Nghiên cứu thu nhận và đánh giá các loại tế bào đệm phục vụ cho nuôi phôi in Vitro

Hứa Nguyệt Mai và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 97(09): 81 - 86<br /> <br /> NGHIÊN CỨU THU NHẬN VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC LOẠI TẾ BÀO ĐỆM PHỤC VỤ<br /> CHO NUÔI PHÔI IN VITRO<br /> Hứa Nguyệt Mai1*, Bùi Xuân Nguyên2,<br /> Nguyễn Văn Hạnh2, Nguyễn Việt Linh2<br /> 1<br /> 2<br /> <br /> Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên<br /> Viện công nghệ sinh học – Viện KH&CN Việt Nam<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Nghiên cứu này được tiến hành với mục đích khảo sát việc thu nhận các loại tế bào đệm phục vụ<br /> cho nuôi phôi in vitro. Thí nghiệm 1 thực hiện trên tế bào màng trong vòi trứng lợn, kết quả cho<br /> thấy: số cụm tế bào thu được ở vòi trứng đẹp, to, ít mạch máu, tốt hơn rõ rệt hơn so với tế bào thu<br /> được ở vòi trứng đẹp, nhỏ và vòi trứng nhiều mạch máu. Tế bào màng trong vòi trứng sau khi giải<br /> đông có chất lượng tương tự như tế bào không đông lạnh. Thí nghiệm 2 thực hiện trên nguyên bào<br /> sợi phôi chuột, kết quả là: các nguyên bào sợi được thu nhận từ các bào thai chuột nhắt trắng, nhân<br /> nuôi trong môi trường DMEM có bổ sung 10% huyết thanh bò. Số lượng nguyên bào sợi trung<br /> bình thu được từ bào thai chuột là 17,76 triệu tế bào. Tốc độ phát triển của các tế bào sau khi đông<br /> lạnh tương tự với các tế bào không đông lạnh. Tóm lại, việc thu nhận, đánh giá chất lượng của tế<br /> bào trước và sau đông lạnh đã được thực hiện trên 2 loại tế bào vòi trứng của lợn và phôi chuột.<br /> Nghiên cứu này sẽ là cơ sở để sản xuất các loại tế bào đệm dùng để cải tiến chất lượng các phôi<br /> nuôi cấy in vitro, phục vụ cho các nghiên cứu y sinh trong tương lai.<br /> Từ khóa: vòi trứng, nguyên bào sợi, phôi, nhân nuôi.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ*<br /> Ngày nay, công nghệ sinh học nói chung và<br /> công nghệ sinh học trong lĩnh vực sinh sản<br /> nói riêng đang rất phát triển và đạt nhiều<br /> thành tựu quan trọng, đem lại nhiều ý nghĩa<br /> và lợi ích thiết thực trong cuộc sống. Phôi là<br /> nguồn vật liệu quan trọng trong chuyển cấy<br /> phôi tạo nguồn động vật đồng loạt, phục vụ<br /> cho các thử nghiệm trong y học, hoặc nhằm<br /> mục đích nâng cao năng suất vật nuôi trong<br /> chăn nuôi hay một ý nghĩa quan trọng là bảo<br /> tồn những loài động vật quý hiếm. Việc tạo ra<br /> được phôi với chất lượng và số lượng tốt là<br /> rất quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng.<br /> Cải tiến môi trường nuôi là một trong những<br /> hướng chính để nâng cao hiệu suất tạo phôi.<br /> Nghiên cứu của chúng tôi được tiến hành với<br /> mục tiêu thu nhận và đánh giá các loại tế bào<br /> đệm bổ sung môi trường nuôi phôi giúp cải<br /> tiến hệ thống nuôi phôi in vitro.<br /> VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG<br /> PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Vật liệu nghiên cứu: Ống dẫn trứng lợn thu<br /> từ các lợn cái Yorkshire (đại bạch) khỏe<br /> *<br /> <br /> Tel: 0973 113 541; Email: nguyetmaimai@gmail.com<br /> <br /> mạnh, không có dị tật, được lấy tại lò mổ ở<br /> Hà Nội. Chuột nhắt trắng được cung cấp bởi<br /> Trung tâm chăn nuôi Động vật thí nghiệm,<br /> Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Bộ Y tế.<br /> Nội dung nghiên cứu:<br /> - Thu, nuôi cấy, đánh giá chất lượng tế bào<br /> màng trong vòi trứng từ ống dẫn trứng lợn.<br /> - Nuôi cấy, đánh giá chất lượng tế bào màng<br /> trong vòi trứng của lợn sau đông lạnh.<br /> - Thu nhận, nhân nuôi, đánh giá chất lượng<br /> tế bào nguyên bào sợi từ thai chuột<br /> - Nhân nuôi và đánh giá chất lượng nguyên<br /> bào sợi từ thai chuột sau đông lạnh.<br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> - Phương pháp thu tế bào màng trong vòi trứng<br /> lợn [1]: Chúng tôi chia làm 3 nhóm thí nghiệm:<br /> Nhóm 1: thu cụm tế bào từ vòi trứng to, đẹp,<br /> ít mạch máu<br /> Nhóm 2: thu cụm tế bào từ vòi trứng nhỏ,<br /> đẹp, ít mạch máu<br /> Nhóm 3: thu cụm tế bào từ vòi trứng có nhiều<br /> mạch máu<br /> Ống dẫn trứng sau khi thu về phòng thí<br /> nghiệm được rửa sạch, cắt bỏ hết các lớp<br /> 81<br /> <br /> Hứa Nguyệt Mai và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> màng bên ngoài, tiến hành thu tế bào bằng<br /> cách cạo nhẹ bề mặt bên trong vòi trứng bằng<br /> kẹp rồi lọc lấy tế bào thành trong, và nuôi<br /> trong môi trường 199 NaHCO3, trong tủ nuôi<br /> ở nhiệt độ 37,5o C trong điều kiện 5% CO2<br /> với độ ẩm bão hòa. Sau 24 giờ đánh giá chất<br /> lượng của các tế bào nuôi. Chất lượng các cụm<br /> tế bào được đánh giá bằng cách quan sát dưới<br /> kính hiển vi soi nổi và phân loại như sau: các<br /> cụm tế bào quay với tốc độ nhanh được đánh<br /> giá là tế bào hoạt động tốt, cụm tế bào quay<br /> với tốc độ chậm là tế bào hoạt động yếu, cụm<br /> tế bào không quay sẽ bị thoái hóa dần. tiến<br /> hành thay môi trường nuôi, sau khi cân bằng<br /> khí chọn những cụm tế bào đẹp, quay khỏe có<br /> thể mang vào nuôi phôi.<br /> - Phương pháp thu tế bào nguyên bào sợi<br /> phôi chuột [1]: tế bào nguyên bào sợi được<br /> thu từ bào thai chuột nhắt trắng.<br /> Các bước tiến hành thu và nhân nuôi tế bào<br /> gồm: Chọn chuột có thai 13-18 ngày tuổi, lấy<br /> <br /> 97(09): 81 - 86<br /> <br /> toàn bộ các thai chuột (còn trong màng ối),<br /> sau đó loại bỏ nhau thai, rốn, màng ối, các<br /> cơ quan nội tạng và thu phần cơ lưng trên<br /> mình thai chuột. Cắt phần mô này thành từng<br /> miếng nhỏ bằng kéo, xử lý với 2ml tripsinEDTA trong vòng 5 phút ở 370C, sau đó<br /> trung hòa tripsin bằng dung dịch DMEM<br /> 10% FCS. Loại bỏ dung dịch sau ly tâm, thu<br /> nhận các tế bào, nhân nuôi trong các đĩa;<br /> Thay môi trường cho đĩa nuôi sau 24 giờ.<br /> Tiếp tục nhân nuôi sau 3-5 ngày khi tế bào<br /> mọc kín đĩa; Nhân nuôi tiếp hoặc đông lạnh<br /> để sử dụng dần.<br /> - Phương pháp xử lý số liệu: số liệu được xử<br /> lý bằng phần mềm Microsoft Excel.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Nghiên cứu phân lập, nuôi cấy tế bào màng<br /> trong vòi trứng<br /> Kết quả tế bào thu được được trình bày ở<br /> bảng 1.<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng chất lượng vòi trứng đến tỷ lệ các cụm tế bào màng trong vòi trứng thu được<br /> <br /> 1860<br /> <br /> Cụm tế bào<br /> hoạt động tốt<br /> 65,3a± 5,1<br /> <br /> Tỷ lệ (%)<br /> Cụm tế bào<br /> hoạt động yếu<br /> 25,81a± 2<br /> <br /> Cụm tế bào<br /> thoái hóa<br /> 8,87a ± 0,95<br /> <br /> 1135<br /> <br /> 55,1b ± 2,6<br /> <br /> 26.43b ±1,1<br /> <br /> 14,98b ± 1,28<br /> <br /> 30 ± 1,1<br /> <br /> c<br /> <br /> 16,15 ±0,4<br /> <br /> 53,85c ± 1,51<br /> <br /> LSDα 0,05 =31,06<br /> <br /> LSD α 0,05 =13,22<br /> <br /> LSD α 0,05 =12,14<br /> <br /> Nhóm<br /> TN<br /> <br /> Tổng số<br /> cụm tế bào<br /> thu được<br /> <br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> <br /> 650<br /> <br /> c<br /> <br /> TN: thí nghiệm<br /> Theo cột dọc các số liệu kết quả mang chữ cái khác nhau thì khác có ý nghĩa thống kê P