Nghiên cứu xác định đa hình C677T trên gene MTHFR bằng kỹ thuật PCR-RFLP ở bệnh nhân có tinh dịch đồ bất thường

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

4
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đa hình C677T trên gene MTHFR là một yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý khác nhau, bao gồm vô sinh nam. Mục tiêu: Đề tài được thực hiện nhằm các mục tiêu: Hoàn thiện kỹ thuật PCR-RFLP với cặp mồi tự thiết kế để xác định đa hình C677T trên gene MTHFR; Xác định tỷ lệ các đa hình tại C677T của gene MTHFR trên nhóm người tình nguyện và nhóm bệnh nhân có bất thường tinh dịch đồ.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu xác định đa hình C677T trên gene MTHFR bằng kỹ thuật PCR-RFLP ở bệnh nhân có tinh dịch đồ bất thường

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH ĐA HÌNH C677T TRÊN GENE MTHFR BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP Ở BỆNH NHÂN CÓ TINH DỊCH ĐỒ BẤT THƯỜNG Hà Thị Minh Thi1, Nguyễn Thị Nguyệt Minh2 (1) Bộ môn Di truyền Y học, Trường Đại học Y Dược Huế (2) Sinh viên Y năm 5, Trường Đại học Y Dược Huế Tóm tắt: Đặt vấn đề: Đa hình C677T trên gene MTHFR là một yếu tố nguy cơ của nhiều bệnh lý khác nhau, bao gồm vô sinh nam. Mục tiêu: Đề tài được thực hiện nhằm các mục tiêu: 1. Hoàn thiện kỹ thuật PCR-RFLP với cặp mồi tự thiết kế để xác định đa hình C677T trên gene MTHFR. 2. Xác định tỷ lệ các đa hình tại C677T của gene MTHFR trên nhóm người tình nguyện và nhóm bệnh nhân có bất thường tinh dịch đồ. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Tách chiết DNA từ máu ngoại vi của 60 người tình nguyện và 30 người có tinh dịch đồ bất thường. Thiết kế cặp mồi bằng phần mềm FastPCR và hoàn thiện kỹ thuật PCR-RFLP. Kiểm chứng kết quả bằng phương pháp xác định trình tự. Xác định tỷ lệ các đa hình C677T. Kết quả: Đã thiết kế được cặp mồi cho phép khuếch đại đoạn gene MTHFR chứa vị trí đa hình 677 và luôn có một vị trí cắt bắt buộc (làm chứng nội). Tỷ lệ 677CC là 71,67%; 677CT là 25%; 677TT là 3,33% trong nhóm tình nguyện. Tỷ lệ các đa hình trong nhóm bệnh nhân có tinh dịch đồ bất thường là 677CC chiếm 66,67% ; 677CT chiếm 30% và 677TT chiếm 3,33%. Các tỷ lệ này trong nhóm vô tinh lần lượt là 53,34% ; 40% và 6,66%. Trong nhóm thiểu năng tinh trùng lần lượt là 80% ; 20% và 0%. Kết luận: Đã hoàn thiện thành công kỹ thuật PCR-RFLP để xác định đa hình C677T trên gene MTHFR. Xác định được tỷ lệ các đa hình C677T ở nhóm người tình nguyện và các nhóm bất thường tinh dịch đồ. Abstract: STUDY ON IDENTIFYING THE C677T POLYMORPHISM OF MTHFR GENE BY PCR-RFLP TECHNIQUE IN PATIENTS WITH ABNORMAL SEMEN ANALYSIS Ha Thi Minh Thi, Nguyen Thi Nguyet Minh Department of Human Genetics, Hue University of Medicine and Pharmacy The fifth student, Hue University of Medicine and Pharmacy Background: The C677T polymorphism of MTHFR gene is a risk factor of many diseases, including male infertility. This study is aimed at: 1. Improving a PCR-RFLP process with the own designed primers to identify the C677T polymorphism of MTHFR gene. 2. Evaluating the prevalence of the C677T polymorphism of MTHFR gene in the volunteer group and the male with abnormal semen analysis. Materials and Method: DNA samples was extracted from peripheral blood of 60 volunteers and 30 patients with abnormal semen analysis. Designing primers by using FastPCR software, then improving PCR-RFLP technique. Confirming the results of polymorphism by DNA sequencing technique. Evaluating the prevalence of the 66 DOI: 10.34071/jmp.2012.1.9 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 7
C677T polymorphism of MTHFR gene. Results: We designed successfully primers to amplify fragment of MTHFR gene including C677T polymorphism and an obligatory restriction site of HinfI (as internal control). The MTHFR genotype frequencies in the volunteer group were: 71.67% (677CC); 25% (677CT); and 3.33% (677TT). Genotype frequencies in patients with abnormal semen analysis were 66.67%; 30% and 3.33% ; in group of azoospermia were 53.34%; 40% and 6.66%; in group of oligospermia were 80%; 20% and 0%. Conclusion: We standardized successfully PCR-RFLP technique to identifying C677T polymorphism of MTHFR gene.We evaluated the prevalence of the C677T polymorphism of MTHFR gene in the volunteer group and the male with abnormal semen analysis. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Đa hình C677T trên gene MTHFR làm Methylenetetrahydrofolate reductase thay đổi một acid amin ở vị trí 226 trong (MTHFR) là một enzyme quan trọng trong quá chuỗi polypeptide tương ứng, từ alanine trở trình chuyển hóa folate - thành phần thiết yếu cho thành valine. Sự thay đổi này làm enzyme nhiều chức năng của tế bào. Enzyme này chuyển methylenetetrahydrofolate reductase bị giảm 5,10-methylenetetrahydrofolate thành dạng có hoạt tính, khoảng 70-80% ở người đồng hoạt tính sinh học là 5-methyltetrahydrofolate. hợp tử 677TT và 30-35% ở người dị hợp tử Quá trình này chuyển homocysteine thành 677CT, dẫn đến rối loạn sự phân phối folate methionine, sau đó methionine được sử dụng trong tế bào [4]. Folate có chức năng chống để tổng hợp protein cũng như các hợp chất oxy hóa, do đó nồng độ folate thấp trong tinh quan trọng cho cơ thể [9]. dịch làm tăng nguy cơ hủy hoại DNA của tinh Năm 1995, Frosst lần đầu tiên đã phát trùng. Thêm vào đó, sự thiếu hụt folate làm hiện một biến dị di truyền với sự thay đổi tăng khả năng đứt gãy DNA bởi sự gắn nhầm nucleotide C (cytosine) thành T (thymine) tại của uracil thay vì thymine [8]. Đồng thời, sự vị trí 677 - gọi là đa hình C677T - trên gene rối loạn trong chuyển hóa folate sẽ làm giảm MTHFR của những bệnh nhân bị bệnh lý về chất cho gốc methyl để methyl hóa DNA mạch máu [5]. Về sau, người ta nhận thấy đa và protein, từ đó ảnh hưởng đến quá trình hình này còn được xem là một yếu tố nguy sinh tinh [4],[7]. cơ trong nhiều bệnh lý khác nhau như vô sinh Như vậy về mặt cơ chế, đa hình C677T nam, sẩy thai liên tiếp, ung thư đại tràng... của gene MTHFR được xem là một chỉ điểm [3],[6] . Để tạo điều kiện cho việc nghiên cứu về di truyền trong sàng lọc cho các bệnh nhân có vai trò của đa hình C677T trên gene MTHFR suy giảm sinh tinh trùng. Bezold (Đức, 2001) trong các bệnh lý liên quan, một nghiên cứu cơ là người đầu tiên nghiên cứu về đa hình bản nhằm thiết lập quy trình về kỹ thuật sinh C677T trên gene MTHFR ở người nam vô học phân tử giúp xác định đa hình này là hết sinh và nhận thấy có mối liên quan rõ rệt giữa sức cần thiết. Sự thay đổi từ C trở thành T tại tình trạng vô sinh nam với kiểu gene đồng nucleotide thứ 677 của gene MTHFR đã tạo hợp tử 677TT. Tuy nhiên, cho đến nay các ra một vị trí cắt mới (GAGTC) cho enzyme kết quả nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế HinfI. Vì vậy việc sử dụng kỹ thuật PCR để giới vẫn chưa thống nhất. Các nghiên cứu ở khuếch đại đoạn gene MTHFR chứa vị trí 677 châu Phi, Ấn Độ và Đông Nam Á cho thấy đa rồi sau đó cắt sản phẩm PCR bằng enzyme hình C677T của gene MTHFR là có liên quan HinfI (kỹ thuật PCR-RFLP) là quy trình sinh đến sự bất thường về sinh tinh trùng, trong học phân tử được lựa chọn hàng đầu trong việc khi đó phần lớn các nghiên cứu ở châu Âu xác định đa hình C677T. như Ý, Hà Lan... thì không tìm thấy sự liên Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 7 67
quan[7]. Mặc dù vậy, khi thực hiện một nghiên 2.2.2. Thực hiện kỹ thuật PCR nhằm cứu phân tích tổng hợp (meta-analysis) tác khuếch đại đoạn gene MTHFR có chứa giả Tuttelmann nhận thấy có mối liên quan nucleotide 677 giữa đa hình nói trên với vô sinh nam do bất - Thiết kế mồi bằng phần mềm FastPCR 5.3 thường tinh dịch đồ [9]. + Tìm trình tự gene MTHFR (GB: Tại Việt Nam chưa có công trình nào AY338232.1) trên GenBank. Sử dụng đoạn nghiên cứu về đa hình C677T của gene gene dài 1020bp chứa vị trí đa hình C677T (từ MTHFR trên nhóm người bình thường cũng nucleotide 8221 đến 9240) để thiết kế mồi. như bệnh lý. Do đó, việc thực hiện đề tài + Nhập vào phần mềm FastPCR trình “Nghiên cứu xác định đa hình C677T của tự gene đã chọn và câu lệnh: –lpdl–350 – gene MTHFR bằng kỹ thuật PCR-RFLP ở rpd550–1020. Nhập các thông số cơ bản để thiết bệnh nhân có tinh dịch đồ bất thường” là kế mồi. Sau khi chạy chương trình FastPCR, rất cần thiết, đặc biệt là đối với các phòng phần mềm hiển thị một số trình tự cặp mồi tối thí nghiệm Di truyền phân tử tại các cơ sở ưu, từ đó chọn một cặp mồi là: mồi xuôi: 5’ nghiên cứu và đào tạo như Trường Đại học Y TCATGAGCCCAGCCACTCAC 3’ và mồi Dược Huế. ngược: 5’ CAGCGAACTCAGCACTCCAC 3’. Đề tài nghiên cứu này được thực hiện nhằm + Trình tự này được gửi đến công ty IDT các mục tiêu sau: để đặt hàng tổng hợp mồi. 1. Hoàn thiện kỹ thuật PCR – RFLP với cặp - Thành phần tham gia PCR: 12,5µl GoTaq mồi tự thiết kế để xác định đa hình C677T trên Green Master Mix 2× (Promega); 1 µl mồi gene MTHFR. xuôi (10 pmol/ µl); 1 µl mồi ngược (10 pmol/ 2. Xác định tỷ lệ các đa hình C677T của µl); 1 µl DNA khuôn mẫu; 9,5 µl nước cất. gene MTHFR trên nhóm người tình nguyện và - Điều kiện luân nhiệt: Biến tính ban đầu nhóm bệnh nhân có bất thường tinh dịch đồ. 95 C trong 5 phút. 35 chu kỳ (biến tính 95oC, 1 o phút 30 giây; gắn mồi 60oC, 1 phút; kéo dài mồi 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 72oC, 1 phút). Cuối cùng là 72oC trong 8 phút. NGHIÊN CỨU - Phản ứng được thực hiện trong máy 2.1. Đối tượng nghiên cứu luân nhiệt Applied Biosystems 2720 tại bộ - Nhóm người tình nguyện: 60 người, gồm môn Di truyền Y học, trường Đại học Y có 30 nam và 30 nữ, là những người đến kiểm Dược Huế. tra sức khỏe tổng quát tại Bệnh viện Trường - Sản phẩm PCR được điện di trên gel Đại học Y Dược Huế và không có bệnh lý, đã agarose 0,8%, ở điện thế 80V. Đọc kết quả có con cái. Mỗi người được lấy 1 ml máu tĩnh dưới đèn cực tím sau khi nhuộm ethidium mạch có chống đông bằng EDTA để chiết bromide. Kích thước sản phẩm dự kiến là tách DNA. 465 bp. - Nhóm bệnh nhân có bất thường tinh dịch 2.2.3. Thực hiện phản ứng cắt sản phẩm đồ: 30 người chồng có tinh dịch đồ bất thường PCR bằng enzyme HinfI của các cặp vợ chồng vô sinh được chẩn đoán Phản ứng gồm 11,5 µl sản phẩm PCR; 2µl theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới. enzyme HinfI; 1,5 µl đệm. Ủ qua đêm, nhiệt 2.2. Phương pháp nghiên cứu độ 37oC trong bể ổn nhiệt. Kiểm tra sản phẩm 2.2.1. Tách chiết DNA: Từ 300 µl máu tĩnh cắt bằng điện di trên gel agarose 1,5%, điện mạch theo protocol chuẩn của kit mDX InstaGene thế 80V. Đọc kết quả dưới đèn cực tím sau khi Genomic DNA (Cat. No. 7326028, Bio-Rad). nhuộm ethidium bromide. 68 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 7
2.2.4. Cách đánh giá kết quả kiểu gene Bảng 2.1. Xác định kiểu gene dựa vào kích thước sản phẩm cắt Kích thước các đoạn DNA sau khi cắt sản phẩm Kiểu gene Kích thước sản phẩm PCR PCR bằng enzyme HinfI 677CC 465 83; 382bp 677TT 465 83; 165; 217bp 677CT 465 83; 165; 217; 382bp 2.2.5. Kiểm chứng quy trình PCR - RFLP Lấy 4 sản phẩm PCR (2 mẫu 677CC, 1 mẫu 677CT và 1 mẫu 677TT) gửi đi xác định trình tự DNA. Đối chiếu trình tự sản phẩm PCR với trình tự của gene MTHFR bằng chương trình BLAST để kiểm chứng tính đặc hiệu của cặp mồi sử dụng. Đối chiếu với kết quả đa hình xác định được nhờ phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng enzyme HinfI. 3. KẾT QUẢ 3.1. Kết quả hoàn thiện kỹ thuật PCR-RFLP 3.1.1. Kết quả thực hiện kỹ thuật PCR với cặp mồi tự thiết kế M 4 3 2 1 Cột 1 – 4: sản phẩm PCR; Cột M: thang chuẩn 100 bp pb 005 Nhận xét: Sản phẩm PCR cho băng rõ nét, kích thước phù hợp với kích thước dự kiến (465 bp). pb 001 Hình 3.1. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR 3.1.2. Kết quả thực hiện phản ứng cắt sản phẩm PCR bằng HinfI 217 Cột 1, 5, 6, 7, 8 có 4 băng kích thước 83, 165, 217, 382 bp: M 8 7 6 5 4 3 2 1 kiểu gene CT. pb 283 Cột 2, 4 có 2 băng kích thước 83, 382 bp: kiểu gene CC pb 712 Cột 3 có 3 băng kích thước 83, 165, 217 bp: kiểu gene TT. pb 561 Cột M: thang chuẩn 100 bp. pb 38 Nhận xét: sản phẩm PCR sau cắt bằng enzyme HinfI cho băng rõ nét, đúng kích thước. Hình 3.2. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau cắt bằng enzyme HinfI 3.1.3. Kết quả kiểm chứng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc xác định các đa hình C677T Kết quả xác định trình tự cho thấy việc xác định các đa hình C677T bằng phương pháp PCR- RFLP ở 4 mẫu kiểm chứng là chính xác. Hình 3.3. Trích trình tự mẫu đồng hợp tử 677CC, dị hợp tử 677CT, đồng hợp tử 677TT Nhận xét: Mẫu đồng hợp tử 677CC chỉ cho 1 đỉnh nucleotide C (màu xanh) tại vị trí tương ứng (có mũi tên), mẫu đồng hợp tử 677TT chỉ cho 1 đỉnh nucleotide T (màu đỏ), trong khi mẫu dị hợp tử 677CT cho 2 đỉnh là nucleotide C và T (1 đỉnh màu xanh và 1 đỉnh màu đỏ có chiều cao bằng nhau) tại cùng một vị trí tương ứng. Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 7 69
3.2. Tỷ lệ các đa hình Bảng 3.1. Sự phân bố các đa hình ở nhóm người tình nguyện và kết quả phân tích cân bằng Hardy-Weinberg Tần số quan sát Tần số kỳ vọng theo Allele C Allele T (Tỷ lệ Kiểu gene p (Tỷ lệ %) H-W (Tỷ lệ %) (Tỷ lệ %) %) 677CC 43 (71,67) 42,5 (70,84) 86 0 677CT 15 (25,00) 15,99 (26,65) 15 15 677TT 2 (3,33) 1,5 (2,51) 0 4 0,631 101 (84,17) 19 (15,83) Tổng 60 (100,00) 60 (100,00) 120 (100,00) Nhận xét: Tỷ lệ kiểu gene đồng hợp tử 677TT chỉ chiếm tỷ lệ rất thấp (3,33%), trong khi đó tỷ lệ kiểu gene đồng hợp tử 677CC chiếm đến 71,67%. Sự phân bố các kiểu gene CC, TT và CT trong nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với cân bằng Hardy-Weinberg (p > 0,05). Allele T chỉ chiếm tỷ lệ 15,83%. Bảng 3.2. Sự phân bố các đa hình ở nhóm người nam tình nguyện và nhóm bất thường tinh dịch đồ Nam tình nguyện Bất thường tinh dịch đồ Kiểu gene p Số người Tỷ lệ % Số người Tỷ lệ % 677CC 22 73,34 20 66,67 677CT 7 23,33 9 30 > 0,05 677TT 1 3,33 1 3,33 Tổng 30 100 30 Nhận xét: Không thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về tỷ lệ các đa hình C677T giữa hai nhóm nam tình nguyện và nhóm bất thường tinh dịch đồ. Bảng 3.3. Sự phân bố các đa hình theo mức độ bất thường tinh dịch đồ Vô tinh Thiểu năng tinh trùng Kiểu gene p Số người Tỷ lệ % Số người Tỷ lệ % 677CC 8 53,34 12 80 677CT 6 40 3 20 > 0,05 677TT 1 6,66 0 0 Tổng 15 100 15 100 Nhận xét: Trong số 15 người vô tinh có đến 7 người có mang allele T (gồm 6 người dị hợp tử 677CT và 1 người đồng hợp tử 677TT), trong khi đó ở 15 người thiểu năng tinh trùng chỉ có 3 người mang allele T (cả 3 đều là dị hợp tử 677CT, không có trường hợp nào đồng hợp tử 677TT). Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. 4. BÀN LUẬN gene dài 1020 bp chứa vị trí đa hình C677T 4.1. Hoàn thiện kỹ thuật PCR – RFLP (từ nucleotide 8221 đến nucleotide 9240) để với cặp mồi tự thiết kế để khuếch đại đoạn thiết kế mồi. Trong trình tự này, vị trí 677 gene MTHFR chứa nucleotide thứ 677 (số thứ tự này chỉ tính cho phần mang mã di 4.1.1. Thiết kế mồi truyền – các exon) tương ứng với vị trí thứ Từ trình tự gene MTHFR lấy từ GenBank 8747 trên toàn bộ gene, nghĩa là trình tự nhận (GB: AY338232.1), chúng tôi sử dụng đoạn biết của enzyme HinfI ở đa hình C677T gồm 5 70 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 7
nucleotide GAGTC (từ vị trí 8744 đến 8748). một vị trí cắt của enzyme HinfI là GACTC (từ Trong đoạn gene dài 1020 bp được chọn để nucleotide 8579 đến 8583), gọi đó là vị trí cắt thiết kế mồi này còn có 2 vị trí nhận biết khác bắt buộc. Vị trí này sẽ chia sản phẩm PCR ra của enzyme HinfI là GACTC (từ vị trí 8579 thành hai đoạn có kích thước 83bp và 382 bp. đến 8583) và GATTC (từ vị trí 9112 đến 9116). - Nếu sản phẩm PCR được khuếch đại từ Trong nghiên cứu này, chúng tôi nhận thấy allele 677T thì có thêm vị trí cắt thứ 2 (GAGTC), vị trí cắt GACTC (từ 8579 đến 8583) khá vị trí cắt này sẽ chia đoạn 382 bp thành hai đoạn gần vị trí đa hình C677T (từ 8744 đến 8748) có kích thước là 165 bp và 217 bp. nên đã tận dụng đặc điểm này để thiết kế mồi Nếu sản phẩm PCR được khuếch đại từ tạo sản phẩm PCR có chứa cả hai vị trí cắt. allele 677C thì không có vị trí cắt thứ 2 này. Trong đó, vị trí cắt GACTC tồn tại ở tất cả mọi Do đó, kết quả phản ứng cắt sản phẩm người, nghĩa là sản phẩm PCR sẽ luôn bị cắt PCR bằng enzyme HinfI sẽ khác nhau rõ rệt ở đây. Điều này giúp chúng tôi có được một giữa các kiểu gene 677CC, 677TT và 677CT chứng nội tại (internal control) cho phản ứng như trình bày ở bảng 2.1. Số loại sản phẩm cắt về sau. cắt thu được nhiều nhất là ở kiểu gene dị hợp Để sản phẩm PCR chứa cả 2 vị trí nhận tử 677CT, gồm 4 đoạn với kích thước 83bp, biết của enzyme HinfI nói trên chúng tôi chọn 165bp, 217bp, 382bp. phương án thiết kế mồi xuôi nằm trong đoạn Việc tồn tại một vị trí cắt bắt buộc của từ nucleotide thứ 1 đến 350 và mồi ngược nằm enzyme HinfI trên sản phẩm PCR có vai trò trong đoạn từ 550 đến 1020 (tính trong đoạn như là chứng nội tại, giúp chúng tôi kiểm gene dài 1020 đưa vào thiết kế mồi). Vì vậy, chứng sự hoạt động của enzyme. Khi không câu lệnh cần dùng là “–lpdl–350 –rpd550– có sản phẩm 83 bp xuất hiện sẽ chứng tỏ 1020”. Các thông số sử dụng trong khung enzyme HinfI không hoạt động. Rõ ràng việc “PCR Primer or Probe Design Options” của thiết kế được cặp mồi khuếch đại đoạn DNA chương trình FastPCR được tham khảo từ các có chứa một điểm cắt bắt buộc ngoài vị trí đa tiêu chuẩn cơ bản về mồi PCR. hình C677T đã chứng tỏ sự ưu việt của cặp Sau khi chạy phần mềm FastPCR, chúng mồi này so với các cặp mồi không chứa điểm tôi thu được một số trình tự cặp mồi gợi ý, cắt bắt buộc, giúp loại trừ khả năng xác định trong đó chúng tôi chỉ chọn cặp mồi có chất sai kiểu đa hình (xác định nhầm là đồng hợp lượng trên 90% (primer quality). Đồng thời tử 677CC trong trường hợp enzyme không sản phẩm PCR tương ứng phải đáp ứng điều hoạt động). kiện là khi cắt bởi enzyme HinfI sẽ cho ra các 4.1.2. Hoàn thiện kỹ thuật PCR-RFLP đoạn DNA có kích thước chênh lệch đủ lớn Dựa vào thông số cung cấp từ trình tự mồi (tối thiểu là 50 bp) để có thể dễ dàng phân được tổng hợp, chúng tôi chọn nhiệt độ gắn tách khi điện di trên gel agarose. Chúng tôi mồi cho phản ứng PCR là 60oC. Hình 3.1 cho đã chọn được cặp mồi với trình tự nêu trong thấy các sản phẩm PCR thu được có băng phần phương pháp nghiên cứu. Cặp mồi này tương ứng rõ nét, kích thước phù hợp với 465 đã khuếch đại được đoạn DNA từ vị trí 8497 bp, không có các băng không đặc hiệu, không đến vị trí 8962 trên trình tự gen MTHFR với có hiện tượng primer dimer. Đồng thời, kết kích thước sản phẩm thu được là 465 bp. quả kiểm chứng bằng cách xác định trình tự Enzyme HinfI nhận biết và cắt đặc hiệu tại nucleotide sản phẩm PCR của 4 mẫu đã chọn các vị trí có trình tự 5’-GANTC-3’ của đoạn cũng cho thấy các sản phẩm này đúng là đoạn DNA. Sản phẩm PCR được khuếch đại từ cặp DNA cần khuếch đại trên gene MTHFR. Như mồi do chúng tôi thiết kế sẽ luôn luôn có chứa vậy, quy trình PCR nhằm khuếch đại đoạn Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 7 71
gene MTHFR mong muốn đã đạt tiêu chuẩn, các quốc gia khác nhau, trong đó allele 677T sản phẩm PCR thu được có thể sử dụng cho cao nhất là 58,60% (tại Mexico), thấp nhất là các phân tích phân tử tiếp theo. 4,5% (tại Sri Lanka). Ngoài ra tỷ lệ này cũng Kết quả ở hình 3.2 cho thấy ở các cột 1, 5, khá cao ở một số nước như Ý (44%), Hàn 6, 7 và 8 đều cho hình ảnh 4 băng tương ứng Quốc (40,3%), Nhật Bản (36,9%); ngược kích thước 83 bp, 165 bp, 217 bp và 382 bp, lại rất thấp ở các nước như Kenya (4,9%) tương ứng kiểu gene dị hợp tử 677CT. Cột 2 và Indonesia (8,1%). Một số nước có tỷ lệ và 4 đều có 2 băng kích thước 83 bp và 382 bp, này tương đương với nghiên cứu của chúng tương ứng kiểu gene đồng hợp tử 677CC. Cột tôi như quần thể người Mỹ gốc Phi (14%, 3 có 3 băng kích thước 83 bp, 165 bp và 217 n=496; p=0,6862) và Yemen (17,4%, n=46; bp, tương ứng kiểu gene đồng hợp tử 677TT. p=0,9056), Anh (18,6%, n=94; p=0,6384). Kết quả xác định trình tự của các mẫu 4.2.2. Trên nhóm bất thường tinh dịch đồ 677CC, 677CT và 677TT đều phù hợp với kết Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy tỷ lệ kiểu gen quả thực hiện kỹ thuật PCR-RFLP (hình 3.3). 677CC, 677CT và 677TT ở nhóm bất thường 4.2. Xác định tỷ lệ đa hình C677T của tinh dịch đồ lần lượt là 66,67%; 30% và 3,33%. gene MTHFR Sự phân bố này không khác biệt so với nhóm 4.2.1. Trên nhóm người tình nguyện nam tình nguyện (các tỷ lệ lần lượt là 73,34%; Kết quả nghiên cứu của chúng tôi ở bảng 3.1 23,33% và 3,33%). Khi phân tích theo nhóm cho thấy tỷ lệ người đồng hợp tử CC tại vị trí mức độ bất thường tinh dịch đồ, chúng tôi 677 trên gene MTHFR chiếm đa số 71,67%; tỷ nhận thấy trong 15 người thuộc nhóm vô tinh lệ người dị hợp tử 677CT chiếm 25%; và tỷ lệ có đến 7 người mang allele T (6 người dị hợp người đồng hợp tử 677TT rất thấp, chỉ chiếm tử 677CT và 1 người đồng hợp tử 677TT, lần 3,33%. Sử dụng phép phân tích cân bằng lượt chiếm tỷ lệ là 40% và 6,66%), trong khi Hardy – Weinberg cho thấy sự phân bố của các đó ở nhóm 15 người thiểu năng tinh trùng chỉ kiểu đa hình là cân bằng (p=0,631>0,05). Sự có 3 người mang allele T (đều là dị hợp tử, phân bố của các alen 677C và 677T lần lượt là chiếm tỷ lệ 20%). Tuy nhiên, có lẽ do cỡ mẫu 84,17% và 15,83%. của chúng tôi còn nhỏ nên sự khác biệt chưa Nghiên cứu của Unfried (2002) cho thấy có ý nghĩa thống kê. Trong tương lai chúng tôi trong nhóm gồm 74 phụ nữ bình thường có sẽ tiếp tục thu thập dữ liệu với cỡ mẫu lớn hơn sự phân bố của các kiểu gene CC, CT và TT để có những nhận định đúng đắn về mối liên lần lượt là 62,2%; 32,4% và 5,4%. Tỷ lệ alen quan giữa đa hình C677T với vô sinh nam. 677T của gene MTHFR là 21,6% [10]; tỷ lệ Tóm lại, với đề tài nghiên cứu này, chúng này không có sự khác biệt so với kết quả tôi đã thành công trong việc hoàn thiện một nghiên cứu của chúng tôi (p=0,2981>0,05). quy trình PCR – RFLP nhằm xác định đa hình Kết quả nghiên cứu của Bagheri (2010) về C677T trên gene MTHFR, đồng thời bước đầu tỷ lệ đa hình C677T trên tổng số 216 người đã xác định được sự phân bố đa hình này trong bình thường cho thấy sự phân bố của các một nhóm người bình thường và nhóm bệnh kiểu gene CC, CT và TT lần lượt là 54,6%; nhân bất thường tinh dịch đồ. Chúng tôi hy 38% và 7,41%, trong đó tỷ lệ allele 677T vọng những kết quả này sẽ là cơ sở dữ liệu là 26% [1]. Như vậy tỷ lệ allele 677T trong đóng góp một phần trong việc nghiên cứu sâu nghiên cứu của chúng tôi thấp hơn so với hơn về các yếu tố nguy cơ trong các tình trạng nghiên cứu này (p=0,0283< 0,05). Bagheri bệnh lý có liên quan đến đa hình của gene đã trích dẫn tỷ lệ các allele 677T và 677C ở MTHFR. 72 Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 7
5. KẾT LUẬN trí 677 của gene MTHFR trên 60 người tình Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra nguyện: kiểu gene đồng hợp tử 677CC chiếm các kết luận sau: đa số 71,67%; dị hợp tử 677CT chiếm 25%; 5.1. Đã thành công trong việc hoàn thiện kỹ đồng hợp tử 677TT chiếm 3,33%. thuật PCR-RFLP với cặp mồi tự thiết kế. Đặc Tỷ lệ các đa hình trong nhóm bệnh nhân có biệt cặp mồi này khuếch đại được sản phẩm tinh dịch đồ bất thường là 677CC chiếm 66,67%; PCR có chứa một vị trí cắt bắt buộc của enzyme 677CT chiếm 30% và 677TT chiếm 3,33%. Các HinfI như là một chứng nội tại cho phản ứng tỷ lệ này trong nhóm vô tinh lần lượt là 53,34% ; cắt tiếp theo trong kỹ thuật PCR-RFLP. 40% và 6,66%. Trong nhóm thiểu năng tinh 5.2. Xác định được tỷ lệ các đa hình tại vị trùng lần lượt là 80% ; 20% và 0%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bagheri M., Rad I.A. (2010), “Frequency 6. Genest J.J.Jr, McNamara J.R, Salem D.N., of the Methylenetetrahydrofolate reductase Wilson P.W, Schaefer E.J., Malinow M.R. 677CT and 1298AC mutations in an Iranian (1990), “Plasma homocyst(e)ine levels in men Turkish female population”, Maedica-a with premature coronary artery disease”, J Am journal of clinical medicine, 5(3): 171-177. Coll Cardiol, 16:1114-1119. 2. Bezold G., Lange M., Peter R. U. (2001), 7. Nuti F., Krausz C. (2008), “Gene “Homozygous methylenetetrahydrofolate polymorphisms/mutations relevant to reductase C677T mutation and male abnormal spermatogenesis”, Reproductive infertility”, N EngI J Med, 344: 1172-1173. BioMedicine, 14(6): 504-513. 3. Clarke R., Daly L., Robinson K., Naughten 8. Safarinejad M. R., Shafiei N., Safarinejad E., Cahalane S., Fowler B., Graham I. (1991), S. (2011), “Relationship between genetic “Hyperhomocysteinemia: An Independent polymorphisms of methylenetetra hydrofolate Risk Factor for Vascular Disease”, N Engl J reductase (C677T, A1298C and G1793A) as Med , 324:1149-1155. risk factors for idiopathic male infertility”, 4. Ferlin A., Raicu F., Gatta V, Zuccarello D, Reproductive Sciences, 18(3): 304-315. Palka G, Foresta C (2007), “Male infertility: 9. Tuttelmann F., Meyts E. R., Nieschlag E., role of genetic background”, Reproductive Simoni M. (2007), “Gene polymorphisms and BioMedicine, 14(6): 734-745. male infertility – a meta-analysis and literature 5. Frosst P., Blom H.J., Milos R., Goyette P., review”, Reproductive BioMedicine, 15(6): Sheppard C.A., Matthews R.G., Boers G.J.H., 643-658. Heijer M., Kluijtman L.A.J., van den Heuvel 10. Unfried G, Griesmacher A, Weismüller L.P., Rozen R. (1995), “A candidate genetic W, Nagele F, Huber JC, Tempfer CB risk factor for vascular disease: a common (2002). “The C677T polymorphism of the mutation in methylenetetrahydrofolate methylenetetrahydrofolate reductase gene reductase”, Nature Genetics, 10: 11-113. and idiopathic recurrent miscarriage”, Obstet Gynecol, 99(4): 614-619. Tạp chí Y Dược học - Trường Đại học Y Dược Huế - Số 7 73