Nghiên cứu tổng hợp đồng phân đối quang L nateglinid

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG L-NATEGLINID<br /> Phan Thanh Dũng*, Kyeong Ho Kim**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: Tổng hợp hợp chất đối quang L-nateglinid để làm chất đối chiếu, phục vụ cho công tác kiểm tra độ<br /> tinh khiết quang học của D-nateglinid, một dược chất được sử dụng trong điều trị bệnh đái tháo đường týp 2.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Xây dựng qui trình tổng hợp L-nateglinid từ L-phenylalanin và<br /> acid trans-4-isopropyl cyclohexylcarbonyl clorid. Sản phẩm tổng hợp sau đó được tinh chế bằng cách hòa tan<br /> trong methanol, loại tạp trong môi trường acid và kiềm, và kết tinh trong n-heptan. Độ tinh khiết của Lnateglinid được kiểm tra bằng cách đo điểm chảy, phổ IR, phổ 13C-NMR, năng suất quay cực, HPLC sử dụng cột<br /> sắc ký pha đảo và cột pha tĩnh bất đối.<br /> Kết quả: Đã tổng hợp được L-nateglinid với hiệu suất 26,2%, độ tinh khiết quang học 99,8%.<br /> Kết luận: Sản phẩm tổng hợp L-nateglinid có độ tinh khiết quang học cao, có thể được sử dụng làm chất đối<br /> chiếu để kiểm tra tạp đồng phân của D-nateglinid.<br /> Từ khóa: Natelinde, L-nateglinid, tiểu đường týp 2.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> STUDY ON THE PREPARATION OF L-NATEGLINIDE<br /> Phan Thanh Dung, Kyeong Ho Kim<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 159 - 163<br /> Objectives: The L-enantiomer can be introduced during the synthetic process, the bulk drug substance of<br /> nateglinide often contains minor amounts of the L-enantiomer as an impurity. This work presents a synthesis<br /> method of L-enantiomer for using as reference in monitoring the purity of the bulk drug substance in order to keep<br /> content of the L-enantiomer below approved limit.<br /> Method: The L-nateglinide was synthesized and determined by the chiral HPLC, achiral HPLC, optical<br /> rotation, NMR spectroscopy, infrared spectroscopy, and melting point measurement.<br /> Results: L-nateglinide was synthesized from reaction of trans-4-isopropyl cyclohexylcarbonyl chloride acid<br /> with L-phenylalanine. Purification of L-nateglinide by dissolving in methanol and then adjusting acid-base<br /> conditions to remove impurity. The product was finally crystallized from n-heptan.<br /> Conclusion: L-nateglinide was successfully synthesized with enantiopurity of 99.8%, yield of 26.2%<br /> Keywords: nateglinide, L-nateglinde, type 2 diabetes mellitus.<br /> dược lý và độc tính(2,6).<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Hiện nay khoảng 73% thuốc sử dụng trên<br /> thế giới là dạng đồng phân quang học, trong đó<br /> khoảng 65% thuốc thuộc dạng đối quang(7).<br /> Trong công nghiệp Dược, việc sử dụng các<br /> nguyên liệu là đồng phân quang học ngày càng<br /> được quan tâm và phát triển rất mạnh bởi vì các<br /> đối quang thường khác nhau rõ rệt về tác dụng<br /> <br /> Nateglinid là một dẫn xuất của acid amin có<br /> tác dụng hạ đường huyết bằng cách kích thích<br /> bài tiết insulin từ tuyến tụy. Nateglinid được sử<br /> dụng cho những bệnh nhân đái tháo đường týp<br /> 2. Nateglinid có 2 đồng phân quang học, trong<br /> đó đồng phân D-nateglinid được sử dụng trong<br /> điều trị lâm sàng do có hiệu lực mạnh hơn đồng<br /> phân L-nateglinid. Trong quá trình tổng hợp<br /> <br /> **Khoa Dược Đại học Y Dược TP. HCM.<br /> <br /> **<br /> <br /> Tác giả liên lạc: TS. Phan Thanh Dũng<br /> <br /> ĐT: (84)-983-957-158;<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Đại học Quốc Gia Kangwon, South Korea.<br /> Email: dungpharm@yahoo.com<br /> <br /> 159<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> nguyên liệu D-nateglinid, tạp đồng phân Lnateglinid cần phải được kiểm soát chặt chẽ(4,10).<br /> Hiện nay, chất đối chiếu L-nateglinid chưa được<br /> thương mại hóa. Vì vậy đề tài “Nghiên cứu tổng<br /> hợp đồng phân đối quang L-nateglinid” được<br /> thực hiện để làm chất đối chiếu L-nateglinid,<br /> phục vụ cho công tác kiểm tra độ tinh khiết<br /> quang học của D-nateglinid.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Hóa chất dung môi<br /> Tất cả dung môi hóa chất đều đạt tiêu chuẩn<br /> phân tích: Nateglinid (99.8%): (Korea),<br /> cloroform-d 99.8 % D chứa 0.05% TMS (USA), Lphenylalanin,<br /> trans-4-isopropylcyclohexylcarbonyl clorid, acid trifluoroacetic<br /> (TFA., 99%), n-hexan, methanol, ethanol,<br /> acetonitril, KH2PO4, triethanolamin, NaOH,<br /> KOH, HCl, H3PO4, n-heptan (Japan).<br /> <br /> A<br /> <br /> Trang thiết bị<br /> Hệ thống HPLC LC-10 ADvp Shimadzu, Cột<br /> sắc ký: Chiralcel AD-H (5 µm, 250 × 4.6 mm I.D)<br /> (Japan). Hệ thống HPLC Jasco PU-980, Cột sắc<br /> ký: RS tech ODS C18 (5 µm, 250 × 4.6 mm),<br /> Optimapak. Brucker DPX-400 (400.13 MHZ,<br /> Brucker, Germany), FTS 3000 MX Excalibur,<br /> USA, Fisher Scientific, Malaysia.<br /> <br /> B<br /> <br /> Hình 1. Cấu trúc hóa học của (A) D-nateglinid và (B)<br /> L-nateglinid<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> Điều chế và tinh khiết hóa L-nateglinide(9)<br /> O<br /> <br /> OH<br /> <br /> +<br /> Cl<br /> <br /> NH2<br /> <br /> l-phenylalanin<br /> <br /> KOH 10%<br /> 0<br /> 0<br /> pH: 13,7-14.8, t = 15 C<br /> <br /> trans-4-isopropylcyclohexylcarbonylchlorid<br /> <br /> O<br /> <br /> H3C<br /> CH<br /> <br /> HCl 35%<br /> 0<br /> Khuấy 66 C qua đêm<br /> <br /> C<br /> <br /> HO2C<br /> <br /> *<br /> NH<br /> <br /> H<br /> <br /> H3C<br /> <br /> L-nateglinid<br /> <br /> Đo phổ IR<br /> - L-nateglinid sau khi tổng hợp được hòa tan<br /> trong methanol và kết tinh trong các môi trường<br /> acid và kiềm, sau cùng kết tinh trong n-heptan ở<br /> nhiệt độ sôi sau đó làm lạnh và lọc sẽ thu được<br /> L-nateglinid tinh khiết.<br /> <br /> Trộn mẫu với KBr dập viên và đo trên máy<br /> FTS 3000 MX Excalibur, USA ở bước sóng từ<br /> 4000-400 cm−1, độ phân giải 4 cm−1. Phổ được xử<br /> lý bằng phần mềm Merlin, Version 1.3.<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết của L- nateglinid<br /> <br /> Đo phổ 13 C-NMR<br /> <br /> Đo điểm nóng chảy<br /> Đo trên máy Fisher Scientific, Malaysia.<br /> Microscope Cover Glass, Fisher brand.<br /> <br /> Pha dung dịch có nồng độ 10 mg/mL trong<br /> dung môi là hỗn hợp cloroform-d 99.8% chứa<br /> 0.05% TMS. Đo trên máy Bruker DPX-400<br /> (400.13 MHZ, Bruker, Germany) .<br /> <br /> 160<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> HPLC phân tích L-nateglinide trên cột pha đảo(5)<br /> <br /> HPLC phân tích L-nateglinid trên cột bất đối(8,11):<br /> <br /> Cột sắc ký: RS tech ODS C18 (5 µm, 250 × 4.6<br /> mm), Optimapak. Pha động: acetonitril -10 mM<br /> đệm KH2PO4 (pH 3.0) (70: 30, v/ v). Nhiệt độ cột<br /> phân tích: 20oC. Tốc độ dòng: 1 mL/phút, thể tích<br /> bơm mẫu: 20 µL, Bước sóng phát hiện: UV 210<br /> nm.<br /> <br /> Cột sắc ký: Chiralcel AD-H (5 µm, 250 × 4.6<br /> mm I.D.), (Japan). Pha động: n- hexane-ethanolTFA (75: 25: 0.1, v/ v/ v). Nhiệt độ cột phân tích:<br /> 20 oC. Tốc độ dòng: 1 mL/phút, thể tích bơm<br /> mẫu: 20 µL. Bước sóng phát hiện: UV 210 nm.<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết quang hoạt của Lnateglinid<br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> <br /> Đo trên máy HORIBA-SEPA 300, Japan.<br /> <br /> Đo năng suất quay cực<br /> <br /> Kết quả điều chế và tinh khiết hóa L-nateglinid<br /> 1,06 g L- nateglinid<br /> <br /> 2.4 g L- phenylalanin<br /> <br /> + 15,5 g H2O, + 9,39 g KOH 10 %<br /> <br /> + 8,34 ml MeOH<br /> + 0,13 g NaOH, + 3,7 g H2O<br /> Dung dịch<br /> <br /> Dung dịch<br /> + 7,04 g acetone<br /> + 2,277 g trans-4-isopropylcyclohexylcarbonylchloride 1.5 h<br /> <br /> + từng giọt (HCl: H2O, 0,14 ml, 0,17 ml)<br /> o<br /> ở 10-15 C, khuấy 30 phút<br /> Kết tủa<br /> Lọc, Rửa với 4,2 ml MeOH :H2O (2:1)<br /> <br /> Hỗn hợp phản ứng<br /> + 7.18 g KOH 10 %<br /> <br /> Rửa với 8,3 ml H2O<br /> <br /> - Duy trì pH từ 13.7-14.3<br /> <br /> Sản phẩm thô<br /> Hòa tan với 21,7 ml MeOH<br /> <br /> 0<br /> <br /> - Làm lạnh và duy trì ở 15 C<br /> <br /> + (HCl: H2O, 0,14 ml, 0,17 ml)<br /> Khuấy từ 10 phút<br /> <br /> Sản phẩm acetyl hóa<br /> + 2,73 g H2O<br /> + 2,38 g acetone, 2,6 g HCl 35 %<br /> + 13,03 g H2O để yên 1.5 h<br /> Trầm hiện kết tinh<br /> - Khuấy ở 66oC qua đêm<br /> 1,1 g Tinh thể L- nateglinid<br /> <br /> Hổn dịch<br /> + 16,7 ml n-heptane,đun sôi 1.5 h<br /> o<br /> Làm lạnh, lọc, sấy ở 50 C<br /> <br /> 0,56 g L- nateglinid<br /> <br /> Sơ đồ 1: Điều chế L- nateglinid.<br /> <br /> Sơ đồ 2: Tinh khiết hóa L- nateglinid.<br /> <br /> Bảng 1. Kết quả điều chế và tinh khiết hóa<br /> L-nateglinid.<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết của L-enantiomer<br /> <br /> Khối lượng (g)<br /> <br /> Tinh khiết (%) (HPLC)<br /> <br /> Hiệu suất (%)<br /> <br /> 0.56<br /> <br /> 99.78<br /> <br /> 26,2<br /> <br /> % tinh khiết tính theo HPLC:<br /> % HPLC =<br /> <br /> + 25 ml H2O. Khuấy 20 phút.<br /> - Lọc, rửa tủa<br /> <br /> Đo điểm nóng chảy:<br /> D-nateglinid: tnc: 139°C, L-nateglinid: tnc :<br /> 138.5°C. Nhiệt độ nóng chảy của L-nateglinid<br /> trùng với nhiệt độ nóng chảy của nateglinid.<br /> <br /> Sdinh (enantiomer )<br /> × 100%<br /> Sdinh ( R − enantiomer ) + Sdinh ( S − enantiomer )<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 161<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> Đo phổ IR<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết (tạp chất liên quan) của<br /> L-nateglinid bằng HPLC trên cột pha đảo<br /> <br /> A. L- nateglinid<br /> <br /> A. Mẫu trắng<br /> <br /> B. nateglinid<br /> <br /> B. D-nateglinid<br /> -1<br /> (cm )<br /> <br /> C. L-nateglinid<br /> <br /> Hình 3. Phổ IR của L-nateglinid và nateglinid<br /> Phổ IR của L-nateglinid tương tự phổ IR của<br /> D-nateglinid.<br /> <br /> Hình 5. Sắc ký đồ : A. Mẫu trắng, B. 100 μg/mL<br /> nateglinid, C. 100 μg/mL L-nateglinid. Cột sắc ký: RS<br /> tech ODS C18 (5 μm, 250 × 4.6 mm), Optimapak.<br /> Độ tinh khiết sắc ký trên cột pha đảo là<br /> 99,78%.<br /> <br /> Đo phổ 13C-NMR<br /> A. L- nateglinid<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết quang học của Lnateglinid bằng phương pháp HPLC trên cột<br /> bất đối<br /> Bảng 3. Độ tinh khiết quang hoạt của L-nateglinid<br /> Khối lượng (g)<br /> 0,56<br /> <br /> B. D-nateglinid<br /> <br /> Tinh khiết (%) (HPLC) Hiệu suất (%)<br /> 99,8<br /> 26,2<br /> <br /> Hình 4. Phổ 13C-NMR của D-nateglinid, Lnateglinid, 400 MHZ.<br /> <br /> A. Mẫu trắng<br /> <br /> Phổ 13C-NMR của L-nateglinid và Dnateglinid tương tự nhau<br /> <br /> B. D-nateglinid<br /> <br /> Bảng 2. Các đỉnh đặc trưng của D-nateglinid và Lnateglinid trong phổ 13C-NMR<br /> TT<br /> <br /> 1<br /> <br /> L-nateglinid TT Nateglinid L-nateglinid<br /> Dnateglinid δ (ppm)<br /> δ (ppm)<br /> δ (ppm)<br /> δ (ppm)<br /> 19,653<br /> 19,657<br /> 12<br /> 76,685<br /> 76,679<br /> <br /> 2<br /> <br /> 28,807<br /> <br /> 28,808<br /> <br /> 13<br /> <br /> 77,003<br /> <br /> 76,996<br /> <br /> 3<br /> <br /> 28,903<br /> <br /> 28,903<br /> <br /> 14<br /> <br /> 77,204<br /> <br /> 77,197<br /> <br /> 4<br /> <br /> 29,342<br /> <br /> 29,348<br /> <br /> 15<br /> <br /> 77,320<br /> <br /> 77,313<br /> <br /> 5<br /> <br /> 29,676<br /> <br /> 29,675<br /> <br /> 16<br /> <br /> 125,970<br /> <br /> 126,993<br /> <br /> 6<br /> <br /> 32,690<br /> <br /> 32,691<br /> <br /> 17<br /> <br /> 128,398<br /> <br /> 128,419<br /> <br /> 7<br /> <br /> 37,263<br /> <br /> 37,249<br /> <br /> 18<br /> <br /> 129,423<br /> <br /> 129,415<br /> <br /> 8<br /> <br /> 43,133<br /> <br /> 43,134<br /> <br /> 19<br /> <br /> 135,979<br /> <br /> 135,953<br /> <br /> 9<br /> <br /> 45,402<br /> <br /> 45,394<br /> <br /> 20<br /> <br /> 173,515<br /> <br /> 173,570<br /> <br /> 10<br /> <br /> 50,588<br /> <br /> 50,627<br /> <br /> 21<br /> <br /> 176,417<br /> <br /> 176,458<br /> <br /> 11<br /> <br /> 52,804<br /> <br /> 52,834<br /> <br /> C. L-nateglinid<br /> <br /> D. L-nataglinid/nateglinid<br /> <br /> Hình 6. Sắc ký đồ : A. Mẫu trắng, B. 100 μg/mL Dnateglinid, C. 100 μg/mL L-nateglinid. D. Lnateglinid /L-nateglinid. Cột sắc ký:: AD-H column<br /> (5 μm, 250 × 4.6 mm).<br /> Độ tinh khiết sắc ký trên cột bất đối là 99.8%.<br /> <br /> Đo năng suất quay cực:<br /> <br /> [α ]20D = −9.40 (C=<br /> D<br /> L-nateglinid [α ]20 = +9.40<br /> <br /> D-nateglinid<br /> /MeOH),<br /> <br /> 1<br /> <br /> mol<br /> <br /> (C=<br /> <br /> 1<br /> <br /> mol/MeOH).<br /> <br /> 162<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011<br /> KẾT LUẬN<br /> Bằng phản ứng amid hóa giữa Lphenylalanin<br /> và<br /> acid<br /> trans-4-isopropylcyclohexylcarbonyl clorid trong điều kiện môi<br /> trường kiềm và nhiệt độ dưới 15 0C đã điều chế<br /> được L-nateglinid, sau khi tinh chế loại tạp Lnateglinid được kiểm tra độ tinh khiết bằng các<br /> kỹ thuật hiện đại và mẫu L-nateglinid đạt độ<br /> tinh khiết quang học cao 99,78%, hiệu suất tổng<br /> hợp 26,2% cho phép làm chất đối chiếu để kiểm<br /> tạp đồng phân của nateglinid.<br /> <br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1.<br /> 2.<br /> <br /> 3.<br /> <br /> Collins A.N., Sheldrake G.N., Crosby J.C., In Industry, John<br /> Wiley, New York, (1994).<br /> Drayer D.E., Pharmacodynamic and pharmacokinetic<br /> differences between drug enantiomers in humans: An<br /> overview. Clin. Pharmacol. Theor (1986), 40, 125.<br /> ICH Harmonised Tripartite Guideline, International<br /> Conference on Harmonisation of Technical Requirements for<br /> Registration of Pharmaceuticals for Human Use, “Validation of<br /> Analytical Procedure Text and Methodology Q2 (R1)”, November<br /> 2005.<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Khoa<br /> <br /> 4.<br /> <br /> 5.<br /> <br /> 6.<br /> 7.<br /> 8.<br /> <br /> 9.<br /> 10.<br /> <br /> 11.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Keilson L., Mather S., Walter Y.H., Subramanian S., Mcleod<br /> J.F., Synergistic Effects of Nateglinide and Meal<br /> Administration on Insulin Secretion in Patients with Type 2<br /> Diabetes Mellitus. J. Clin. Endocrinol. Metab (2000), 85, 1081.<br /> Maddi S., Keshetty S., Mohan Ega C., Yamasani M.R., Scriba<br /> G.K., Development and validation of a stereoselective HPLC method<br /> for the determination of the in vitro transport of nateglinide<br /> enantiomers in rat intestine. J Sep Sci., 30 (12) (2007), 1875-1880<br /> Maier N.M., Lindner W., Stereoselective Chromatographic<br /> Methods for Drug Analysis. Chirality in drug research, 2006.<br /> Miller S., Office of New Drug Quality Assessment Center for<br /> Drug Evaluation and Research, FDA, 2006.<br /> Qi M., Wang P., Sun Y., Li Y., Determination of the LEnantiomer of Nateglinide in a Bulk Drug Substance by<br /> Chiral Reversed-Phase Liquid Chromatography. J. Liq.<br /> Chromatogr. Related Technol (2003), 26, 1839<br /> Takahashi, United States Patent, Patent No: US 7,208,622 B2,<br /> Date of Patent: Apr 2007, 24.<br /> Whitelaw D.C., Clark P.M., Smith J.M., Nattrass M., Effects of<br /> the new oral hypoglycaemic agent nateglinide on insulin<br /> secretion in Type 2 diabetes mellitus. Diabetes Med., (2000).17,<br /> 225<br /> Yang G., Yin J., Li Z., Liu H., Cai L., Wang D., Chen Y., Chiral<br /> Separation of Nateglinide and its L Enantiomer on a<br /> Molecularly Imprinted Polymer-Based Stationary Phase.<br /> Chromatographia (2004), 59, 705-708.<br /> <br /> 163<br /> <br />