập từ lá, vỏ là dẫn xuất

của axit gallic và catechin [23].

Một số hợp chất cô lập được từ lá ba loài Bằng lăng [17]: Lagerstroemia calyculata,

Lagerstroemia floribunda và Lagerstroemia tomentosa

1. Dihydro-β-cyclopyrethrosin 2. Clauslactone-K

5. R1= H, R2= OH : Acid 3β,29-dihydroxy-olean-12-en-28-oic

6. R1= OH, R2= H : Acid arjunolic

Một nghiên cứu khác về loài Lagerstroemia indica cho biết thành phần hóa

học chủ yếu của loài này là các ancaloit. Một số ancaloit đã được phân lập là:

Lagerin(9), o-metyllagerin(10), dihydroverticillatin(11), vertin(12), decamin(13).

1.3.2. Nghiên cứu ở trong nƣớc

Năm 2001, PGS.TS.Đỗ Đình Rãng cùng các cộng sự trường ĐHSP Hà Nội

đã phân tích các lớp chất có trong lá, vỏ và thử hoạt tính sinh học dịch chiết của

chúng. Các thí nghiệm đã chứng minh rằng dịch chiết lá cây Bằng lăng nước có

phản ứng dương tính với FeCl3 và thuốc thử Libermann-Buchardt, còn dịch chiết

vỏ cây chỉ có phản ứng dương tính với FeCl3.Điều đó chứng tỏ trong lá cây này có

chứa tanin và sterol, còn trong vỏ có chứa tanin.

Thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, nhóm tác giả này đã cho biết:

Dịch chiết lá Bằng lăng nước chỉ có khả năng kháng một loại vi khuẩn là E.coli; còn

dịch chiết của vỏ có hoạt tính kháng 2 loại vi khuẩn là E.coli và B. subtillis.

Năm 2011 nhóm nghiên cứu của Nguyễn Quyết Tiến & cộng sự Viện Hóa

học Viện Hàn Lâm Khoa học CNVN đã phân lập được 5 hợp chất ( 1-5) từ lá cây

bằng lăng nước thu hái tại Từ Liêm, Cầu Giấy, Hà Nội [2].

Năm 2012 Tôn Nữ Liên Hương và cộng sự trường Đại học Cần Thơ trong

quá trình khảo sát hóa học vỏ cây bằng lăng nước trồng tại kí túc xá đã cô lập và

định danh được ba chất [4]: stigmasterol (C29H48O) (1), acid betulinic (C30H48O3)

(14) và hợp chất oleana-9(11),12-dien-3-ol (C30H48O) (15).

14. axit Betulinic 15. Oleana-9(11),12-dien-3-ol

1.4. Hoạt tính sinh học

Y học truyền thống Châu Á dùng lá Bằng lăng nước làm trà uống để trị đau

bao tử và bệnh tiểu đường [8]. Các chất trích li đã được thương mại hóa và đôi khi

cũng được dùng làm giảm bớt béo phì. Chất trích từ lá Bằng lăng nước, ví dụ như

cortislim, thường dùng trong các thuốc bổ sung đa thành phần để làm giảm cân.

Ở Việt Nam, cây Bằng lăng mọc nhiều ở khu vực miền Bắc Trung Bộ, Đông

Nam Bộ và Tây Nguyên. Trên thế giới Bằng lăng nước phân bố ở các nước vùng

Nam và Đông Nam Á như: Myanma, Malaysia, Thái Lan, Lào, Campuchia,

Philippines. Ở Nam Trung Quốc, Ấn Độ và Australia cũng gặp loài này. Theo Phạm

Hoàng Hộ (2000), trong y học người ta sử dụng lá Bằng lăng nước để trị bệnh tiểu

đường và béo phì, rễ trị sốt, vỏ cũng trị sốt, đau và loét dạ dày, trái đắp trị lở miệng.

Mặt khác cây Bằng lăng nước với hoa tím, bóng mát còn được trồng làm cây cảnh ở

đường phố, công sở, trường học. Trên thế giới đã có một số công trình nghiên cứu

về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học trên lá Bằng lăng nước, chủ yếu tập

trung vào nhóm hợp chất có tác dụng làm hạ đường huyết và nhóm hợp chất phân

cực. Ở nước ta cho đến nay chỉ thấy nghiên cứu về hoạt tính và công dụng của lá

mà chưa thấy công trình công bố nghiên cứu sâu về thành phần hóa học của cây

Bằng lăng nước. Cho nên việc nghiên cứu về thành phần hóa học của lá cây Bằng

lăng nước hiện nay ở nước ta là cần thiết và có nhiều ý nghĩa đối với hóa học.

Bằng lăng nước có nhiều công dụng làm thuốc tùy theo bộ phận dùng: Hạt

gây ngủ; vỏ thân và lá làm thuốc hãm uống trị tiêu chảy; rễ làm se, kích thích và hạ

nhiệt; quả dùng đắp ngoài trị bệnh áp-tơ miệng (tổn thương loét đau ở miệng); lá

được nhân dân các nước Philippine, Ấn Độ hãm uống như trà để chữa tiểu đường.

Nhiều nghiên cứu dược lý hiện đại trong và ngoài nước đã chứng minh thành phần

acid corosolic có nhiều trong lá và quả già Bằng lăng nước có tác dụng làm giảm

đường huyết và giảm béo phì. Hoạt chất này đã được nghiên cứu chiết xuất và sử

dụng rộng rãi làm thuốc chữa tiểu đường và béo phì tại nhiều nước trên thế giới.

Ngoài ra, các hợp chất tanin như ellagitannin, lagertannin, lagerstroemia trong lá

Bằng lăng nước cũng được chứng minh có tác dụng làm hạ đường huyết. Trong lá

còn chứa valoneic acid dilactone (VAD) được sử dụng như chất ức chế xanthine

oxidase làm giảm acid uric trong bệnh gout. Dịch chiết từ lá bằng lăng được chứng

minh có tác dụng đối với bệnh gout tốt hơn biệt dược Zylopzim (chứa allopurinol).

Trong các bộ phận của cây bằng lăng nước thì lá và quả già có tác dụng hạ đường

huyết tốt nhất. Lá non và hoa cũng có tác dụng chữa bệnh nhưng hiệu lực chỉ bằng

70% so với quả và lá già.

Vỏ Bằng lăng nước điều trị bệnh nấm ngoài da, bệnh lỵ trực khuẩn, chữa

bỏng; cao đặc vỏ cây bằng lăng tía có tác dụng làm se khô, giảm nhiễm khuẩn và

tạo màng thuốc che phủ các vết thương, không cần phải băng, tránh đau đớn cho

người bệnh khi thay băng.

Đầu năm 1940, Garcia đã công bố những nghiên cứu đầu tiên của mình về

khả năng làm giảm hàm lượng đường huyết của cao đặc từ Bằng lăng nước tương tự

như insulin.

Đến năm 1996, Kakuda đã nghiên cứu về hoạt tính ngăn ngừa bệnh tiểu

đường của dịch chiết từ cây Bằng lăng nước. Trong nghiên cứu này cho thấy dịch

chiết có thể làm giảm mức insulin, đường huyết và hàm lượng cholesterol trong

máu.

Một số bài thuốc có sử dụng cây bằng lăng nƣớc.

- Sử dụng lá và quả Bằng lăng nước:

+ Dạng trà thuốc: 50 g lá già hoặc quả khô hãm với 0,5 lít nước sôi, uống 4 – 6 cốc

mỗi ngày để phòng và chữa bệnh tiểu đường (20g) lá và quả khô trong 100 cc nước

có tác dụng tương đương với 6 - 7,7 đơn vị insulin).

+ Một số sản phẩm chứa cao khô Bằng lăng nước chuẩn hóa hàm lượng axit

corosolic 1% có liều dùng là 16 – 48 mg/ngày. Kết quả thử độc tính cho thấy cao

khô Bằng lăng nước tuyệt đối an toàn khi sử dụng và chưa có báo cáo về tác dụng

phụ được công bố. Tuy nhiên, cần lưu ý sử dụng thận trọng trong các trường hợp trẻ

em, phụ nữ có thai và cho con bú. Bệnh nhân tiểu đường đang sử dụng thuốc hạ

đường huyết nhóm sulfonylurea (Glypizide và Glyburide) cần phải điều chỉnh liều

nếu sử dụng kết hợp với sản phẩm chứa Bằng lăng nước.

- Sử dụng vỏ cây bằng lăng nước

+ Chữa tiêu chảy, kiết lỵ: Vỏ thân bằng lăng tía 20-30 g, cắt nhỏ, phơi khô, sắc với

400 ml nước còn 100 ml, uống làm 2 lần/ngày; có thể tán bột hoặc nấu cao rồi bào

chế thành viên để uống; dùng từ 7-10 ngày.

+ Chữa bỏng: Vỏ thân bằng lăng tía 300 g. Lấy 100 g nấu với nước cho đặc dùng

để rửa. Lượng còn lại 200 g, băm nhỏ, nấu với 2 lần nước, lọc rồi cô thành cao lỏng;

ngày bôi từ 2-3 lần. Lớp cao bôi lên vết thương sẽ se lại thành màng, có độ mềm và

dai, tránh được bụi bẩn nên không cần băng.

+ Chữa nấm da (hắc lào): Vỏ thân bằng lăng tía thái nhỏ, ngâm với cồn 600 với tỷ lệ

20-30%, dùng bôi vào vùng có nấm da hoặc hắc lào.

- Hoạt tính của axit asiatic

+ Hoạt tính gây độc tế bào và kháng ung thư của axit asiatic và asiaticosid:

Ya-ling Hsu và cộng sự ở khoa Dược, trường đại học Y, Cao Hùng, Đài

Loan lần đầu tiên nghiên cứu tác dụng chống ung thư của axit asiatic tách từ cây rau

má đối với hai dòng tế bào ung thư vú là MCF-7 và MDA-MB-231. Các tác giả này

thấy rằng axit asiatic ức chế mạnh sự tăng sinh tế bào thông qua việc làm ngừng chu

trình và gây ra giáng hoá (apoptosis) của tế bào ung thư ở giai đoạn S-G2/M. Quá

trình ngừng trệ chu trình phát triển tế bào ung thư được gắn với việc giảm lượng

P21/WAF1 và giảm lượng cyclin B1, cyclin A, Cdc2 và Cdc25C theo cách không

phụ thuộc vào P53 [28].

Trong bằng độc quyền sáng chế US 2004/0097463A1 năm 2004 các tác giả

đã sử dụng axit asiatic để điều trị ung thư. Các loại ung thư đã được nghiên cứu

điều trị bao gồm: ung thư biểu mô, ung thư vú, ung thư túi mật , ung thư bàng

quang, ung thư não, ung thư cổ, ung thư dạ dầy, ung thư màng tử cung, ung thư

thực quản, ung thư tuỷ xương. Ngoài ra, các hợp chất này còn được sử dụng điều trị

bệnh tăng sinh, ví dụ như bệnh vảy nến, u mỡ, u tuyến (ví dụ polyp nội kết), bệnh

đa u nang thận [26]. Nhìn chung liều dùng các hoạt chất axit asiatic dao động từ

0,01µg/kg/ngày đến 1000µg/kg/ngày. Tuy nhiên, liều từ 50-500 µg/kg/ngày là phù

hợp, ưu tiên bằng đường uống từ 1 đến nhiều lần /ngày. Trong một số trường hợp

có thể sử dụng kết hợp asiaticosid và axit asiatic cùng một chất mang thích hợp để

dễ sử dụng. Thuốc có thể được bào chế ở dạng viên nang cứng, viên nén, viên hình

thoi hoặc dạng sirô. Ngoài ra axit asiatic còn có thể được bào chế dưới dạng phóng

thích chậm, phóng thích theo thời gian... với các hệ chất mang khác nhau.

Yoshinati Ohnishi và cộng sự ở trường đại học Tokushima Nhật Bản đã

nghiên cứu hoạt tính hiệp đồng ức chế sinh trưởng của tế bào ung thư ruột kết HT-

29 khi sử dụng cùng với thuốc chống ung thư irinotecan hydrochlorid (CPT-11).

axit Asiatic có tính độc tế bào với tế bào HT-29 tuỳ theo liều lượng. Axit Asiatic

đẩy nhanh quá trình giáng hoá (apoptosis- tự chết của tế bào) HT-29 thông qua việc

hoạt hoá men caspase-3.

+ Các hoạt tính khác của axit asiatic

a) Axit asiatic có khả năng làm tăng hoạt tính của thuốc kháng sinh, ví dụ như của

thuốc Ciprofloxacin và Tabramycin với vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa [15].

b) Hoạt tính chống xơ vữa động mạch: Trong bằng độc quyền sáng chế đăng ký tại

Hoa Kỳ US 2007/0010459A1, Jan.11, 2007, nhóm nghiên cứu đã xử dụng axit

asiatic để điều trị bệnh xơ vữa động mạch và xơ vữa phổi trên động vật thực nghiệm

là chó và chuột cống. Các kết quả là rất khả quan [27].

c) Hoạt tính giảm đau và kháng viêm

d) Tác dụng chữa vết thương, vết bỏng:

Axit asiatic hỗ trợ điều trị vết thương qua việc làm tăng hàm lượng hydroxyprolin,

thành phần của peptid, tăng độ đàn hồi của cơ da, tăng sinh tổng hợp collagen, tăng

tạo mạch và tạo biểu mô [21].

CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, hóa chất

Nguyên liệu để nghiên cứu trong luận văn là: Lá cây Bằng lăng, được Công

ty Traphaco cung cấp năm 2014

Mẫu thực vật được phơi khô trong bóng râm, hoặc sấy ở 45oC trong tủ sấy,

để nguội, xay nhỏ và chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau như n-

hexan, etyl axetat, methanol và butanol.

Hóa chất :

+ Dung môi được cất lại qua cột trước khi dùng

+ Chất hấp phụ silica gel có cỡ hạt 0,063 mm, pha đảo RP18 và Sephadex LH20

dùng để chạy cột được mua của hãng Merck CHLB Đức và Aldrich, Hoa Kì.

+ Bản mỏng tráng sẵn trên nhôm với silica gel G60 có chất huỳnh quang F254 của

hãng Merck được dùng để kiểm tra quá trình tách trên cột và cũng như độ tinh

khiết của chất tách được.

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.2.1. Phƣơng pháp điều chế các phân đoạn

Lá cây Bằng lăng sau khi đã sấy khô và xay nhỏ được cân chính xác và chiết

với các dung môi có độ phân cực khác nhau theo hai cách:

+ Cách thứ nhất: Ngâm chiết với methanol ở nhiệt độ phòng. Rút dịch chiết và

thêm dung môi mới 3 lần, mỗi lần ngâm 4 giờ. Cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45oC ( bằng máy quay cất chân không). Cặn thu được được chế thêm

nước cất. Sau đó chiết lần lượt với n-hexan, etyl axetat và butanol. Các dịch chiết

được cất loại dung môi cho đến khi khô sẽ thu được các dịch chiết tương ứng để

nghiên cứu tiếp.

+ Cách thứ hai: Mẫu thực vật khô được chiết lần lượt với các loại dung môi n-

hexan, etyl axetat và butanol ở nhiệt độ phòng. Với mỗi loại dung môi được rút dịch

chiết và thêm dung môi mới ba lần. Mỗi lần ngâm ba tiếng, cất loại dung môi dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 45oC cho tới khô (sử dụng máy quay cất chân không) sẽ thu

được các cặn dịch chiết tương ứng để nghiên cứu tiếp.

2.2.2. Phƣơng pháp tách và tinh chế chất

Các cặn dịch chiết trong các dung môi khác nhau thu được được tách và tinh

chế bằng phương pháp sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng với các hệ dung môi thích hợp.

Sắc kí cột (SKC) gồm sắc kí cột thường và sắc kí cột nhanh (flash chromatography)

sử dụng silica gel. Đối với các chất phân cực có thể sử dụng Sephadex LH20 hoặc

pha đảo RP18. Trường hợp cần thiết có thể chạy cột lặp lại nhiều lần hoặc dùng

phương pháp kết tinh phân đoạn để tinh chế chất. Kiểm tra độ tinh khiết của các

chất cũng như kiểm tra quá trình chạy cột bằng sắc kí lớp mỏng (SKLM) với nhiều

0,4-0,6 ). hệ dung môi khác nhau để xác định Rf tối ưu ( Rf

2.2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hóa học của các chất

Việc xác định cấu trúc hóa học của các chất sạch được thực hiện thông qua

việc kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối

(MS), sắc kí lỏng cao áp gắn với khối phổ (LC/MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (1D và 2D NMR) như 1H, DEPT, COSY, HSQC và HMBC.

Trong trường hợp cần thiết sẽ điều chế dẫn xuất acetyl của những chất chứa nhóm

hydroxyl để khẳng định thêm cấu trúc của chúng.

CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM

3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm

- Phổ hồng ngoại (FT-IR) được ghi trên máy quang phổ hồng ngoại IMPACT 410-

NICOLET (Mỹ) củaViện Hóa học.

- Phổ khối ESI-MS được ghi trên thiết bị khối phổ LC/MSDA gilentseries 1100 của

Viện Hóa học.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500MHz của Viện Hóa học với TMS là chất chuẩn nội cho 1H- và tín hiệu dung môi làm chuẩn cho 13C-NMR.

3.2. Dung môi, hóa chất

Các dung môi được sử dụng để chiết tách và tinh chế là: n-hexan, etyl axetat,

diclometan, metanol và butanol

3.3. Mẫu lá cây Bằng lăng nƣớc

Trong luận văn này chúng tôi đi sâu vào tách, tinh chế và xác định cấu trúc của

một số thành phần hóa học trong dịch chiết n-hexan của lá cây Bằng lăng nước

3.4.Tách và tinh chế các chất trong lá Bằng lăng nƣớc (Theo sơ đồ 1 và 2)

1,6 kg lá Bằng lăng nước khô, xay nhỏ và ngâm chiết với EtOH /H2O=70%

(3 lần x 10lít) ở nhiệt độ phòng trong 8 h cho mỗi lần chiết. Quay cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt độ 500C, thu được 200 gam cặn. Cặn được hòa với MeOH/

H2O, chiết với n-hexan (3 lần x1lít), sau đó tiếp tục chiết với etyl axetat (3 lần x1lít)

và cuối cùng dịch nước được chiết bằng butanol (3 lần x 1lít). Quay cất dung môi dưới áp suất giảm, ở nhiệt độ 500C, thu được12 gam cặn n-hexan, 25 gam cặn

ethylacetat và 28 gam cặn butanol.

Lá Bằng lăng nước Nghiền nhỏ (1,6kg)

Chiết EtOH 70% x 3 lần, 70oC

Cất loại dung môi

Dịch chiết EtOH

Cồn thu hồi

Cặn dịch chiết 200 g

Sơ đồ 1: Chiết, tách các chất từ dịch chiết cồn 70% của lá bằng lăng nước

Cao chiết Bằng lăng (200 g)

Cất loại n-hexan

12 g cặn chiết n-hexan

BuOH

1. Hòa trong MeOH/nƣớc 2. Chiết với n-hexan Dịch nƣớc 3. Cất

n-hexan/EtOAc :95/5

Chiết với EtOAc

Dịch BuOH

Dịchnước

Cất loai EtOAc

Cất loai BuOH

25 g cặn EtOAc

Chất 16 β-Sitosterol 650 mg

28 g cặn

PĐ 5

n-hexan/EtOAc:95/5

PĐ3 3,5g

PĐ4 1,6g

PĐ2 172mg

n-hexan/EtOAc n-hexan/EtOAc MeOH/H2O PĐ1 180mg 180mg SK silica gel SK cột silica gel SK cột RP18 :95/5 :9/1

CH2Cl2/MeOH :9/1

Chất không sạch

Chất 20 BLE03 (0,65 g)

:8/1 Chất 19 BLE02 (2,5g)

Chất 17 GCLB17 65 mg

Chất 18 BL5.3 56 mg

Sơ đồ 2 : Chiết, tách các chất từ dịch chiết cồn 70% của lá bằng lăng nước

3.4.1. Phân lập các chất từ dịch chiết n-hexan (sơ đồ 2).

12 g cặn chiết n-hexan được đưa lên cột silica gel, giải hấp bằng dung môi n-

hexan/EtOAc (với EtOAc tăng dần: 5-20%) thu được 4 phân đoạn chính. Phân đoạn

2 tiếp tục tách trên trên cột silica gel (dung môi rửa giải: n-hexan: EtOAc (9:1) thu

được 650 mg chất 16.

3.4.2. Phân lập các chất từ dịch chiết EtOAc.

Phần dịch chiết EtOAc được khảo sát bằng sắc ký lớp mỏng silica gel Merck

60 F254 dày 0,25 mm tráng sẵn trên nền nhôm và thuốc hiện là H2SO4-vanilin. Sau

khi thử nghiệm với các hệ dung môi khác nhau để tìm hệ dung môi thích hợp cho

sắc ký cột, đã tìm thấy hệ dung môi phù hợp là n-hexan/EtOAc.

25 g cặn chiết EtOAc được hòa tan vừa đủ bằng CHCl3 và trộn với 30 gam silica

gel, quay cất đến khô, sau đó nghiền thành bột mịn để các chất hấp phụ đều trên

silica gel. Bột silica gel có tẩm dịch chiết này được sử dụng để đưa lên cột sắc ký.

Silica gel Merck (cỡ hạt 0,043- 0,063 mm; 600 gam) được nhồi vào cột sắc

ký có kích thước 8 cm x 90 cm theo phương pháp nhồi ướt với hệ dung môi n-

hexan/EtOAc = 95:5. Sau khi cột được nén bằng máy nén khí đã tương đối ổn định,

bột silicagel tẩm dịch chiết được đưa lên cột, và giải hấp với hệ dung môi rửa giải là

n-hexan/EtOAc có độ phân cực tăng dần. Quá trình rửa giải chúng tôi thu được 100

phân đoạn khác nhau, mỗi phân đoạn là 15 ml.100 phân đoạn này được gộp thành

6nhóm (F1-F6) theo kết quả kiểm tra trên sắc ký lớp mỏng như sau:

F1= (1-17) F4= (45-76)

F2= (18-35) F5= (77-84)

F3= (36-44) F6= (89-100)

- Nhóm F1 bao gồm phân đoạn từ 1-17 được cất loại dung môi dưới áp suất giảm,

thu được 180 mg cặn và được tinh chế lại một lần nữa bằng sắc ký cột nhanh, hệ

dung môi rửa giải là n-hexan: EtOAc = 95:5 thu được 60 mg chất 17 (ký hiệu là

GCLB17).

-Nhóm F2 bao gồm phân đoạn từ 18-35 được cất loại dung môi dưới áp suất giảm,

thu được 172 mg cặn và được tinh chế lại một lần nữa bằng sắc ký cột nhanh, hệ

dung môi rửa giải là n-hexan: EtOAc = 91:1 thu được 56 mg chất 18 (ký hiệu là

BL5.3).

- Nhóm F3 bao gồm phân đoạn từ 36-44 được cất loại dung môi dưới áp suất giảm,

thu được 3,5 g cặn và được tinh chế lại một lần nữa bằng sắc ký cột RP18, hệ dung

môi rửa giải là MeOH: H2O = 8:1thu được 2,5 g chất 19 (ký hiệu là BLE02).

- Nhóm F4 bao gồm phân đoạn từ 77- 84 được cất loại dung môi dưới áp suất giảm,

thu được 1,6 g cặn và được tinh chế lại một lần nữa bằng sắc ký cột nhanh, hệ dung

môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH= 9:1 thu được 0,65g chất 20 (ký hiệu là BLE03).

- Nhóm F5 bao gồm phân đoạn từ 86 - 100 được cất loại dung môi dưới áp suất

giảm, thu được 1,6 g cặn và được tinh chế lại một lần nữa bằng sắc ký cột nhanh hệ

dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH= 85:15. Các phân đoạn được kiểm tra trên bản

mỏng phân tích nhưng không thu được chất sạch.

3.4.3. Số liệu phổ của các chất tách đƣợc

*) Chất 16 β-sitosterol - Phổ 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)  (ppm), J (Hz): 0,68 (3H, s, CH3-18); 0,77

(3H, d, J = 6,6 Hz, CH3-27); 0,84 (3H, d, J = 6,6 Hz, CH3-26); 0,85 (3H, d, J = 7,0

Hz, CH3-21); 0,91 (3H, t, J = 6,4 Hz, CH3-29); 1,01 (3H, s, CH3-19); 3,52 (1H, m,

H-3α); 5,35 (1H, m, H-6).

*) Chất 17 (quercetin): - IR (KBr, cm-1): 3450 (OH), 1662 (C=O), 1614 (C=C), 1H-NMR (δ, CDCl3): 6.20

(1H, d, J = 1.9 Hz, H-6); 6.40 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-8), 6.90 (1H, d, J = 8.5 HZ, H-

5’), 7.65 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-6’), 7.75 (1H, J = 2.0 Hz, H-2’).

*) Chất 18: (β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyra- noside, Daucosterol).

- Phổ 1H – NMR(DMSO-d6, 500MHz) δ(ppm), J(Hz): 0,65(3H, s); 0,80(3H, d, J=6,9); 0,81(3H, d, J=6,8); 0,90(3H, d, J=6,5); 0,96 (3H, s); 1,00 (3H, d,J=6,7);

1,23(3H, s); 1,38-1,41 (5H, m); 1,43-1,49 (4H, m); 1,62-1,49 (1H, m); 1,90-1,97

(3H); 2,10-2,17 (1H, m); 2,34-2,38 (1H, m), 2,87-2,91 (1H, m), 3,05-3,08 (1H, m);

3,10-3,14 (3H, m); 3,38-3,48 (2H, m); 3,64 (1H, dd, J=5,5;10,1); 4,22(1H, d,

J=7,8); 4,39 (1H, t, J=5,7); 4,83 (3H, m); 5,32 (1H, d).

- Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) δ(ppm), J (Hz): 11,68; 11,78; 18,60;1 8,85;

19,14; 19,60; 20,93; 22,95; 24,14; 26,0; 28,08; 29,06; 29,54; 31,76; 33,84; 36,0;

36,59; 37,12; 38,60; 39,64; 42,20; 45,75; 48,45; 50,07; 55,95; 56,63; 61,80; 70,04;

73,42; 75,58; 76,25; 76,76; 100,98; 122,04; 140,15.

*) Chất :Axit corosolic - Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz)  (ppm): 47,0 (C-1), 67,1 (C-2), 82,2 (C-3), 39,1 (C-4), 54,7 (C-5), 18 (C-6), 32,6 (C-7), 39,2(C-8), 46,9 (C-9), 37,5 (C-10),

242,9 (C-11), 124,5 (C- 12), 138,2 (C-13), 41,7 (C-14), 27,5 (C-15), 23,8 (C-16),

47,0 (C-17), 52,3 (C-18), 38,4 (C-19), 38,5 (C-20), 30,1 (C-21), 36,3 (C-22), 28,8

(C-23), 17,1 ( C-24), 16,4 (C-25), 16,9 (C-26), 23,2 (C-27), 178,2 (C-28), 17,0 (C-

29), 21,0 (C-30).

*) Chất : Axit asiatic - Phổ IR (KBr) max (cm-1): 3411 (OH); 2930, 2866 (CH2, CH3); 1690 (COOH), 1459; 1053, 964 (=CH). - Phổ khối ESI-MS, ion dương; m/z = 487.1 [M - 1]+ (C30H47O5); M = 488 (ứng với công thức phân tử: C30H48O5). - Phổ 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)  (ppm): 0,71 ( 3H, s, CH3); 0,87 ( 3H, s, CH3); 0,91 (3H, d, J = 6,4 Hz, CH3); 0,99 (3H, s, CH3); 1,06 ( 3H, s, CH3); 1,15 (3H, s, CH3); 2,23 (d, J = 11,5 Hz, 1H-18); 3,29 (d, J = 11,0 Hz, 1H-23a); 3,38 (d, J = 9,5 Hz, 1H-3); 3,53 (d, J = 11,0Hz, 1H-23b); 3,71 (dt, 1H-2); 5,26 (br, 1H-12). - Phổ 13C-NMR (CD3Cl, 125 MHz)  (ppm): 48,0 (C-1), 69,3 (C-2), 78,2 (C-3), 44,1 (C-4), 48,2 (C-5), 19,1 (C-6), 33,6 (C-7), 40,7 (C-8), 48,5 (C-9), 39,0 (C-10),

24,5 (C-11), 126,4 (C- 12), 140,0 (C-13), 43,4 (C-14), 29,2 (C-15), 25,4 (C-16),

48,8 (C-17), 54,4 (C-18), 40,5 (C-19), 40,6 (C-20), 31,7 (C-21), 38,2 (C-22), 66,5

(C-23), 13,9 ( C-24), 17,5 (C-25), 17,5 (C-26), 24,1 (C-27), 181,6 (C-28), 18,0 (C-

29), 21,5 (C-30).

CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Xác định cấu trúc của các chất phân lập đƣợc.

4.1.1.chất 16(β-sitosterol).

16. β-sitosterol

Chất 16 được xác định là β-sitosterol qua so sánh số liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR

của chúng với số liệu trong tài liệu [20, 22] Bảng 4.1.

Bảng 4.1: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của các hợp chất DS8 (16) và β-sitosterol

Chất DS8 (16) Tài liệu (CDCl3)

β-sitosterol [20, 22] STT (CDCl3)

C H (J=Hz) C H (J=Hz)

37,3 37,3 1

31,7 2 31,7

3.53 (1H, m, H-3) 3.51 (1H, m, H-3) 71,8 3 71,8

42,3 4 42,3

140,8 5 140,8

121,7 5,38 (1H, dd, J=3 và 2,5 121,7 6

5,31 (1H, dd, J=5 và 2,0 Hz) Hz)

31,9 7 31,9

31,9 8 31,9

9 50,2 50,2

10 36,5 36,5

11 21,1 21,1

12 39,8 39,8

13 42,4 42,3

14 56,8 56,8

15 24,3 24,3

16 28,3 28,3

17 56,1 56,1

18 11,9 11,9 1.02 (3H, s, H-18) 1.01 (3H, s, H-18)

19 19,8 19,4 0,71 (1H, s) 0,68 (1H, s)

20 36,2 36,2

21 18,8 0,93 (3H, d, J =5,5 Hz, 18,8 0,92 (3H, d, J =6.6 Hz,

H-21) H-21)

22 34,0 33,9

23 26,1 26,1

24 45,9 45,9

25 29,2 29,2

26 19,1 0,86 (3H, d, J =7,0 Hz, 19,1 0,85 (3H, d, J =7,1 Hz,

H-26) H-26)

27 19,4 19,4

28 23,1 23,1

0,82 (3H, d, J =6 Hz, H-28) 0,81 (3H, d, J =6.6 Hz, H-28)

11,9 29 12,0

0,85 (3H, d, J =7,0 Hz, H-29) 0,84 (3H, d, J =6.6 Hz, H-29)

Hình 4.8. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất β-sitosterol

Hình 4.9. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất β-sitosterol

4.1.2. Chất 17 (GCLB17): quercetin

17.Quercetin

 Trạng thái

Hợp chất GCLB17 (17) thu được dưới dạng tinh thể hình kim, màu vàng, phát

quang dưới ánh sáng tử ngoại có  = 365 nm cho thấy chất có chứa hệ nối đôi liên

hợp hoặc nhân thơm hoặc carbonyl liên hợp.

 Phổ IR đo dưới dạng viên nén KBr cho các đỉnh hấp thụ mạnh, đặc trưng ở

3450 cm-1 (υ-OH), 1662 cm-1 (υ-C=O) cho thấy sự có mă ̣t củ a nhóm hydroxy và nhóm cacbonyl liên hợp trong phân tử, 1614 cm-1 (υ-C=C nhân thơm).

 Phổ 1H-NMR phía trường thấp có tín hiê ̣u củ a 5 proton thơm: cặp doublet ở H 6,19 và 6,40 có hằng số tương tác J = 1,9 Hz, cho thấy vòng A thơm có 2 proton

ở vị trí meta với nhau. Tín hiệu ở H 6,90 (d, J = 8,5Hz, H-5’) với hằng số tương tác

của hai proton ở vị trí ortholà H-5’ và H-6’(J = 8,5 Hz), ở H 7,75 (d, H-2’) với

hằng số tương tác của hai proton ở vị trí meta là H-2’ và H-6’(J = 2,0 Hz) và tín

hiệu ở H 7,65 (dd, H-6’) với các hằng số tương tác J = 2,0 và 8,5 Hz ( J H2’/ H6’=

2Hz và J H6’/ H5’= 8,5 Hz) cho thấy vòng B có nhóm thế ở C -3’ và C-4’. Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của chất này (bảng 4.2) phù hợp vớ i số liê ̣u đã công bố của quercetin. Số liệu của phổ 1H-NMR còn được hỗ trợ bởi phổ 13C-NMR của chất

này. Cụ thể như sau:

 Phổ 13C-NMR, DEPT 135, DEPT 90 cho biết hợp chất 17 có 15 carbon đặc

trưng cho hợp chất có khung flavonol, trong đó có 5 nhóm CH (methin) và 10

cacbon bậc 4. Pic carbon bậc 4 có δC = 177.3 ppm, đặc trưng cho nhóm C=O trong

vòng chứa nối đôi liên hợp, 9 pic cacbon bậc 4 còn lại có δC trong khoảng từ 100

đến 164 ppm phù hợp với khung cacbon của quercetin. Số liệu phổ NMR của chất

GCLB17 (17) được trình bày ở bảng 4.2.

Căn cứ vào số liệu phổ IR,1H-NMR,13C-NMR, DEPT 135, DEPT 90 và so

sánh với số liệu phổ của quercetin đã công bố [23], hợp chất 17 được xác định là

quercetin.

Quercetin là một trong những hợp chất flavonoid có hoạt tính sinh học lý

thú. Quercetin đã được phát hiện có hoạt tính ức chế hoạt động của enzym

tyrosinaza (IC50, 0,07mN). Enzym tyrosinaza xúc tác cho phản ứng oxi hóa L-

tyrosine thành dopaquinon. Phản ứng này đóng vai trò là giai đoạn quyết định của

sinh tổng hợp chất màu melanin trên da. Do đó, các chất có hoạt tính cao trong quá

trình ức chế sinh tổng hợp melanin được xem như là những hợp chất quan trọng

được sử dụng trong mỹ phẩm và dược phẩm để chữa trị các bệnh về da và làm đẹp

da.

Quercetin đã được phát hiện có hoạt tính ức chế vius HIV-1. Ngoài ra,

quercetin có vai trò quan trọng trong hóa trị liệu phòng chống ung thư (cancer

chemoprevention). Người ta đã tìm thấy nó có hoạt tính cao, ức chế cả ba giai đoạn

hình thành tế bào ung thư. Ngoài ra, nó còn được dùng tổ hợp với cis-platin trong

điều trị ung thư để làm giảm độc tố của thuốc điều trị.

Bảng 4.2: Số liê ̣u phổ 13C-NMR củ a chất 17 và Quercetin

C Quercetin Chất 17 (CD3OD)

2 147.9 148.0

3 137.2 137.2

4 177.3 177.3

5 162.5 162.5

6 99.3 99.2

7 165.7 165.6

8 94.4 94.4

9 158.2 158.2

10 104.4 104.5

1’ 124.1 124.1

2’ 116.0 115.9

3’ 146.2 146.2

4’ 148.7 148.8

5’ 116.2 116.2

6’ 121.6 121.7

Hình 4.10. Phổ IR của chất Quercetin

Hình 4.11. Phổ 1H-NMR của chất Quercetin

Hình 4.12. Phổ 13C-NMR của chất Quercetin

Hình 4.13: Phổ DEPT và 13C-NMR của chất Quercetin

4.1.3. Chất 18: β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (BL5.3)

18. β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid

Phổ 1H-NMR (DMSO-d6, 500MHz) của chất BL5.3 xuất hiện các tín hiệu

singlet tại δH: 0,65 (3H, s); 0,96 (3H, s) cùng với metyl dublet tại 0,80 (3H, d); 0,81(3H, d); 0,90(3H, d) và 1,00 (3H, d). Ngoài ra, trên phổ 1H – NMR còn có thể

quan sát thấy tín hiệu của proton vinylic tại δH 5,32 (1H,d) và tín hiệu của nhóm

metin mang oxi tại 3,42 (1H, m). Các tín hiệu của các proton còn lại bị trùng lấp

lên nhau trong khoảng δH 1.0- 2,3 ppm. Chất BL5.3 có gắn với một đường glucose

được thấy rõ qua cụm tín hiệu của 4 metin protontại δH 3,05-3,08 (1H, m); 3,10-

3,14 (3H, m) và tín hiệu của nhóm metilen mang oxi tại δH 3,64 (1H, dd, J = 5,5; 10,1, H-6A-Glc) và 3,46 (1H, m, H-6B-Glc). Phổ 1H-NMR của chất BL5.3 còn cho tín hiệu của một proton anome tại δH 4,22 (1H, d, J =7,8 Hz) và tín hiệu của

các nhóm OH của đường tạiδH 4,39(1H, t, J= 5,7 Hz; 6’-OH) và 4,83 (3H, m;

2’,3’,4’-OH). Phổ13C-NMR và phổ DEPT của hợp chất BL5.3 cho thấy sự xuất hiện của 35

cacbon, trong đó có 29 cacbon của aglycon và 6 cacbon của một nhánh đường. Tín

hiệu của liên kết olefin tại δC 122,04 và 140,15, tín hiệu của 6 nhóm metyltại δC

11,68; 11,78; 18,60; 18,85; 19,14 và 19,60, tín hiệu của một nhóm metin liên kết

oxi của aglycon tại δC70,04 (C-3). Ngoài ra còn có tín hiệu của một cacbon anome

tại δC100,98 (C-1’) cùng với 4 metin liên kết oxi tại δC73,42; 75,58; 76,26 và 76,76.

Kết hợp các dữ liệu phổ cho thấy chất BL5.3 là một tritecpen khung prostan có gắn

thêm một nhánh đường β-glucopyranose. Trên cơ sở các số liệu phổ (IR, EI-MS và

các phổ 1D và 2D-NMR) so sánh với số liệu phổ [23] của β-sitosterol-3-O-β-D-

glucopyranosid

Hình 4.14. Phổ 1H-NMR (DMSO, 500 MHz) của chấtBL5.3

Hình 4.15.Phổ 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của chấtBL5.3

Hình 4.16. Phổ DEPT và 13C-NMR của chất BL5.3

4.1.4. Chất 19 (BLEO2): Axit asiatic.

Chất 19 được phân lập từ phân đoạn F4 của cặn chiết EtOAc dưới dạng tinh thể

màu trắng (kết tinh trong CHCl3/MeOH), điểm nóng chảy 324-326°C.

- Phổ hồng ngoại: cho đỉnh hấp thụ đặc trưng của nhóm hydroxyl (3411 cm-1), nhóm CH2, CH3 (2930 và 2866 cm-1).

- Phổ 1H-NMR cho thấy có 6 nhóm metyl trong đó có 4 nhóm metyl gắn với cacbon

bậc 4 với các tín hiệu singlet tại: 0,71, 0,87; 0,99; 1,06; 1,15 và hai nhóm metyl gắn

với CH với tín hiệu doublet tại H = 0,91 (J = 6,5 Hz) và H = 0,92 (J = 6,5 Hz).

Ngoài ra, trên phổ có tín hiệu một nhóm CH2 gắn với OH ở H = 3,29 (d, J = 11,0

Hz; H-23a); H = 3,53 (d; J = 11,0 Hz; H-23b), 2 nhóm hydroxy gắn với CH ở  =

3,38(J = 9,5 Hz; H-3) và 3,71 (m, H-2) và 1 tín hiệu của nối đôi ở  = 5,26 (br s, H-

12).

Phổ 13C-NMR và DEPT của chất 19 có mặt của 30 cacbon trong đó có 6 nhóm

metyl; 9 nhóm cacbon bậc 2; 8 nhóm cacbon bậc 3 và 7 nhóm cacbon bậc 4, nhóm

cacboxylic với  = 181,6 ppm và tín hiệu nối đôi C12 = C13;  = 139,8, 126,6 ppm.

Phổ H-H-COSY cho thấy có sự tương tác giữa hai proton ở H: 3,29 (d, J = 11 Hz);

3,53 (d; J = 11 Hz) gắn trực tiếp với cacbon ở vị trí C-23, proton ở  = 3,38 (J = 9,5

Hz; H-3) tương tác với proton ở  = 3,71 (m, H-2). Phổ HSQC cho thấy rõ giữa H-2

(3,72 ppm) và C-2 (69,7 ppm), giữa C-3 (72,2 ppm) và H-3 (3,38 ppm), tương tác

giữa C-12 (126,6 ppm) và H-12 (5,26 ppm). Phổ khối (ESI-MS) cho pic ion giả

phân tử tại m/z = 487,4 [M-H]-. Kết hợp với phổ 1H- và phổ 13C NMR dự đoán chất

19 có công thức phân tử là C30H48O5.

So sánh các số liệu phổ MS, 1H- và 13C-NMR của chất 19 với số liệu của axit asiatic

trong tài liệu [20] bảng 4.3, thấy hoàn toàn trùng khớp. Vậy chất 19 chính là axit

asiatic.

Hình 4.17. Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của chất 19

(Axit asiatic)

Hình 4.18. Phổ 13C-NMR và phổ DEPT của chất 19 (Axit asiatic)

Hình 4.19. Phổ khối ESI-MS của chất 19 (Axit asiatic)

4.1.5. Chất 20: BLEO3 (Axit corosolic)

Axit Corosolic

- Phổ 1H-NMR cho thấy có 7 nhóm metyl trong đó có 5 nhóm metyl gắn với cacbon

bậc 4 với các tín hiệu singlet tại: 0,71, 0,75; 0,91; 1,04 và hai nhóm metyl gắn với

CH với tín hiệu doublet tại H = 0,81 (J = 6,0 Hz) và H = 0,92 (J = 3,5 Hz). 2 nhóm

hydroxy gắn với CH ở  = 3,38 (J = 9,5 Hz; H-3) và 4,24 (dd, H-2) và 1 tín hiệu của

nối đôi ở  = 5,26 (br s, H-12).

- Phổ 13C-NMR và DEPT có mặt của 30 cacbon trong đó có 7 nhóm metyl; 8 nhóm

cacbon bậc 2; 8 nhóm cacbon bậc 3 và 7 nhóm cacbon bậc 4, nhóm cacboxylic với

 = 181,6 ppm và tín hiệu nối đôi C12 = C13;  = 140,0, 126,4 ppm.

Phổ khối ESI-MS, ion âm; m/z = 509 [M + K-2H ]- ; M = 472 (ứng với công thức

phân tử: C30H48O4).

So sánh các số liệu phổ MS, 1H- và 13C-NMR của chất 20 với số liệu của axit

corosolic trong tài liệu [23, 20] bảng 4.3, thấy hoàn toàn trùng khớp. Do vậy có thể

kết luận chất 20 chính là axit corosolic

Bảng 4.3: Số liệu phổ 1H- và 13C-NMR của các chất 19, 20

axit corosolic và axit asiatic

Axit Corosolic 19 (CDCl3 C Axit asiatic [ 10 ] 20(DMSO-d6) (pyridin –d5)[23] +CD3OD)

C H (J = Hz) C H (J = Hz) C H (J = Hz) C H (J = Hz)

1 47.0 48.1 48.0 48.0

2 67.1 4.24 (dd) 68.1 4.11 (1H, 69.3 3.7 (dt,1H) 69.7 3.71 (dt,1H)

dd)

3 82.2 3.38 (d, J = 84.3 3.43 (1H, d, 78.2 3.38 (d, J = 78.2 3.38 (d, J =

9.5 Hz) J = 9.5 Hz) 9.5 Hz, 1H) 9.5 Hz, 1H)

4 39.1 40.3 44.1 44.1

5 54.7 56.1 48.2 48.2

6 18.0 19.3 19.1 19.1

7 32.6 34.0 33.6 33.6

8 39.2 40.5 40.7 40.7

9 46.9 48.5 48.5 48.5

10 37.5 38.9 39.0 38.9

11 22.9 24.2 24.5 24.5

12 124.5 5.26 (br s) 126.0 5.48 (br s) 126.4 5.28 126.6 5.26 (br,1H)

(br,1H)

13 138.2 139.8 140.0 139.8

14 41.7 43.0 43.4 43.4

15 27.5 29.1 29.2 29.1

16 23.8 25.4 25.3 25.4

17 47.0 48.6 48.7 48.8

18 52.3 54.0 54.3 54.4

19 38.4 2.12 (1H, d, 39.9 2.65 (1H, d, 40.5 40.4

J = 11.5 Hz) J = 11.0 Hz)

20 38.5 2.74 (1H, 40.0 40.6 40.4

dd, J = 4,

9.5 Hz)

21 30.1 31.5 31.7 31.7

22 36.3 37.9 38.1 38.2

23 28.8 29.8 66.5 3.29 (d, J = 66.3 3.29 (d, J =

11.0 Hz, 1H) 11.0 Hz,

1H) 3.53(d, J =

11.0 Hz, 1H) 3.51(d, J =

11.0 Hz,

1H)

24 17.1 18.2 13.9 13.9

25 16.4 17.4 17.6 17.5

26 16.9 17.9 17.7 17.5

27 23.2 24.4 24.1 24.1

28 178.2 180.4 181.6 181.6

29 17.0 18.0 17.8 18.0

30 21.0 21.9 21.5 21.6

Hình 4.20. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất corosolic axit

Hình 4.21. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất axit corosolic

Hình 4.22. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất axit corosolic

Hình 4.23. Phổ khối MS của chất axit corosolic

Các chất được tách và xác định cấu trúc hóa học từ lá cây Bằng lăng nước

trong luận văn được đưa ở bảng 4.4 dưới đây:

Bảng 4.4. Công thức các hợp chất phân lập được từ lá cây Bằng lăng nước

STT CÔNG THỨC TÊN GỌI KÝ HIỆU

β-sitosterol

1 DS8

quercetin

GCLB1 2 7

β-sitosterol-3-

O-β-D-

glucopyranosid 3 BL5.3

STT CÔNG THỨC TÊN GỌI KÝ HIỆU

Axit asiatic

Lần đầu tiên

BLEO2 phân lập được từ 4 lá bằng lăng

nước

Axit corosolic

5 BLEO3

4.2. Định lƣợng axit asiatic và axit corosolic bằng sắc ký lỏng cao áp.

Sau khi phân lập và xác định cấu trúc của các chất trong cao chiết Bằng lăng nước

cho thấy hàm lượng axit asiatic và axit corosolic là khá cao. Chúng tôi đã sử dụng

phương pháp HPLC để định lượng hàm lượng axit asiatic và axit corosolic có trong

mẫu lá Bằng lăng nước.

Kết quả định lượng Axit asiatic và Axit corosolic bằng HPLC

Máy móc thiết bị:

- Sử dụng hệ thống HPLC Alliance series 2695, detector PDA 2996 của hãng

Waters-Mỹ.

- Cân phân tích Adam AAA 160L (d = 0,0001)

4.2.1.Định lƣợng axit asiatic

4.2.1.1. Chuẩn bị mẫu:

- Xây dựng đường chuẩn :

Asiatic chuẩn (Merck) được cân chính xác 25 mg cho vào bình định mức (25

ml) sau đó thêm MeOH cho đến vạch ta được dung dịch gốc (1mg/ml). Pha loãng

dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7 mg/ml,

sau đó chạy lần lượt các dung dịch có nồng độ trên qua hệ thống HPLC với cột

phân tích: Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm

Thông số của HPLC :

Pha động : Kênh A : H2O + 0,1% axit focmic

Kênh B : Acetonitrile

Tốc độ dòng 1 ml/phút, chạy gradient

Thời gian (phút) Kênh A (%) Kênh B (%)

0 – 2 80 20

2 – 20 0 100

20 – 30 0 100

30 – 35 80 20

Detector PDA : bước sóng 205 nm. Thể tích mẫu bơm vào máy 20µl

Các nồng độ Asiatic chuẩn 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7 mg/ml đã được đo lặp lại 3

lần, kết quả thu được có sự ổn định rất cao về giá trị tích phân (diê ̣n tích pic ), và thời gian lưu (RT). Điều này chứng tỏ rằng các giá trị thông số của phương pháp mà

chúng tôi đã lựa chọn cho hệ thống HPLC là phù hợp cho việc phân tích định lượng

Asiatic. Kết quả thu được (bảng 4.5), từ kết quả này sẽ tiến hành xây dựng đường

chuẩn.

Bảng 4.5: Kết quả định lượng axit Asiatic chuẩn

Stt Diện tích pic Diện tích píc LT

1 2 3 4 5 Nồng độ (mg/ml) 0.05 0.1 0.3 0.5 0.7 455177 969416 3150939 5271350 7294451 468410 996956 3111139 5225322 7339505 Thời gian lưu (phút) 19,7 19,7 19,7 19,7 19,7

Đường chuẩn Asiatic

Như vậy, với sự ổn định của việc lặp lại các lần đo cộng thêm sự tương quan

chặt chẽ giữa nồng độ Asiatic và diê ̣n tích pic thu được trên phổ HPLC, phương pháp này tối ưu cho việc phân tích đi ̣nh lươ ̣ng Asiatic trong các mẫu nghiên cứ u.

4.2.1.2. Kết quả định lƣơng các mẫu phân tích:

Mẫu nghiên cứu cũng được phân tích với cùng điều kiện như mẫu chuẩn .

Sắc ký đồ HPLC của axit asiatic chuẩn

Sắc ký đồ HPLC của axit asiatic trong cao BL02

Kết quả định lượng thu đươ ̣c như sau:

Bảng 4.6: Kết quả định lượng axit Asiatic trong mẫu cao BL02

Stt Tên mẫu Diện tích pic

1 BL02 Khối lượng mẫu (mg) 23.2 2928721 Hàm lượng Asiatic (mg) Tỷ lệ % 1.219 0.283

Nhận xét: Từ kết qủa phân tích HPLC trên Bảng 4.6 hàm lượng axit asiatic trong

mẫu cao BL02 là 1,219 % (Hàm lượng 0,184% so với lá Bằng lăng khô).

4.2.2.Định lƣợng axit corosolic

4.2.2.1.Chuẩn bị mẫu :

- Xây dựng đường chuẩn :

Corosolic chuẩn (Merck) được cân chính xác 25 mg cho vào bình định mức

(25 ml) sau đó thêm MeOH cho đến vạch ta được dung dịch gốc (1mg/ml). Pha

loãng dung dịch gốc thành các dung dịch có nồng độ 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7

mg/ml, sau đó chạy lần lượt các dung dịch có nồng độ trên qua hệ thống HPLC với

cột phân tích: Sunfire -C18 RP (4.6 x 150 mm), 5µm

Thông số của HPLC :

Pha động : Kênh A : H2O + 0,1% axit focmic

Kênh B : Acetonitrile

Tốc độ dòng 1 ml/phút, chạy gradient

Thời gian (phút) 0 – 2 2 – 20 20 – 30 30 – 35 Kênh A (%) 80 0 0 80 Kênh B (%) 20 100 100 20

Detector PDA : bước sóng 205 nm. Thể tích mẫu bơm vào máy 20µl Các nồng độ Corosolic chuẩn 0,05; 0,1; 0,3; 0,5 và 0,7 mg/ml đã được đo lặp

lại 3 lần, kết quả thu được có sự ổn định rất cao về giá trị tích phân (diê ̣n tích pic ), và thời gian lưu (RT). Điều này chứng tỏ rằng các giá trị thông số của phương pháp

mà chúng tôi đã lựa chọn cho hệ thống HPLC là phù hợp cho việc phân tích định

lượng Corosolic. Kết quả thu được (bảng 4.7), từ kết quả này sẽ tiến hành xây dựng

đường chuẩn.

Bảng 4.7: Kết quả định lượng axit Corosolic chuẩn

Stt Nồng độ (mg/ml) Diện tích pic Diện tích pic LT

1 2 3 4 5 0.05 0.1 0.3 0.5 0.7 496222 1012071 3032230 5066101 6819922 539879 1030134 2991156 4952178 6913200 Thời gian lưu (phút) 21,8 21,8 21,8 21,8 21,8

Đường chuẩn Corosolic

Như vậy, với sự ổn định của việc lặp lại các lần đo cộng thêm sự tương quan

chặt chẽ giữa nồng độ Corosolic và diê ̣n tích pic thu được trên phổ HPLC, phương pháp này tối ưu cho việc phân tích đi ̣nh lươ ̣ng Corosolic trong các mẫu nghiên cứ u.

4.2.2.2. Kết quả định lƣơng các mẫu phân tích:

Các mẫu nghiên cứu cũng được phân tích với cùng điều kiện như mẫu chuẩn .

Sắc ký đồ HPLC của axit corosolic chuẩn

Sắc ký đồ HPLC của axit corosolic trong cao BL02

Kết quả định lượng thu đươ ̣c như sau.

Bảng 4.8: Kết quả định lượng axit Corosolic trong mẫu cao BL02

Hàm lượng Stt Tên Mẫu Diện tích pic corosolic (mg) Tỷ lệ % Khối lượng mẫu (mg)

1 BL02 23.2 5150483 0.520 2.242

Nhận xét: Kết qủa phân tích HPLC trên Bảng 4.8 hàm lượng axit corosolic trong mẫu cao BL02 đạt 2,242% (Hàm lượng 0,34% so với lá Bằng lăng khô),.

Bảng 4.9: Hàm lượng axit corosolic và asiatic trong các mẫu cao Bằng lăng nước

bằng phương pháp HPLC

STT Tên mẫu

Hàm lượng axit corosolic % Hàm lượng axit asiatic %

1 BL02 ( Cao chiết cồn 70% ) 2,242 1,219

Kết qủa phân tích HPLC: Hàm lượng axit asiatic trong mẫu cao BL02 cao là 1,22 % (

0,184% so với lá Bằng lăng khô) và hàm lượng axit corosolic trong mẫu cao BL02

đạt 2,242% (chiếm 0,34% so với lá Bằng lăng khô)

KẾT LUẬN

1. Kết luận

- Từ dịch chiết cồn 70% của cây bằng lăng nước đã phân lập được 5 chất sạch là β-

sitosterol.β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosid, quercetin, axit asiatic và axit

corosolic

- Đã định lượng xác định hàm lượng axit asiatic và axit corosolic bằng phương pháp

HPLC. Hàm lượng axit corosolic là 2,242% (0,34% so với lá Bằng lăng khô) và axit

asiatic 1,22 % so với cao khô ( 0,184% so với lá Bằng lăng khô).

- Cấu trúc của các chất trên đã được xác định bằng việc kết hợp các phương pháp

phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS),

phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-, 13C-NMR, DEPT và phổ NMR hai chiều (H-H-

COSY, HSQC và HMBC).

- Từ kết quả của đề tài đã đăng 1 bài báo trên tạp chí hóa học 2015.

2. Kiến nghị.

Tiếp tục phân lập và xác định cấu trúc của các chất trong các phân đoạn còn lại của

dịch chiết. Thử hoạt tính sinh học của các dịch chiết và các chất tách được, góp

phần làm tăng giá trị sử dụng cũng như chữa bệnh của cây Băng lăng nước.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Trung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong,

Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lỗ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim

Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật

làm thuốc ở Việt Nam, NXB KHKT, HàNội.

2. Nguyễn Quyết Tiến, Phạm Hồng Minh, Nguyễn Ngọc Tuấn, Đoàn Văn Tuấn,

Phạm Hữu Điển (2012), “ Góp phần nghiên cứu thành phần hóa học của cây

Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa L.) ởViệt Nam’’, Tạp chí Hóa học,

50(1), tr.30.

3. Phạm Hoàng Hộ (2000), Cây cỏ Việt Nam, (2), tr. 28 - 33, NXB Trẻ, Hà Nội.

4. Tôn Nữ Liên Hương và Nguyễn Duy Tuấn (2012), “ Thành phần hóa học của vỏ

cây bằng lăng nước (lagerstroemia speciosa) thuộc chi tử vi

(lagerstroemia)’’, Tạp chí Khoa học, Trường Đại học Cần Thơ, (22b),

tr.184-189.

5. Võ Văn Chi (1996), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, Việt

Nam.

Tiếng Anh

6. Abiodun Falodun,Sajjad Ali, Irfan Mohammed Quadir and Iqbal M. I.

Choudhary. (2008), “Phytochemical and biological investigation of

chloroform and ethylacetate fractions of Euphorbia heterophylla leaf

(Euphorbiaceae)’’, Journal of Medicinal Plants Rearch, 2(12), pp. 365-369.

7. A.K. Jamal,W.A. Yaacob,Laily B. Din. (2008), “A chemical Study on

8. Barun Kanti Saha, Md. Nurul Huda Bhuiyan, Kishor Mazumder and K.M.

Phyllanthusreticulates”, Journal of Physical Science Year, 19(2), pp. 45-50.

Formuzul Haque. (2009), “ Hypoglycemic activity of Lagerstroemia

speciosa L. extract on streptozotocin-induced diabetic rat: Underlying

mechanism of action”, A Journal of the Bangladesh Pharmacological

9. Blomster R.N. (1964), “ Isoation of lythrin”, J.Nat. Prod, 27, pp. 15.

10. Byeong-Seon Jeong, Mi Kyeong, Young Choong Kim, and Eung –Seok Lee

Society, 4, pp. 79-83.

.(2007), “Modification of C2 Functional Group on Asiatic Acid and the

Evaluation of Hepatoprotective Effect”, Arch Pharm Res, 30(3), pp. 282-

11. Carew D.P, Chin T.F. (1961), “ Constituent of Lagerstroemia speciosa (L)

289.

12. Comins D.L. (1992), “ Source and sythesis of subcosin I”, oil. Cem., 57, 5807.

13. Della G.M. (1994), “ Polyoxygenated oleanane triterpenes from Hidrocotyl

Pers”, Nature, 190(4781), pp. 1108-1109.

14. Eder Bisoli, Walmir Silva Garcez, Lidilhone Hamerski, Caroline Tieppo and

Ranunculoides”, Phytochemistry, 35, pp. 1017.

Fernanda Rodrigues Garcez. (2008), “Bioactive Pentacyclic Triterpenes

15. Eliane Garo et al. (2007), “Asiatic Acid and Corosolic Acid Enhance the

from the Stems of Combretum laxum”, Molecules, 13, pp. 2717-2728.

Susceptibility of Pseudomonas aeruginosa Biofilm to Tobramycin” ,

16. Ferris J.P, Briner R.C, Boyce C.B. (1971), “Lythracese alkaloid”, J. Am.

Antimicrobial Agents and chemtherapy, 51(5), pp. 1813-1817.

Chem. Soc, 93(12),pp. 2958-2962.

17. Guy Klein, Jaekyung Kim, Klaus Himmeldirk, Yanyan Cao,and Xiaozhuo

Chen. (2007), “Antidiabetes and Anti-obesity Activityof

Lagerstroemiaspeciosa”, Evidence Based Complementary and Alternative

Medicine, 4(4), pp. 401.

18. Iida. H. (1984), “ Alkaloid from leaves of Lagerstroemia subcostata.”, J. Oil.

Chem., 49, pp. 1909.

19. Jehan C.M et al. (1990), “ A keto fatty acid from Lagerstroemia speciosa seed

oil”, Phytochemistry, 29, pp. 232.

20. Kui Su, Min Gong, Jing Zhou, Shiming Deng. (2009), “Study on chemical

composition of Nauclea officinalis leaves”, International Journal of

Chemistry, 1(2), pp. 77-81.

21. Mei Liu et al. (2007), “ Madecassoide isolated from Centella asiatica Herbs

Facilitates Burn Wound Healing in Mice”, Planta Medica, 74, pp.809-815.

22. Ria Biswas, Asish Dasgupta, Anupama Mitra, Subodh K. Roy, Pradip K. Dutta,

Basudeb Achari, Sujata Ghosh Dastidar, Tapan K. Chatterjee. (2005),

“Isolation, Purification and Characterization of four fure compounds from

the root extract of Pluchea indica (L.) Lees. and the potentiality of the root

extract and the pure compounds for antimicrobial activity”, European

Bulletin of Drug Research, 13(50), pp. 30-34.

23. Sarin L.R, Kapoor L.D. (1963), “ Blood sugar levels during sleep in normal and

diabetic subjects”, Bull. Reg. Research Lab Jammu, 1, pp. 136.

24. Toshihiro Itoh, Toshitake Tamura, Satoru Ogwa, Taro Metsumoto. (1975), - values on four stationery phases”, “Differentiation of sterols based ΔRoxo

Steroides, 25(6),pp. 729-739.

25. Tzong-Huei Leea Shin-Hun Juang, Feng-Lin Hsua and Cheng-Yi Wu. (2005),

“Triterpene Acids from the Leaves of Planchonella duclitan (Blanco)

Bakhuizan”, Journal of the Chinese Chemical Society, 52, pp. 1275-1280.

26. USP 0097463A1, (2004). May 20

27. US 2007/0010459A1, 2007, Jan, 11,.

28. Ya-Ling Hsu, Po-Lin Kuo, Liang-Tzung Lin, and Chun-Ching Lin. (2005), “

Asiatic Acid, a Triterpene, Induces Apoptosis and Cell Cycle Arrest through

Activation of Extracellular Signal-Regulated Kinase and p38 Mitogen-

Activated Protein Kinase Pathways in Human Breast Cancer Cells”, The

Journal of Pharmacology And Experimental Therapeutics, 313(1), pp. 333-

344.

PHỤ LỤC PHỔ

Phụ lục 1: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất β-sitosterol

Phụ lục 2. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất β-sitosterol

Phụ lục 3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất β-sitosterol

Phụ lục 4. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất β-sitosterol

Phụ lục 5. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất β-sitosterol

Phụ lục 6. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất β-sitosterol

Phụ lục 7. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR, DEPT của chất β-sitosterol

Phụ lục 8. Phổ 1H-NMR của chất GCLB17

Phụ lục 9. Phổ 1H-NMR của chất GCLB17(giãn rộng)

Phụ lục 10. Phổ 13C-NMR của chất GCLB17

Phụ lục 11: Phổ DEPT và 13C-NMR của chất GCLB17

1 Phụ lục 12. Phổ H-NMR (DMSO, 500 MHz) của chấtBL5.3

1 Phụ lục 13. Phổ H-NMR giãn (DMSO, 500 MHz) của chất BL5.3

1 Phụ lục 14. Phổ H-NMR giãn (DMSO, 500 MHz) của chấtBL5.3

13 Phụ lục 15. Phổ C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của chấtBL5.3

Phụ lục 16. Phổ 13C-NMR giãn (CDCl3, 125 MHz) của chấtBL5.3

13 Phụ lục 17. Phổ C-NMR giãn (CDCl3, 125 MHz) của chấtBL5.3

13 Phụ lục 18. Phổ DEPT và C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của chấtBL5.3

13 Phụ lục 19. Phổ DEPT và C-NMR (CDCl3, 125 MHz) của chấtBL5.3

Phụ lục 20. Phổ 1H-NMR (MeOD, 500 MHz) của chất 4 (Axit asiatic)

Phụ lục 21. Phổ 13C-NMR - DEPT của chất 4 (axit asiatic)

Phụ lục 22. Phổ khối ESI-MS của chất 4 (axit asiatic)

Phụ lục 23. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR của chất axit corosolic

Phụ lục 24. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR giãn của chất axit corosolic

Phụ lục 25. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR giãn của chất axit corosolic

Phụ lục 26. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR của chất axit corosolic

Phụ lục 27. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR giãn của chất corosolic axit

Phụ lục 28. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR giãn của chất axit corosolic

Phụ lục 29. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR – DEPT của chất axit corosolic

Phụ lục 30. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR – DEPT giãn của chất axit

corosolic

Phụ lục 31. Phổ khối MS của chất axit corosolic

JOURNAL OF CHEMISTRY

VOL. 53(2) 243-246

VIETNAM APRIL 2015 DOI: 10.15625/0866-7144.2015-00123

CHEMICAL STUDY OF THE LEAVES OF LAGERSTROEMIA SPECIOSA IN VIETNAM

Tran Van Loc1*, Nguyen Thi Ngan1, Pham Thi Ninh1, Tran Thi Phuong Thao1, Nguyen Thi Luu1, Le Thi Thu Ha1, Nguyen Minh Thu1, Nguyen Thi Van Anh2, Tran Van Sung1 1Institute of Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology 2Traphaco Company, Ngoc Hoi, Hoang Liet, Hoang Mai, Hanoi

Received 13 March 2015; Accepted for Publication 20 April 2015

Abstract

The main constituents of the EtOH extract of leaves of Lagerstroemia speciosa supplied by Traphaco company have been quantitatively determined by HPLC to be corosolic acid (2.242 %), asiatic acid (1.219 %) and β-sitosterol. Repeated column chromatography of the n-hexane, ethyl acetate and dichloromethane extract of these leaves led to the isolation of corosolic acid, asiatic acid, quercetin, β-sitosterol and β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosyl glucoside. The structures of these compounds have been elucidated by the IR, MS and NMR spectral analysis.

Keywords. Lagerstroemia speciosa, leaves, quercetin, corosolic acid, asiatic acid.

1. INTRODUCTION

column chromatography. TLC used the precoated aluminum sheets with silica gel 60 GF 254, 0.2 mm (Merck). IR: Nicolet Impact 410 (KBr), MS: HP 5989 B MS Engine Agilent, NMR: Bruker Avance 500 MHz. For quantitative determination of the main constituents the HPLC Alliance series was used.

food product

Extraction: Dried leaves of L. speciosa (1600 g) were extracted with ethanol-water mixture 70:30 (v/v) at 60 ○C three times. Evaporation of solvents under reduced pressure afforded 240 g extract. Quantitative HPLC analysis of this extract gave corosolic acid (2.242 %) and asiatic acid (1.219 %) as the main constituents.

The species Lagerstroemia speciosa (L.) Pers. (Vietnamese name: Bằng lăng nước) belonging to the family Lythraceae is a big tree of 10-15 meters high. This plant is growing wildly in India, Thailand, Laos, Cambodia, Philippine, Vietnam and South China. In the folk medicine of many countries Lagerstroemia speciosa is used for treatment of type II diabetes and other diseases like diarrhea, heart, stomach [1]. Studies on the chemical constituents of these plants have shown the presence of tannins, flavonoids [2] fatty acids [3] and terpenoids [4]. In a cooperation with Traphaco Company to develop a functional from Vietnamese L. speciosa for supporting the treatment of type II diabetes we report here the isolation of the main constituents from the leaves of this plant: corosolic acid, asiatic acid, β-sitosterol, daucosterol and quercetin. 2. EXPERIMENTAL

Plant material: the leaves of L. speciosa have been supplied by Traphaco Company, a herbal exemplar. No.BL02 is deposited in the Research Department of this company.

200 g EtOH extract were dissolved in H2O and extracted with n-hexane and ethyl acetate, successively to yield 12 g n-hexane and 25 g ethyl acetate extract. Chromatography of 12 g n- hexane extract on silica gel eluted by n- hexane/EtOAc mixture gradient from 5-20 % EtOAc gave 4 fractions (HE1-HE4). Fraction HE2 was rechromatographed on silica gel with the solvent mixture n-hexane/EtOAc 9:1 to furnish 700 mg β–sitosterol (1). 25 g EtOAc extract were fractionated on a silica gel column with n-hexane/EtOAc mixture gradient from 10- 70 % EtOAc to give 5 fractions (EA1-EA5).

Chemicals and methods: Silica gel (Merck) with different sizes from 0.040-0.063 mm, reverse phase RP18 and Sephadex LH20 were used for

243

(KBr, cm-1): 3144 (OH), 2930, 2866 (CH2, CH3), 1690 (COOH), 1459, 1053, 694. ESI-MS (negative ions): m/z=487[M-H]-

1H and 13C- NMR spectral data, see table 1.

3. RESULTS AND DISCUSSION

silica

on to

VJC, Vol. 53(2), 2015 Chemical study of the leaves of… Repeated chromatography of fraction EA2 on silica gel with a solvent mixture hexane/EtOAc 85:15 (v/v) afforded 250 mg β-sitosterol (1) and 30 mg quercetin (3). Fraction EA3 was rechromatographed on a RP 18 column with a mixture MeOH/H2O 8:1 as eluent to give 650 (5). Fraction EA4 was mg asiatic acid gel rechromatographed (CH2Cl2/MeOH 9:1) furnish 2500 mg corosolic acid (4) and 25 mg β-sitosterol-3-O-β- D-glucopyranoside. Compound 1 (β-sitosterol):

White crystals, mp 169-171 ○C. 1H-NMR (δ, CDCl3): 1.02 ( 3H, s, H-18), 0.71 (3H, s, H-19), 0.86 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-26), 0.85 (3H, d, J = 7.0 Hz, H-27), 0.93 (3H, d, J = 5.5 Hz, H-21), 0.85 (3H,t, J = 7.0 Hz, H-29), 5.38 (1H, dd, J = 3.0, 2.5 Hz, H- 6),3.53 (1H, m, H-3).

13C-NMR spectrum is in full agreement with that

there were differencies between

of β–sitosterol in [5, 6].

It is well known that the leaves extract of Lagerstroemia speciosa has a blood sugar content lowering effect and can be used for treatment of diabetes type II. The main active constituent in this extract has been evidenced as corosolic acid (4). Very important is to find out the Lagerstroemia speciosa or its varieties in Vietnam, which contain high enough amount of corosolic acid for developing a product used in diabetes type II treatment. In cooperation with Traphaco company we have had screenings of about 10 Lagerstroemia samples and found out that the sample BL02 was the best one. However, the amount of corosolic acid and asiatic acid determined by quantitative HPLC (2.242 % and 1.219 % of dry extract, respectively) and the isolated amount by repeated column chromatography (1.25 % and 0.3259 %, respect- tively). That means the contents of corosolic acid and asiatic acid in dry leaves of sample BL02 are 0.35 % and 0.19 %, respectively. So that the sample BL02 can be used as starting material for preparation of a functional food product used in treatment of diabetis type II.

Compound 2 (β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyra- 1H-NMR noside, Daucosterol), white powder, (DMSO-d6) δ ppm: 0.65 (3H, s), 0.80 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.81 ( 3H, d, J = 6.9 Hz), 0.90 (3H, d, J = 6.5 Hz), 0.96 (3H, s), 1.00 (3H, d, J = 6.7 Hz), 1.23 (3H, s), 3.05-3.08 (1H, m), 3.10-3.14 (3H, m), 3.38-3.48 (2H, m), 3.64 (1H, dd, J = 5.5, 10.1 Hz), 4.22 (1H, d, J = 7.8 Hz), 4.39 (1H, t, J = 5.7 Hz), 4.83 (3H, m), 5.32 (1H, d, J = 7.0). 13C-NMR spectrum is in full agreement with that for daucosterol in [7].

The structures of isolated corosolic acid and asiatic acid have been determined by comparison of 1H- and 13C-NMR spectral data with the published data (table 1).

Compound 3 (quercetin): yellow needles. IR (KBr, cm-1): 3450 (OH), 1662 (C=O), 1614 (C=C), 1H-NMR (δ, CDCl3): 6.20 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-6), 6.40 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-8), 6.90 (1H, d, J = 8.5 HZ, H-5’), 7.65 (1H, dd, J = 2.0, 8.5 Hz, H-6’), 7.75 (1H, J = 2.0 Hz, H-1’). 13C-NMR spectrum is in full agreement with that for quercetin in [8].

Compound 4 (corosolic acid): white powder, positive ions ESI- MS: m/z = 473 [M+H]+, 1H and 13C-NMR spectral data, see table 1.

Compound 5 (asiatic acid): white powder, IR

1: R=H β-sitosterol 3: Quercetin 2: R = β-D-glucopyranosyl

244

VJC, Vol. 53(2), 2015 Chemical study of the leaves of…

4: R = CH3 (corosolic acid) 5: R = CH2OH (asiatic acid) Table 1: NMR spectral data of 4 and 5

Pos.

Asiatic acid [ 10 ]

4 (DMSO-d6)

5 (CDCl3 +CD3OD)

H (J = Hz)

1 2

C 47.0 67.1

C 48.0 69.3

3.7 (dt,1H)

3.71 (dt,1H)

C 48.0 69.7

82.2 3.38 (d, J =

78.2 3.38 (d, J = 9.5

Corosolic acid (pyridine –d5) [9] H (J = Hz) C 48.1 4.11 (1H, 4.24 (dd) 68.1 ddd, J = 4.0, 9.5, 11.0 Hz) 84.3 3.43 (1H, d, J

9.5 Hz)

39.1 54.7 18.0 32.6 39.2 46.9 37.5 22.9

= 9.5 Hz)

4 5 6 7 8 9 10 11 12 124.5 5.26 (1H, t,

40.3 56.1 19.3 34.0 40.5 48.5 38.9 24.2 126.0 5.48 (1H, br

44.1 48.2 19.1 33.6 40.7 48.5 39.0 24.5 126.4

Hz, 1H) 5.28 (br,1H)

Hz, 1H) 5.26 (br,1H)

44.1 48.2 19.1 33.6 40.7 48.5 38.9 24.5 126.6

J = 3.3 Hz)

139.8 43.0 29.1 25.4 48.6 54.0 39.9 2.65 (1H, d, J

140.0 43.4 29.2 25.4 48.8 54.4 40.5

139.8 43.4 29.1 25.3 48.7 54.3 40.4

38.5

= 11.0 Hz)

40.0

40.6

40.4

13 138.2 41.7 14 27.5 15 23.8 16 47.0 17 52.3 18 38.4 2.12 (1H, d, 19 J = 11.5 Hz) 2.74 (1H, dd, J = 4 and 9.5 Hz)

30.1 36.3 28.8

21 22 23

31.5 37.9 29.8

31.7 38.2 66.5

31.7 38.1 66.3 3.29 (d, J = 11.0

3.29 (d, J = 11.0 Hz, 1H) 3.51(d, J = 11.0 Hz, 1H)

Hz, 1H) 3.53(d, J = 11.0 Hz, 1H)

245

VJC, Vol. 53(2), 2015 Chemical study of the leaves of… 17.1 24 16.4 25 16.9 26 23.2 27 28 178.2 17.0 29 21.0 30

13.9 17.6 17.7 24.1 181.6 17.8 21.5

13.9 17.5 17.5 24.1 181.6 18.0 21.6

18.2 17.4 17.9 24.4 180.4 18.0 21.9

Isolation, Purification and Characterization of four pure compounds from the root extract of Pluchea indica (L.) Lees. and the potentiality of the root extract and the pure compounds for antimicrobial activity, European Bulletin of Drug Research, 13, 63- 70(50), 30-34 (2005).

REFERENCES 1. Saha, Barun Kanti Saha, Md. Nurul Huda Bhuiyan, Kishor Mazumder and K. M. Formuzul Haque. Hypoglycemic activity of Lagerstroemia speciosa L. extract on streptozotocin-induced diabetic rat: Underlying mechanism of action, A Journal of the Bangladesh Pharmacological Society, 4, 9-83 (2009).

7. Nguyen Quyet Tien, Pham Thi Hong Minh, Pham Huu Dien. Some results on the chemical study of Lagerstroemia speciosa, Vietnam Journal of Science and Technology, 15-18 (2001) (in Vietnamese).

D. P. Carew, T. F. Chin. Constituent of Lagerstroemia speciosa (L.) Pers, Nature, 190, 1108 (1961).

Phytochemical

investigation

3. C. M Jehan. A keto-fatty acid from Lagerstroemia speciosa seed oil, Phytochemistry, 29, 2323 (1990).

8. A. M. Metwally, AA. Omar, FM. Harraz, SM. El Sohafy. and antimicrobial activity of Psidium guajava L. leaves, Pharmacogn. Mag., 6(23), 212-218 (2010).

4. G. M. Della. Polyoxygenated oleanane triterpenes from L. speciosa, Phytochemistry, 35, 1017 (1994).

of Nauclea

officinalis

9. T. -H. Leea, S. -H. Juang, F. -L. Hsua, C. -Y. Wu. Triterpene acids from the leaves of Planchonella duclitan (Blamco) Bakhuizan, J. Chin. Chem. Soc., 52, 1275-1280 (2005).

5. K. Su, M. Gong, J. Zhou, S. Deng. Study on chemical composition leaves, International Journal of Chemistry, 1(2), 77-81 (2009).

6. R. Biswas, A. Dasgupta, A. Mitra, S. K. Roy, P. K. Dutta, B. Achari, S. G. Dastidar, T. K. Chatterjee.

10. E. Bisoli, W. S. Garcer, L. Hamerski, C. Tieppo, F. R. Garcez. Bioactive Pentacyclic Triterpence from the Stems of Combretum laxum, Molecules, 13, 2717- 2728 (2008).

Corresponding author: Tran Van Loc

Institute of Chemistry Vietnam Academy of Science and Technology 18, Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi E-mail: tvloc@ich.vast.vn.

246

Luận văn Thạc sĩ Khoa học: Nghiên cứu thành phần hóa học của cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa ) ở Việt Nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN THỊ LƢU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA CÂY BẰNG LĂNG NƢỚC

(LAGERSTROEMIA SPECIOSA) Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – năm 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGUYỄN THỊ LƢU

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA CÂY BẰNG LĂNG NƢỚC

(LAGERSTROEMIA SPECIOSA) Ở VIỆT NAM

Mã số : 60440114

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS. TRẦN VĂN LỘC

Hà Nội – năm 2015

LỜI CẢM ƠN!

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

PHỤ LỤC SƠ ĐỒ

PHỤ LỤC PHỔ

MỞ ĐẦU

CHƢƠNG 1

TỔNG QUAN

2.1. Nguyên liệu, hóa chất

CHƢƠNG 3 THỰC NGHIỆM

3.1. Dụng cụ, thiết bị thí nghiệm

Cồn thu hồi

Cao chiết Bằng lăng (200 g)

Cất loại n-hexan

BuOH

1. Hòa trong MeOH/nƣớc 2. Chiết với n-hexan Dịch nƣớc 3. Cất

Chiết với EtOAc

Cất loai EtOAc

Cất loai BuOH

25 g cặn EtOAc

Chất 16 β-Sitosterol 650 mg

28 g cặn

PĐ2 172mg

CH2Cl2/MeOH :9/1

Chất không sạch

Chất 17 GCLB17 65 mg

Chất 18 BL5.3 56 mg

CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

KẾT LUẬN

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

Tiếng Anh

PHỤ LỤC PHỔ

CHEMICAL STUDY OF THE LEAVES OF LAGERSTROEMIA SPECIOSA IN VIETNAM

Tran Van Loc1*, Nguyen Thi Ngan1, Pham Thi Ninh1, Tran Thi Phuong Thao1, Nguyen Thi Luu1, Le Thi Thu Ha1, Nguyen Minh Thu1, Nguyen Thi Van Anh2, Tran Van Sung1 1Institute of Chemistry, Vietnam Academy of Science and Technology 2Traphaco Company, Ngoc Hoi, Hoang Liet, Hoang Mai, Hanoi

Abstract

Keywords. Lagerstroemia speciosa, leaves, quercetin, corosolic acid, asiatic acid.

Plant material: the leaves of L. speciosa have been supplied by Traphaco Company, a herbal exemplar. No.BL02 is deposited in the Research Department of this company.

Chemicals and methods: Silica gel (Merck) with different sizes from 0.040-0.063 mm, reverse phase RP18 and Sephadex LH20 were used for

1: R=H β-sitosterol 3: Quercetin 2: R = β-D-glucopyranosyl

4: R = CH3 (corosolic acid) 5: R = CH2OH (asiatic acid) Table 1: NMR spectral data of 4 and 5

4 (DMSO-d6)

5 (CDCl3 +CD3OD)

9. T. -H. Leea, S. -H. Juang, F. -L. Hsua, C. -Y. Wu. Triterpene acids from the leaves of Planchonella duclitan (Blamco) Bakhuizan, J. Chin. Chem. Soc., 52, 1275-1280 (2005).

Có thể bạn quan tâm

Luận văn Thạc sĩ: Quản lý hoạt động phát triển nhận thức cho trẻ mẫu giáo ở các trường mầm non, huyện Hoàng Su Phì, tỉnh Hà Giang

Nghiên cứu đặc điểm thực vật và khảo sát thành phần hóa học của loài rong Thùy Tseng (Lobophora tsengii D.Tien and Z.Sun) thu tại Hải Phòng

Đặc điểm thực vật và thành phần hoá học của loài rong Mơ Henslo (Sargassum henslowianum J.agardh) thu tại Vĩnh Linh, Quảng Trị

Nghiên cứu thành phần hóa học của Cây Gắm (Gnetum parvifolium) thu hái tại Hòa Bình

Luận văn Thạc sĩ tóm tắt: Pháp luật về điều kiện đầu tư kinh doanh trong lĩnh vực giáo dục, đào tạo ở Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Sự nghiệp nghiên cứu phê bình văn học của Hoài Thanh

Luận văn Thạc sĩ: Tiểu thuyết của Đỗ Phấn từ góc nhìn sinh thái

Luận văn Thạc sĩ: Giải pháp ứng phó với nhập cư ở Liên minh Châu Âu

Luận văn Thạc sĩ: Diễn ngôn về giới nữ trong văn xuôi nữ Việt Nam đương đại (khảo sát sáng tác của Dạ Ngân, Y Ban, Lý Lan, Nguyễn Thị Thu Huệ)

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng mức phát thải tham chiếu rừng khu vực huyện Bảo Lâm tỉnh Lâm Đồng

Luận văn Thạc sĩ: Đặc điểm nhân vật chính trong ba tác phẩm của Franz Kafka: Lâu đài, Vụ án, Hóa thân

Kháo luận tốt nghiệp: Vận dụng lí thuyết học tập trải nghiệm vào dạy học Thống kê - Xác suất ở lớp Hai

Luận văn Thạc sĩ: Xây dựng hệ thống điều khiển và thu nhận dữ liệu cho Robot dịch vụ

Luận văn Thạc sĩ: Thế giới nhân vật trong truyện ngắn Lê Minh Khuê sau năm 1975

Luận văn Thạc sĩ: Tác động của cấu trúc vốn đến hiệu quả hoạt động của các ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam

Luận văn Thạc sĩ: Kiểm soát rủi ro tín dụng bán lẻ tại Ngân hàng Thương mại Cổ phần Đầu tư và Phát triển Việt Nam chi nhánh Thủ Thiêm

Luận văn Thạc sĩ: Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả kinh doanh của ngân hàng thương mại cổ phần niêm yết trên thị trường chứng khoán Việt Nam