zunia.vn

Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z

zunia.vn

» Nông - Lâm - Ngư

» Nông nghiệp

Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật One-step RT-PCR chẩn đoán nhanh virus gây bệnh vàng lụi (vàng lá di động) gây hại trên lúa ở Việt Nam

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Báo xấu

4
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết trình bày nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật One-step RT-PCR chẩn đoán nhanh virus gây bệnh vàng lụi (vàng lá di động) gây hại trên lúa ở Việt Nam; One-step RT-PCR chẩn đoán virus gây bệnh vàng lụi lúa.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật One-step RT-PCR chẩn đoán nhanh virus gây bệnh vàng lụi (vàng lá di động) gây hại trên lúa ở Việt Nam

T¹p chÝ khoa häc vμ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 2. Bộ Tài nguyên và Môi trường (2007). Kế 6. Phạm Quốc Hoàng (2013). Kết quả nghiên cứu hoạch quốc gia về thích ứng với biến đổi đánh giá các giống lúa chịu hạn tuyển chọn. khí hậu. Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học năm 3. Bộ Tài nguyên và Môi trường (2009). Kịch 2013, Sở Nông nghiệp và PTNT Phú Yên. bản biến đổi khí hậu, nước biến dâng cho 7. Lê Quang Vịnh (2013). Kết quả nghiên cứu Việt Nam. đánh giá các giống lúa chịu hạn tuyển 4. Cục Trồng trọt, tháng 8/2014. Báo cáo tổng chọn. Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học kết tình hình sản xuất lúa gạo 6 tháng đầu năm 2013, Chi cục BVTV tỉnh Khánh Hòa. năm 2014. 5. Nguyễn Văn Hải (2013). Kết quả nghiên Ngày nhận bài: 7/2/2015 cứu đánh giá các giống lúa chịu hạn tuyển Người phản biện: PGS.TS. Nguyễn Văn Viết chọn. Báo cáo kết quả nghiên cứu khoa học Ngày phản biện: 24/2/2015 năm 2013, Trạm khuyến nông huyện Lệ Ngày duyệt đăng: 14/3/2015 Thủy, Quảng Bình. NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT ONE-STEP RT-PCR CHẨN ĐOÁN NHANH VIRUS GÂY BỆNH VÀNG LỤI (VÀNG LÁ DI ĐỘNG) GÂY HẠI TRÊN LÚA Ở VIỆT NAM Tạ Hoàng Anh 1 , Nguyễn Văn Chung 1 , Nguyễn Doãn Phương 1 , Phạm Thị Lương 1 , Nguyễn Văn Tuất2 ABSTRACT One-step RT-PCR for detection of rice yellow stunt (Rise transitory yellowing) virus in Vietnam One-step RT-PCR was optimized for detection of Rice yellow stunt virus (RYSV) on rice and green leafhopper, the transmission vector. Three pairs of primer were designed and selected based on the genomic sequences of RYSV downloaded from GenBank and used for detection of RYSV on infected samples in Vietnam. Different parts of infected rice plant and green leafhopper were tested. All parts of infected rice plants including fresh and dried samples can be used for the detection except the dried root. The same procedure was used and succeeded in detecting the virus from single insect of GLH collected and preserved in absolute alcohol. This protocol was used routinely at Plant Protection Research Institute for detection of RYSV on rice and GLH samples collected from different provinces in Vietnam. Key words: Rice virus, transitory yellowing rirus, yellow stunt virus, detection, RT-PCR I. ĐẶT VẤN ĐỀ 12 Trong khoảng 1 thập niên trở lại đây, (Tạ Hoàng Anh và ctv., 2009; Anh et al., các bệnh virus đã liên tục bùng phát và gây 2011; Anh et al., 2012a; Anh et al., 2012b). hại nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo trên Kỹ thuật PCR và one-step RT-PCR đã được phạm vi cả nước, đe dọa an ninh lương thực nghiên cứu và ứng dụng đem lại hiệu quả cao, góp phần quan trọng trong công tác nghiên cứu và chỉ đạo sản xuất của Viện 1 Viện Bảo vệ Thực vật. Bảo vệ Thực vật (BVTV) trong các đợt 2 Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam dịch diễn ra như dịch rầy nâu (RN), bệnh 9
T¹p chÝ khoa häc vμ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam vàng lùn (VL) và lùn xoắn lá (LXL) ở các quản trong bẹ chuối hoặc xử lý bằng tỉnh phía Nam những năm 2006-2008; dịch phương pháp ép khô mẫu trong giấy bản lùn sọc đen phương Nam (LSĐPN) ở các (Anh et al., 2011 và 2012a) rồi gửi đến tỉnh miền Bắc và miền Trung vụ Mùa 2009 phòng thí nghiệm của Viện BVTV. và 2010; dịch vàng lụi ở Hiệp Hòa (Bắc Rầy xanh đuôi đen thu tại ruộng bệnh Giang) vụ Mùa 2009 và 2010 và tái bùng được bảo quản ngay trong cồn tuyệt đối phát vụ Mùa 2013 và 2014. trước khi gửi đến phòng thí nghiệm của Các quy trình chẩn đoán bệnh VL, LXL Viện BVTV. và LSDPN bằng kỹ thuật one-step RT-PCR sử dụng các cặp mồi đặc hiệu đã được xây 2.2. Tách chiết RNA tổng số bằng Trizol dựng kịp thời và công bố trên các tạp chí Các bước cơ bản và thành phần hóa trong và ngoài nước (Tạ Hoàng Anh và ctv., chất được phỏng theo hướng dẫn của nhà 2009; Anh et al., 2011). Một quy trình sản xuất (Invitrogen) và quy trình chẩn tương ứng cũng đã được xây dựng và thử đoán virus gây bệnh VL và LXL (Tạ Hoàng nghiệm tại phòng thí nghiệm của Viện Anh và ctv., 2009). BVTV cho kết quả nhanh, chính xác và a) Tách chiết RNA tổng số từ mẫu lá: hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh virus 0,1 g mẫu tươi hoặc 0,03 g mẫu khô được gây bệnh vàng lụi (hay còn gọi vàng lá di nghiền bằng chày/cối sứ với 2 ml Trizol. động, hoặc vàng lá tạm thời) từ các mẫu Dịch nghiền được chuyển vào 1 ống tuýp cây lúa nhiễm bệnh và rầy xanh đuôi đen dung tích 1,5 ml, giữ ở nhiệt độ phòng 5 (RXĐĐ)-môi giới truyền bệnh. phút trước khi tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút. Sau khi ly tâm, II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU phần dịch trong phía trên (900 µl) được 1. Vật liệu nghiên cứu chuyển sang 1 tuýp khác và thêm 400 µl Chloroform, lắc thật mạnh hoặc vortex. Giữ - Mã truy cập trình tự gen của virus gây tuýp ở nhiệt độ phòng 5 phút trước khi tiến bệnh vàng lụi lúa: NC_003746. hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 - Vật liệu nhiễm virus: Cây lúa nhiễm phút. Phần dịch trong phía trên (500 µl) lại bệnh thu thập ngoài đồng ruộng và sau lây được chuyển sang 1 tuýp khác và RNA bệnh nhân tạo trong nhà lưới; rầy xanh đuôi được kết tủa bằng 250 µl ice-cold đen thu thập tại ruộng bệnh và tại bẫy đèn Isopropanol và 250 µl 2M NaCl. Lắc mạnh trong vùng bệnh. và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. - Các loại hóa chất phân tích và dụng cụ Loại bỏ phần dịch trong và rửa phần kết tủa chuyên dùng: Pippet, Trizol, Chloroform, 3 lần với cồn 70% và 1 lần cuối bằng cồn Isopropanol... Taq-DNA polymerase và tuyệt đối. Để khô tuýp ở nhiệt độ phòng rồi Reverse-Aid M-MuLV (Fermentas), hệ hòa tan RNA thu được bằng 100 µl Rnase- thống điện di ngang, máy PCR..., hệ thống free H2O. chụp ảnh gel. b) Tách chiết RNA tổng số từ cá thể rầy: Các bước tương tự như với mẫu lá, chỉ 2. Phương pháp nghiên cứu khác ở một số bước: (i) lượng Trizol là 650 2.1. Thu thập và bảo quản mẫu bệnh µl/cá thể rầy; (ii) bỏ bước ly tâm đầu tiên Cây lúa ngoài đồng ruộng với các triệu nhưng thêm 5 phút ủ mẫu trong bể cách chứng điển hình nhiễm virus vàng lụi (Anh thủy 65oC sau khi để ở nhiệt độ phòng 10 et al., 2012b và 2013) được thu thập và bảo 10
T¹p chÝ khoa häc vμ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam phút; (iii) bước cuối cùng: hòa tan lượng kết 100U Reverse-Aid M-MuLV (Fermentas) tủa với 20 µl Rnase-free H2O (Invitrogen). và 2,5U Taq-DNA polymerase (Fermentas) trong tổng thể tích 25 µl. Quy trình này c) Đo nồng độ RNA: Theo bảng hướng được thực hiện trên máy Perkin-Elmer dẫn sử dụng trên máy đo NANO-DROP 2000 thermal cycler (USA). ND-100. 2.3. One-step RT-PCR trên các loại mẫu III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN khác nhau 1. Tách chiết RNA tổng số bằng Trizol Quá trình phiên mã ngược được thực Hàm lượng và độ tinh khiết của RNA là hiện trong 30 phút tại 42oC. Tiếp theo, quá một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến phản trình khuyếch đại sản phẩm PCR được thực ứng RT-PCR. Sử dụng Trizol trong tách hiện lần lượt với 94oC trong 2 phút, 30 chiết và tinh sạch RNA tổng số luôn đem lại vòng khuyếch đại (94oC trong 30 giây, kết quả tốt và ổn định trong việc chẩn đoán 52oC trong 30 giây và 72oC trong 60 giây), (Tạ Hoàng Anh và ctv., 2009) cũng như 72oC trong 10 phút và kết thúc bằng 15oC. nghiên cứu (Anh et al., 2012a) về các loại Thành phần hóa chất trong mỗi tuýp phản virus gây bệnh trên lúa tại Viện BVTV. Kết ứng gồm: 1X PCR buffer; 2,5 mM MgCl2; quả đo nồng độ RNA tổng số tách chiết từ 0,2 mM dNTPs; 0,2 µM forward-primer; mẫu cây lúa nhiễm bệnh vàng lụi và rầy 0,2 µM reverse-primer; 0,5-2 µg RNA; xanh đuôi đen được thể hiện trên bảng 1. Bảng 1. Nồng độ RNA tổng số đo trên máy NANO-DROP ND-100 (ng/µl) (Viện Nghiên cứu Phát triển - Pháp, 2012) Mẫu lúa tươi (ng/µl) Mẫu lúa khô (ng/µl) Mẫu RXĐĐ (ng/µl) 322,5 399,0 228,7 199,5 248,5 241,2 228,3 578,8 326,3 217,8 183,4 176,5 518,7 398,6 415,8 337,4 197,8 263,7 316,8 622,6 356,4 416,2 130,4 406,5 221,2 435,7 219,6 362,7 236,7 198,6 Trung bình: 404,2 Trung bình: 308,0 Trung bình: 228,3 Kết quả trên bảng 1 cho thấy mẫu lúa 2. One-step RT-PCR chẩn đoán virus tươi có hàm lượng RNA tổng số thu được gây bệnh vàng lụi lúa cao hơn so với mẫu lúa khô (404,2 ng/µl so 2.1. Thiết kế cặp mồi đặc hiệu cho virus với 308,0 ng/µl). Nồng độ RNA tổng số gây bệnh vàng lụi ở Việt Nam tách chiết từ mỗi cá thể RXĐĐ bình quân Các cặp mồi RTYV-F1/-R1, RTYV- cũng đạt 228,3 ng/µl. Kết quả này luôn ổn F2/-R2 và RTYV-F3/-R3 với kích thước của định và tương đương với kết quả tách chiết các sản phẩm PCR tương ứng là 347bp, RNA tổng số trong quy trình chẩn đoán 444bp và 425bp đã được thiết kế sử dụng virus gây bệnh VL và LXL (Tạ Hoàng Anh phần mền VectorNTI-11 dựa trên trình tự bộ và ctv., 2009) hay LSĐ-PN (Anh et al., gen của virus gây bệnh vàng lụi (RYSV) đã 2011) của Viện BVTV. được lưu giữ trên GenBank (mã truy cập: NC_003746). Kết quả thử nghiệm trên mẫu cây lúa nhiễm bệnh đã cho thấy cả 3 cặp mồi này đều có thể sử dụng để chẩn đoán RYSV. 11
T¹p chÝ khoa häc vμ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam RYSV-R2 RYSV-F1 RYSV-F2 RYSV-R1 RYSV-F3 RYSV-R3 RYSV-F2/R2 (444 bp) RYSV-F1/R1 (347 bp) RYSV-F3/R3 (425 bp) RYSV (NC 003746)F1-R1 14042 bp Hình 1. Mô phỏng vị trí các cặp mồi đặc hiệu cho virus gây bệnh vàng lụi (RYSV) và sản phẩm PCR tương ứng trên bộ gen của RYSV (kích thước của sản phẩm PCR tương ứng được để trong ngoặc đơn). NC_003746 là mã truy cập trình tự gen của virus gây bệnh vàng lụi lúa từ GenBank. Hình 2. Mô phỏng các vị trí sai khác của các đoạn trình tự RYSV Việt Nam thu được từ sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi RTYV-F1/RTYSV-R1 và đoạn trình tự tương ứng của RYSV lưu giữ trên GenBank. Sản phẩm PCR của các mẫu thu thập từ 2.2. Chẩn đoán virus gây bệnh vàng lụi Bắc Giang (vụ Mùa 2010), Long An và Đánh giá độ nhạy và tính đặc hiệu của Tiền Giang (vụ Đông Xuân 2011) đã được quy trình, các loại mẫu khác nhau đã được đọc trình tự và so sánh với đoạn gen tương thử nghiệm, bao gồm: (i) các bộ phận khác ứng của RYSV được lưu giữ trên GenBank. nhau trên cây lúa: lá, bẹ lá và rễ; (ii) mẫu Kết quả so sánh trình tự đoạn gen thu được tươi và mẫu đã ép khô; và (iii) rầy xanh từ sản phẩm PCR của cặp mồi RYSV- đuôi đen thu thập tại ruộng bệnh hoặc bẫy F2/R2 (444bp) cho thấy giữa các đoạn trình đèn và được bảo quản ngay trong cồn tuyệt tự của Việt Nam chỉ có 2 vị trí sai khác đối. Kết quả cho thấy phương pháp ép khô (mũi tên màu đỏ, hình 2) và có 4 vị trí sai mẫu có thể áp dụng cho việc bảo quản mẫu khác giữa các đoạn trình tự của Việt Nam cây lúa nhiễm virus vàng lụi: cả lá và bẹ lá (hoàn toàn giống nhau tại các vị trí này) với ép khô và tất cả các bộ phận tươi của cây trình tự của Trung Quốc được lưu giữ tại lúa nhiễm bệnh đều cho kết quả dương tính rõ nét ngoại trừ rễ cây lúa ép khô (hình 3). GenBank (mũi tên màu đen, hình 2). Cho Kết quả này cũng tương tự như khi giám đến hết năm 2014, tổng số đã có trên 2.000 định virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá mẫu lúa và cá thể RXĐĐ được chẩn đoán (Anh et al., 2009) hay lùn sọc đen phương sử dụng các cặp mồi nói trên và đều cho Nam (Anh et al., 2011). Kết quả này cũng kết quả nhanh, chính xác và ổn định, trong bổ sung cho việc hướng dẫn phương pháp đó cặp mồi RYSV-F2/R2 được sử dụng thu thập và bảo quản mẫu trước khi gửi đến nhiều nhất. phòng thí nghiệm. 12
T¹p chÝ khoa häc vμ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam Rầy xanh đuôi đen đã được thu thập và quản trong cồn tuyệt đối cũng cho kết quả bảo quản trong cồn tuyệt đối và duy trì ở dương tính rõ nét, tương đương với mẫu đối nhiệt độ phòng 30 ngày trước khi giám định chứng cây lúa nhiễm bệnh (hình 3: phải). virus vàng lụi bằng quy trình tương tự. Kết Kết quả tương tự cũng thu được khi lặp lại quả cho thấy chỉ cần 1 cá thể RXĐĐ bảo với các mẫu rầy bảo quản sau 14 tháng. W + H 1 2 M (1) (2) (3) (4) 500 444 444 bp Hình 3: Kết quả giám định virus vàng lụi, sử dụng cặp mồi RYSV-F2/R2 (444bp): Trái: Kết quả giám định với mẫu lúa tươi (số 1) và mẫu lúa ép khô (số 2). W, + và H: mẫu đối chứng nước, cây lúa bệnh và cây lúa khỏe; M: 1 Kb marker. Phải: Kết quả giám định trên mẫu rầy xanh đuôi đen (số 1). (2) và (3): Mẫu đối chứng cây lúa khỏe và cây lúa bệnh. (4) 1 Kb marker. IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Kết luận 1. Tạ Hoàng Anh, Nguyễn Doãn Phương, Đặng Thị Lan Anh, Phạm Thị Vượng, Ngô - Quy trình tách chiết RNA tổng số sử Khắc Giang, Đỗ Hồng Khanh và Nguyễn dụng Trizol cho RNA với hàm lượng cao, Văn Tuất (2013). Bệnh vi rút vàng lụi lúa chất lượng tốt, bình quân đạt 400, 300 và tái bùng phát ở Hiệp Hòa-Bắc Giang, vụ 200 ng/µl tương ứng với mẫu lúa tươi, lúa Mùa 2013. Tạp chí BVTV, số 6/2014 khô và cá thể rầy xanh đuôi đen. 2. Hoang Anh Ta, Doan Phuong Nguyen, Sandrine Causse, Thanh Duc Nguyen, Vinh - Quy trình one-step RT-PCR sử dụng 1 Vien Ngo, Eugenie Hebrard (2012a). trong 3 cặp mồi RYSV-F/R-1~3 cho kết quả Molecular diversity of Rice grassy stunt virus rõ nét, ổn định khi giám định virus vàng lụi in Vietnam. Virus Genes, 46(2): 383-386. lúa với kích thước các sản phẩm PCR tương 3. Hoang Anh Ta, Doan Phuong Nguyen, Van ứng là 347bp, 444bp và 425bp. Chung Nguyen, Thi Thu Huyen Tran, Thi - Có thể giám định virus vàng lụi ở tất Luong Pham, Eugénie Hébrard, Vinh Vien cả các bộ phận của cây lúa, cả mẫu tươi và Ngo (2012b). New yellowing syndrome mẫu ép khô, ngoại trừ rễ ép khô. caused by Rice transitory yellowing virus on rice in some areas of Mekong delta. 2. Đề nghị Journal of Vietnam Academy of Agricultural Sciencce, 1:12-18. Quy trình tách chiết RNA tổng số sử 4. Hoang-Anh Ta, Jian Yang, Jian-ping Chen, dụng Trizol và quy trình one-step RT-PCR Eugénie Hébrard, Guo-hui Zhou, Vien Ngo có thể áp dụng chung cho tất cả các đối Vinh, Jia-an Cheng (2011). Identification, tượng virus gây bệnh trên lúa và chỉ cần characterization, and distribution of thay đổi nhiệt độ bắt cặp mồi tương ứng với Southern rice black-streaked dwarf virus in từng cặp mồi đặc hiệu riêng. Vietnam. Plant Dis. 95:1063-1069. 13
T¹p chÝ khoa häc vμ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam 5. Tạ Hoàng Anh, Ngô Vĩnh Viễn, Nguyễn Ngày nhận bài: 7/2/2015 Tuấn Anh, Trần Thu Huyễn, Nguyễn Văn Người phản biện: PGS.TS. Nguyễn Văn Viết Chung, Nguyễn Doãn Phương (2009). Ngày phản biện: 24/2/2015 Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật one-step RT- Ngày duyệt đăng: 14/3/2015 PCR chẩn đoán nhanh virus gây bệnh vàng lùn và lùn xoắn lá hại lúa. Tạp chí BVTV, số 5/2009: 21-26. NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ SỬ DỤNG PHÂN VIÊN NÉN DÚI SÂU NK CHO CÂY LÚA Ở THANH HÓA Nguyễn Hồng Sơn1 , Trần Văn Thắng 2 ABSTRACT Efficiency of deep thrust-tablet fertilizer NK for rice in Thanh Hoa To improve the efficiency of fertilizer, vaious NPK and deep thrust-tablet fertilizers have been developed to meet the nutritional requirements of each crop and growth stages. This article introduces new research findings in Thanh Hoa on usability of NK tablets to replace nitrogen, potassium in rice production, contributing to improving the efficiency of fertilizer, improving crop productivity and economic efficiency for the slope land area of Thanh Hoa. It was indicated that in both low land and terraced field, the use of NK tablet provided absolutely no adverse effects, but also significantly improves rice growth and reproductive indicators such as plant height, number of effective tillers, leaf area index, dry matter weight, number of spiklets/hill and number of spiklets/m2, thereby increasing crop productivity and yield. When using NK tablet fertilizer, the infection of major insects and diseases such as Brown plant hopper, sheath blight is significantly reduced as compared with conventional application of manure + inorganic fertilizers (N, P, K). The infection of other pests such as rice stem borer, leaf folders, blast, blight is not quite clear. The cost for NK tablet roughly equivalent to the single N, P, K use, but thank to the increase of crop yield, it can bring higher net benifit and Marginal Benefit Cost Ratio (MBCR). However, using NK tablet without manure provided lower crop yield and economic efficiency than traditional farming (manure + N, P, K). The study also showed that MBCR in all cases of using NK tablet is higher than 2. It means that NK tablet fertilizer should be encouraged to apply. Key words: Deep thrust tablets, rice, manure, N fertilizer, phosphate, potassium. I. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Sử dụng hiệu quả phân bón đang là đón nhận. Tuy nhiên, để phù hợp với từng một chủ đề được nhiều nhà khoa học và loại cây trồng và từng vùng sinh thái, mỗi nông dân quan tâm. Một trong những loại phân phải có thành phần và hàm lượng nguyên nhân làm giảm hiệu quả phân bón dinh dưỡng phù hợp. Cho đến nay phân là sự rửa trôi bề mặt dẫn đến thất thoát lớn các dạng phân hỗn hợp đều chứa đầy phân đặc biệt là phân đạm và kali. Để khắc đủ ba thành phần đạm, lân, kali. Việc hỗn phục hạn chế này, gần đây các nhà khoa hợp này đôi khi gây lãng phí vì nhu cầu học và các nhà sản xuất đã đưa ra loại tiêu thụ phân bón của cây trồng đặc biệt là phân nén dúi sâu. Tiến bộ kỹ thuật này đã cây lúa có sự thay đổi giữa các thời kỳ sinh được nông dân ở nhiều vùng nhanh chóng trưởng khác nhau. Phần lớn phân lân được sử dụng để bón lót, trong khi đó đạm và 1 kali được sử dụng để bón thúc. Để đáp ứng Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam; 2 đa dạng sản phẩm cho từng giai đoạn sinh Thiết Ống, Bá Thước, Thanh Hóa. 14

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.