Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định 3,5,6-trichloro-2-pyridinol trong nước tiểu bằng sắc kí khí khối phổ

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:7

Thêm vào BST

Báo xấu

6
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bài viết Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định 3,5,6-trichloro-2-pyridinol trong nước tiểu bằng sắc kí khí khối phổ được nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình xác định TCP trong nước tiểu bằng sắc kí khí khối phổ, phục vụ công tác giám định pháp y và hỗ trợ điều trị lâm sàng các trường hợp có liên quan đến ngộ độc CP.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định 3,5,6-trichloro-2-pyridinol trong nước tiểu bằng sắc kí khí khối phổ

NGHIÊN CỨU - TRAO ĐỔI NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH 3,5,6-TRICHLORO-2-PYRIDINOL TRONG NƯỚC TIỂU BẰNG SẮC KÍ KHÍ KHỐI PHỔ ThS. NGUYỄN MAI DUNG, ThS. CHU THỊ NHƯ QUỲNH TS. LÊ ANH HÀO - Viện Pháp y Quốc gia TÓM TẮT: Nghiên cứu xây dựng quy trình xác định 3,5,6-trichloro-2-pyridinol trong nước tiểu bằng sắc kí khí khối phổ tại Viện Pháp y Quốc gia, làm cơ sở chẩn đoán ngộ độc chlorpyrifos. Kết quả: Xây dựng thành công quy trình xác định 3,5,6-trichloro-2-pyridinol trong nước tiểu bằng phương pháp có độ đúng, độ chính xác với tỉ lệ thu hồi từ 84,29-91,8%; có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ 3,5,6-trichloro-2-pyridinol với tỉ lệ diện tích pic 3,5,6-trichloro-2-pyridinol/chuẩn nội trong khoảng nồng độ từ 10-500 ng/ml, hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1 và phương trình hồi quy tuyến tính y = 0,0041x + 0,0134; giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của 3,5,6-trichloro-2-pyridinol trong nước tiểu lần lượt là 0,5 ng/ml và 1,5 ng/ml; hiệu suất chiết 3,5,6-trichloro-2-pyridinol từ mẫu nước tiểu đạt từ 84,29- 91,87% (RSD < 5%). Kết quả phân tích 7 mẫu nước tiểu nghi ngờ ngộ độc chlorpyrifos cho kết quả 5 mẫu dương tính 3,5,6-trichloro-2-pyridinol và 2 mẫu âm tính. Từ khóa: 3,5,6-trichloro-2-pyridinol, chlorpyrifos, sắc kí khí khối phổ, Urine. ABSTRACT: Study and develop a process to determine 3,5,6-trichloro-2-pyridinol in urine by gas chromatography-mass spectrometry at the National Institute of Forensic medicine, as a basis for the diagnosis of chlorpyrifos poisoning. Results: Successfully developed a process to determine 3,5,6-trichloro-2-pyridinol in urine by the method with accuracy and precision with the recovery rate from 84.29-91.8%; there was a close linear correlation between the concentration of 3,5,6-trichloro-2-pyridinol and the peak area ratio of 3,5,6-trichloro- 2-pyridinol/internal standard in the concentration range from 10-500 ng/ml, the correlation coefficient was approximately equal to one and the linear regression equation y = 0.0041x + 0.0134; the detection limit and the quantitative limit of 3,5,6-trichloro-2-pyridinol in urine were 0.5 ng/ml and 1.5 ng/ml, respectively; extraction efficiency of 3,5,6-trichloro-2-pyridinol from urine samples was from 84.29-91.87% (RSD < 5%). The results of an analysis of seven urine samples suspected of chlorpyrifos poisoning showed five positive 3,5,6-trichloro-2-pyridinol samples and two negative samples. Keywords: 3,5,6-trichloro-2-pyridinol, chlorpyrifos, gas chromatography-mass spectrometry, Urine Chịu trách nhiệm nội dung: ThS. Nguyễn Mai Dung, Email: maidungibst@gmail.com Ngày nhận bài: 17/8/2022; mời phản biện khoa học: 9/2022; chấp nhận đăng: 15/10/2022. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ. cao, được sử dụng phổ biến trong giám định pháp Chlorpyrifos (CP) là một loại thuốc bảo vệ thực y nhằm khẳng định sự có mặt của TCP trong mẫu vật nhóm lân hữu cơ, được sử dụng cả trong nông nước tiểu cần phân tích [4], [5]. nghiệp và công nghiệp [2]. Khi vào trong cơ thể, CP Chúng tôi thực hiện nghiên cứu này nhằm xây được chuyển hóa thành các chất khác nhau và thải dựng quy trình xác định TCP trong nước tiểu bằng trừ chủ yếu qua nước tiểu dưới dạng chuyển hóa sắc kí khí khối phổ, phục vụ công tác giám định với chất chuyển hóa chính là TCP (3,5,6-trichloro- pháp y và hỗ trợ điều trị lâm sàng các trường hợp 2-pyridinol). Do độc tính cao đối với sức khỏe con có liên quan đến ngộ độc CP. người, nên CP đã bị loại khỏi danh mục thuốc bảo 2. ĐỐI TƯỢNG, CHẤT LIỆU VÀ PHƯƠNG vệ thực vật được phép sử dụng tại Việt Nam từ PHÁP NGHIÊN CỨU. năm 2019 [1]. Mặc dù vậy, Viện Pháp y Quốc gia vẫn nhận được nhiều vụ trưng cầu và yêu cầu giám 2.1. Đối tượng, chất liệu nghiên cứu: định có liên quan đến ngộ độc CP trong thời gian - Đối tượng nghiên cứu: mẫu chuẩn (mẫu nước gần đây. tiểu không chứa TCP, được thêm chuẩn tạo các Khẳng định sự có mặt của TCP trong nước tiểu mẫu nước tiểu có nồng độ TCP từ 0,5-500 ng/ml là một tiêu chí quan trọng khi xác định ngộ độc và chuẩn nội propofol 100 ng/ml) và 7 mẫu nước CP. Sắc kí khí khối phổ với sự ion hóa điện tử là tiểu của người nghi ngờ ngộ độc CP, giám định tại phương pháp phân tích hiện đại, có tính đặc hiệu Khoa Độc chất, Viện Pháp y Quốc gia. Tạp chí Y HỌC QUÂN SỰ, SỐ 360 (9-10/2022) 47
chuẩn nội propofol 1 ml (Lot BCCC 9065, hãng + Mẫu chuẩn: mẫu nước tiểu trắng (không Sigma Aldrich). chứa TCP) được thêm chuẩn, tạo các mẫu có + Hóa chất dung môi: methanol (HPLC), acid nồng độ TCP từ 0,5-500 ng/ml và chuẩn nội NGHIÊN CỨU - TRAO ĐỔI hydrochloric, diethylether, acetonitril, ethyl acetat, propofol 100 ng/ml. n-hexan, dichlormethan, natri hydroxyd, nước +- Chuẩn bị mẫudụng mẫu nước tiểu nghi ngờ Mẫu thử: sử nghiên cứu: - Chất liệu nghiên cứu: cất... ngộ +độc CP,dịch chuẩn gốc: pha dung dịch chuẩn + Hóa chất và thuốc thử: chất chuẩn TCP 100 Dung thêm dung dịch chuẩn nội propofol mg + 3,5,6-trichloro-2-pyridinol (TCP). (Lot BNBZ8746, hãng Sigma Aldrich); chất 100 ng/ml. TCP 1 µg/ml trong methanol và dung dịch chuẩn chuẩn nội propofol 1 ml (Lot BCCC 9065, hãng nội propofol nồng độ 1 µg/ml trong methanol. - Thiết bị nghiên cứu: máy sắc kí khí Agilent Sigma Aldrich). - Xử lí mẫu: hút chính xác 1,00 ml nước tiểu + Mẫu chuẩn: mẫu nước tiểu trắng (không chứa 7890B kếtchất khối phổ MS 5977A; cân phân acid + Hóa nối dung môi: methanol (HPLC), tích vào ống nghiệm, thêmtạo các mẫu có nồng độ TCP TCP) được thêm chuẩn, 50 µl dung dịch acid hydrochloric, diethylether, acetonitril, ethyl rắn C8 Mettler AB240 (Thụy Sĩ); cột chiết pha acetat, chlohydric đặc, thủychuẩn nộinhiệt độ 100 ng/ml. từ 0,5-500 ng/ml và phân ở propofol 80ºC trong n-hexan, dichlormethan, natri hydroxyd, Bond elute (500 mg, 3 ml), C18 (200 mg, 3 ml), nước cất... 30 phút, đểthử: sử mẫu ởmẫu nướcphòng. Thêm + Mẫu nguội dụng nhiệt độ tiểu nghi ngờ certify (200 mg, 3 ml); hệ thống chiết pha rắn; + 3,5,6-trichloro-2-pyridinol (TCP). 3,00 ml EtOAc thêm lần), lắc bằng máy nội 5 phút ngộ độc CP, (x 2 dung dịch chuẩn lắc propofol máyThiết bị nghiên cứu: máy sắc kí khí Agilent - lắc siêu âm, máy li tâm, tủ sấy, hệ thống làm ở 2.000 vòng/phút. Dịch chiết trong dung môi hữu 100 ng/ml. 7890B kết nối khối phổ MS 5977A; cân phân tích khô bằng nitơ; bình nón, ống nghiệm định mức Mettler AB240 (Thụy Sĩ); cột chiết pha rắn C8 (500 cơ được lí mẫu: hút chính xác 1,00 cắn. Cắntiểu vào - Xử làm khô bằng khí nitơ tới ml nước được mg, 3 ml), C18 dụng mg, 3 ml), Bond elute certify các loại và các (200 cụ cần thiết khác. hòa tan trong 100 µl50 µl dungtiến hành sắc kí. ống nghiệm, thêm MeOH rồi dịch acid chlohydric đặc, thủy phân ở nhiệt độ 80ºC trong 30 phút, để (200 mg, 3 ml); hệ thống chiết pha rắn; máy lắc 2.2. Phương pháp nghiên cứu: 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. nguội mẫu ở nhiệt độ phòng. Thêm 3,00 ml EtOAc siêu âm, máy li tâm, tủ sấy, hệ thống làm khô bằng (x 2 lần), lắc bằng máy lắc 5 phút ở 2.000 vòng/ nitơ; Thiết nón, ống nghiệm định mức các loại và - bình kế nghiên cứu: thực nghiệm, xây dựng 3.1. Khảo sát phổ khối của TCP và chuẩn phút. Dịch chiết trong dung môi hữu cơ được làm các dụng cụ cần thiết khác. quy trình xác định TCP. nội: bằng khí nitơ tới cắn. Cắn được hòa tan trong khô 2.2. Phương pháp nghiên cứu: - Điều kiện sắc kí khí khối phổ: 100 µl MeOH rồi tiến hành sắc kí.tích trên sắc kí TCP và chuẩn nội được phân - Thiết kế nghiên cứu: thực nghiệm, xây dựng quy + Cộtxác địnhHP5-MS (30m x 250 μm x 0,25 trình sắc kí TCP. khí 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU. được lựa chọn, khối phổ theo chương trình μm)Điều Agilent. kí khí khối phổ: - của kiện sắc chế 3.1. scan. Phổphổ khối của TCP chuẩn nội nội: độ Khảo sát khối của TCP và và chuẩn rõ + Cột sắc kí HP5-MS (30m x 250 μm x 0,25 μm) ràng và và chuẩn nội được phân tích trên TCPriêng biệt (hình 1A đến hình 1D). sắc kí khí + Thể tích tiêm mẫu 1 µl với bộ tiêm mẫu tự của Agilent. khối phổ theo chương trình được lựa chọn, chế độ động. tích tiêm mẫu 1 µl với bộ tiêm mẫu tự động. scan. Phổ khối của TCP vàvà mức nội rõ ràng và Dựa vào tính đặc trưng chuẩn độ tín hiệu, + Thể chúng biệtlựa chọn mảnh m/z 1D). 169; 107 cho riêng tôi (hình 1A đến hình = 197; + Chế độ tiêm mẫu không chia dòng (splitless). + Chế độ tiêm mẫu không chia dòng (splitless). TCP và m/z = 163; 178; 117và mức độ tín hiệu, Dựa vào tính đặc trưng cho chuẩn nội để + Khí mang heli, tốc độ dòng 1 ml/phút. + Khí mang heli, tốc độ dòng 1 ml/phút. phân tích sắc kí theo chế m/zchọn lọc ion 107 cho chúng tôi lựa chọn mảnh độ = 197; 169; (SIM). + Nguồn ion hóa EI 70eV; nhiệt độ nguồn ion 250oC. Mảnh và m/z 197 và178; 117 cho chuẩn nội để phân TCP m/z = = 163; mảnh m/z = 163 sử dụng để + Nguồn ion hóa EI 70eV; nhiệt độ nguồn ion + Nhiệt độ lò cột: 80ºC giữ trong 3 phút, tăng 250oC. lên đến 200ºC và giữ trong 1 phút, tiếp phân sắc kí theo chế độ chọn lọc ion (SIM). Mảnh tích tích định lượng 40ºC/phút, m/z = 197 và mảnh m/z = 163 sử dụng để phân tục tăng 10ºC/phút đến 290ºC và giữ trong 6 phút. tích định lượng. + Nhiệt độ lò cột: 80ºC giữ trong 3 phút, tăng A bundanc e I o n 1 9 7 . 0 0 (1 9 6 . 7 0 t o 1 9 7 . 7 0 ): M 1 0 S C A N . D \ d a t a . m s 150000 100000 50000 0 5 .5 0 6 .0 0 6 .5 0 7 .0 0 7 .5 0 8 .0 0 8 .5 0 9 .0 0 9 .5 0 T im e - - > A bundanc e I o n 1 6 9 . 0 0 (1 6 8 . 7 0 t o 1 6 9 . 7 0 ): M 1 0 S C A N . D \ d a t a . m s 150000 100000 50000 0 5 .5 0 6 .0 0 6 .5 0 7 .0 0 7 .5 0 8 .0 0 8 .5 0 9 .0 0 9 .5 0 T im e - - > A bundanc e I o n 1 0 7 . 0 0 (1 0 6 . 7 0 t o 1 0 7 . 7 0 ): M 1 0 S C A N . D \ d a t a . m s 150000 100000 50000 0 . 5 .5 0 6 .0 0 6 .5 0 7 .0 0 7 .5 0 8 .0 0 8 .5 0 9 .0 0 9 .5 0 T im e - - > Hình 1A. Sắc đồ ion thành phần TCP. Hình 1A. Sắc đồ ion thành phần TCP. 48 Tạp chí Y HỌC QUÂN SỰ, SỐ 360 (9-10/2022)
NGHIÊN CỨU - TRAO ĐỔI Abundance Ion 163.00 (162.70 to 163.70): PROPOFOL2.D\ data.ms 600000 400000 Abundance 200000 Ion 163.00 (162.70 to 163.70): PROPO O F L2.D\ data.ms 0 600000 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 Time--> 400000 Abundance 200000 Ion 178.00 (177.70 to 178.70): PROPOFOL2.D\ data.ms 0 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 Time-->600000 Abundance 400000 Ion 178.00 (177.70 to 178.70): PROPO O F L2.D\ data.ms 200000 600000 0 400000 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 Time-->200000 Abundance 0 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 Time--> Ion 117.00 (116.70 to 117.70): PROPOFOL2.D\ data.ms Abundance 600000 Ion 117.00 (116.70 to 117.70): PROPO O F L2.D\ data.ms 400000 600000 200000 400000 200000 0 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 0 Time--> 4.50 5.00 5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 8.50 9.00 9.50 10.00 10.50 Time--> Hình 1B. Sắc đồ ion thành phần chuẩn nội. Hình 1B. Sắc đồ ion thành phần chuẩn nội. Hình 1B. Sắc đồ ion thành phần chuẩn nội. Abundance Abundance 60000 Scan 393 (7.007 min): M10 SCAN.D\ data.ms Scan 393 (7.007 min): M10 SCAN.D\ data.ms 60000 196.9 196.9 55000 168.9 55000 168.9 50000 50000 45000 106.9 45000 106.9 40000 40000 35000 30000 35000 134.0 25000 30000 20000 134.0 25000 72.0 15000 20000 47.0 10000 72.0 15000 5000 47.0 91.0 152.8 256.0 0 10000 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 m/ z--> 5000 Hình 1C. Phổ khối lượng của TCP. 91.0 Hình 1C. Phổ khối lượng của TCP. 152.8 256.0 0 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 Tạp chí Y HỌC QUÂN SỰ, SỐ 360 (9-10/2022) 49 m/ z--> Hình 1C. Phổ khối lượng của TCP.
Scan 296 (6.286 min): PRO O O P F L2.D\ data.ms 163.1 750000 700000 NGHIÊN 650000TRAO ĐỔI CỨU - 600000 A u d n b n a ce 550000 Sca 2 6 ( .2 6 m ) P O O O 2 n 9 6 8 in : R P F L .D d ta \ a .ms 500000 1 3 6 .1 7 0 0 5 0 0 450000 0 7 0 0 0 0 6 0 0 5 0 0 400000 6 0 0 0 0 0 350000 0 5 0 0 5 0 300000 0 5 0 0 0 0 4 0 0 5 0 0 250000 4 0 0 0 0 0 200000 0 3 0 0 5 0 150000 0 3 0 0 0 0 117.1 2 0 0 5 0 0 100000 91.1 2 0 0 0 0 0 50000 0 1 0 0 41.1 5 0 1 7 1 .1 65.0 1 0 0 0 0 0 9 .1 1 141.1 341.0 0 5 0 040 .1 0 0 41 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 6 .0 5 1 1 4 .1 3 1 4 .0 m z--> / 0 40 60 80 1 0 0 1 0 2 1 0 4 1 0 6 1 0 8 2 0 0 2 0 2 2 0 4 2 0 6 2 0 8 3 0 0 3 0 2 3 0 4 m z- / -> Hình 1D. Phổ khối lượng của chuẩn nội. Hình 1D. Phổ khối lượng của chuẩn nội. 3.2. Đánh giá phương pháp:Hình 1D. Phổ khối lượng của chuẩn nội. 3.2. Đánh giá phương pháp: - SựĐánhhợp của hệ thống sắc kí: tiến hành tiêm lặp lại 6 6 lần mẫu chuẩn TCP 100 ng/ml. Kết quả 3.2. phù giá phương pháp: - Sự phù hợp của hệ thống sắc kí: tiến hành tiêm lặp lại lần mẫu chuẩn TCP 100 ng/ml. Kết quả thời Sự phù hợp của hệ thống sắc kí:trung hành làlà 7,08. RSD của thời gian TCPvà diện tíchKếtlần lượt thời gian lưu của TCP từ 7,06-7,09,tiến bình tiêm lặp RSD lần mẫu chuẩn lưu 100 ng/ml.píc quả lượt - gian lưu của TCP từ 7,06-7,09, trung bình 7,08. lại 6 của thời gian lưu và diện tích píc lần thời gian0,15% và 1,49%. Thời giantrungvà diện tích pic giữa các lầngian tích khác biệt píc lần nhiều, đều có là lưu lưu phân tích khác tích không lượt làRSD < của 1,49%. Thời gian lưu ổn bình là 7,08. RSD của thờiphân lưu và chobiệt không nhiều, là 0,15% 0,15% 2%.TCP từ 7,06-7,09, kí và định, tích pic giữa các lầnđể phân tích diệnkết quả tin cậy. đều có và Vậy hệ thống sắc diện bảo đảm chính xác RSD-
NGHIÊN CỨU - TRAO ĐỔI Hình 2B. Sắc đồ mẫu chuẩn. Hình 2B. Sắc đồ mẫu chuẩn. Hình 2B. Sắc đồ mẫu chuẩn. Hình 2C. Sắc đồ mẫu nước tiểu trắng thêm chuẩn. Hình 2C. Sắc đồ mẫu nước tiểu trắng thêm chuẩn. Tạp chí Y HỌC QUÂN SỰ, SỐ 360 (9-10/2022) 51
NGHIÊN CỨU - TRAO ĐỔI Trên sắc kí đồ mẫu trắng, không thấy pic tín các yêu cầu về độ đúng, độ lặp lại của phương Trên sắc kíkíđồ mẫu trắng, không thấy pic tín pháp đáp ứng các yêu cầu về độ đúng, độ lặp lại Trên sắc đồ mẫu trắng, không thấy pic tín pháp đáp ứng các yêu cầu về độ đúng, độ lặp lại hiệu tại thời gian lưu của TCP và nội chuẩn. Trên hiệu tại thời gian lưu của TCP và nội chuẩn. Trên của phương pháp TCP trongTCP trong nước tiểu. pháp phân tích nước tiểu. hiệu tại thời gian lưu của TCP và nội chuẩn. Trên của phương phápphân tích TCP trong nước tiểu. phân tích sắckí đồ mẫu trắng thêm chuẩn, có pic xuất hiện kí đồ mẫu trắng thêm chuẩn, có pic xuất hiện sắc kí đồ mẫu trắng thêm chuẩn, có pic xuất hiện sắc Bảng 2. Kết quả khảo sátsát độ đúng. Bảng 2. Kết quả khảo Bảng 2. Kết quả khảo sátđộ đúng. độ đúng. tương ứng với thời gian lưu lưu của TCPnội chuẩn tương ứng với thời gian lưu của TCP và nội tương ứng với thời gian của TCP và và nội chuẩn trong chuẩn. chuẩn.vậy, phương pháppháp trong mẫu mẫu chuẩn. Như vậy, phương có độ Nồng độ Lượng tích Độ đúng Trung RSD chuẩn trong mẫu Như Như vậy, phương pháp STT Nồng độ Lượng tích Độ đúng Trung RSD STT Nồng độ Lượng tích Độ đúng Trung RSD STT (ng/ml) đặcđộ đặcchọn chọn lọc. hiệu, hiệu, lọc. lọc. có độ đặc hiệu, chọn (ng/ml) được (ng/ml) được được (%)(%) bình (%)(%) (%) bình bình (%) có - -Khoảng tuyến tính và đường chuẩn của TCP: - Khoảng tuyến tính và đường chuẩn của TCP: Khoảng tuyến tính và đường chuẩn của TCP: 11 1 9,13 9,13 91,32 9,13 91,32 91,32 Bảng 1. Khoảng tuyến tính của TCP. Bảng 1. Khoảng tuyến tính của TCP. Bảng 1. Khoảng tuyến tính của TCP. 22 2 10 1010 10,37 103,74 97,83 6,37 10,37 10,37 103,74 97,83 6,37 103,74 97,83 6,37 Nồng độ TCP (ng/ml) Tỉ lệlệ diện tích pic Std/Is Nồng độ TCP (ng/ml) Tỉ lệ diện tích pic Std/Is Nồng độ TCP (ng/ml) Tỉ diện tích pic Std/Is 33 3 9,84 9,84 98,43 9,84 98,43 98,43 10 1010 0,0516 0,0516 0,0516 11 1 87,60 87,60 87,60 87,60 87,60 87,60 20 2020 0,0916 0,0916 0,0916 22 2 100 100 101,49 100 101,49 101,49 94,52 7,35 101,49 94,52 7,35 101,49 101,49 94,52 7,35 50 5050 0,2268 0,2268 0,2268 33 3 94,45 94,45 94,45 94,45 94,45 94,45 100 100 100 0,4347 0,4347 0,4347 11 1 478,82 95,76 478,82 478,82 95,76 95,76 200 200 200 0,8356 0,8356 0,8356 22 2 500 500 463,71 500 463,71 92,74 95,05 2,15 463,71 92,74 95,05 2,15 92,74 95,05 2,15 500 500 500 2,0853 2,0853 2,0853 33 3 483,23 96,65 483,23 483,23 96,65 96,65 Phương trình hồi quy y y = 0,0041x + 0,0134 Phương trình hồi quy y = 0,0041x + 0,0134 Phương trình hồi quy = 0,0041x + 0,0134 - -Giới hạn phát hiện (LOD) và và giới hạn định - Giới hạn phát hiện (LOD) giới hạn định Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ): lượng (LOQ): lượng(LOQ): Hệ số tương quan Hệ số tương quan Hệ số tương quan RR2 = 0,9999 2 2 R == 0,9999 0,9999 A bA b u n d a n c e undanc e - -Đường chuẩn TCP trong nước tiểu: - Đường chuẩn TCP trong nước tiểu: Đường chuẩn tiểu: 3 83 8 0 0 00 Io n 1 91 9 7 0 (1 9 69.7 0 to to 9179.7 .7): ): 5 N G .D.Dd\ a ta ta .m s Io n 7 .0 .0 0 (1 6 .7 0 1 7 0 0 0 0 5 N G \ d a .m s 3 63 6 0 0 00 3 43 4 0 0 00 3 23 2 0 0 00 3 03 0 0 0 00 S /N/N = .6 .6 S = 3 3 2 82 8 0 0 00 2 62 6 0 0 00 2 42 4 0 0 00 2200 2200 2000 2000 1800 1800 1600 1600 1400 1400 1200 1200 1000 1000 800 800 600 600 400 400 200 200 0 0 6 .8 0 6 .9 0 7 .0 0 7 .1 0 7 .2 0 7 .3 0 7 .4 0 7 .5 0 7 .6 0 7 .7 0 6 .8 0 6 .9 0 7 .0 0 7 .1 0 7 .2 0 7 .3 0 7 .4 0 7 .5 0 7 .6 0 7 .7 0 T im e --> T im e --> Hình 4. Sắc đồxác định LOD xác Hình 4. Sắc đồ đồ định LOD Hình 3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính Hình 3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính Hình 3. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính thôngqua xác4. địnhS/N xác định LOD Hình Sắc qua xácđịnh S/Ntrong nước tiểu. trong nước tiểu. giữa nồng độ TCP và tỉ tỉ lệ diện tích píc TCP/chuẩn nội. thông giữa nồng độ TCP và lệ diện tích píc TCP/chuẩn nội. giữa nồng độ TCP và tỉ lệ diện tích píc TCP/chuẩn nội. thông qua xác định S/N trong nước tiểu. Xác định LOD của phương pháp bằng cách Xác định LOD của phương pháp bằng cách Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa Có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa khảoXác các mẫu trắng phươngchuẩn có hàm sát định LOD của thêm chuẩn bằng cách mẫu trắng thêm pháp có hàm nồng độ TCP với tỉ tỉ lệ diện tích pic TCP/chuẩnnội nồng độ TCP với tỉ lệ diện tích pic TCP/chuẩnnội khảo sát các mẫu trắng thêm chuẩn có hàm lượng nồng độ TCP với lệ diện tích pic TCP/chuẩn nội khảo TCP giảm dần; so sánh tín hiệu chiều cao lượng sát các trong khoảng nồng độ khảo sát từ từ10-500 ng/ml trong khoảng nồng độ khảo sát 10-500 ng/ml lượng TCP giảm dần; so sánh tín hiệu chiều cao trong khoảng nồng độ khảo sát từ 10-500 ng/ml với của TCP với nhiễu đường nền tạichiềuhàm lượng TCP giảm dần; so sánh tín hiệu các cao của TCP của TCP với nhiễu đường nền tại các hàm lượng với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1, phương trình với hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1, phương trình hệ số tương quan xấp xỉ bằng 1, phương trình hồi hồi quy tuyến tính: hồi quy tuyến tính: đó. Xác định LOD nền nồng độ có S/N khoảng đó. Xác định LOD tại nồngcác hàmS/N khoảngXác với nhiễu đường tại tại độ có lượng đó. quy tuyến tính: bằng 3.Xác tại nồng độtạinồng độ có S/N khoảng bằng3.LOD định LOQ tạicó S/Nđộ có S/N khoảngXác định Xác định LOQ nồng khoảng bằng 3. y y = 0,0041x + 0,0134. y 0,0041x + 0,0134. == 0,0041x + 0,0134. bằng10. Kết tại nồng độ sátcho giới hạn phát hiện Kết bằngđịnh10. Kếtquả khảo sát S/N khoảng bằng 10. LOQ quả khảo có cho giới hạn phát hiện - Độ đúng, độ chính xác: độ đúng của phương - -Độ đúng, độ chính xác: độ đúng của phương (LOD) khảogiới hạn định hạn phát(LOQ) của TCPgiới (LOD) và giới cho giới lượng (LOQ) (LOD) TCP quả và sát hạn định lượng hiện của và pháp được xác định tại xác: độ đúng của phương Độ đúng, độ chính pháp được xác định tại 33 mức nồng độ (10 ng/ml, trong nướctiểu lần lượt của TCP trong nước tiểu trongnước lượng (LOQ)là 0,5 ng/ml và 1,5 ng/ml. lần hạn định tiểu lần lượt là 0,5 ng/ml và 1,5 ng/ml. phápng/ml và 500 ng/ml),mức nồng độ thựcng/ml,3 mức nồng (10 ng/ml, độ 100 được xác định tại 3 mỗi nồng độ (10hiện 100 ng/ml và 500 ng/ml), mỗi nồng độ thực hiện 3 100 ng/mlđịnh 500 ng/ml), mỗi nồng độ thực hiện Kết quả 0,5 ng/ml và 1,5 ng/ml.phânquả này cho thấy Kếtquả này cho thấy độ nhạy phân tích cao, đáp lượt là này cho thấy độ nhạy Kết tích cao, đáp lần. Xác và hàm lượng TCP trong mẫu bằng lần. Xác định hàm lượng TCP trong mẫu bằng ứngyêu cầu phân tích lượng vết. yêu cầu phân tích lượng vết. ứng nhạy phân tích cao, đáp ứng yêu cầu phân tích 3 lần. Xác định hàm lượng TCP trong thu hồi (là độ phương pháp đường chuẩn và tính độ mẫu bằng - Hiệu suất chiết: khảo sát hiệu suất chiết của phương pháp đường chuẩn và tính độ thu hồi (là lượng vết. chiết: khảo sát hiệu suất chiết của - Hiệu suất phương pháp đường chuẩn được so với lí thuyết).tỉ tỉ lệ % giữa lượng xác định và tính độ thu hồi (là TCP trong mẫu nước tiểu ở 3 nồng độ (10 ng, tỉ lệ % giữa lượng xác định được so với lí thuyết). TCP trong mẫu nước tiểu ở sátnồng độ (10 ng,của 3 lệ % quả khảo sát độ định được so với lí bảng 2. Kết Kết giữa lượng xác đúng thu được tại thuyết). 100 ng và 500 ng/ml); khảo - Hiệu suất chiết: tiến hành hiệu suất chiếtkí phân tích sắc Kết quả khảo sát độ đúng thu được tại bảng 2. 100 ng trong mẫu nước tiểu ở 3 nồng độ (10 ng, 100 và 500 ng/ml); tiến hành phân tích sắc kí quảTheo đó, độ các khoảng nồng bảng 2. trung khảo sát ở đúng thu được tại độ thấp, TCP theo chương trình đã xây dựng. Hiệu suất chiết Theo đó, ở các khoảng nồng độ thấp, trung theo chương ng/ml); tiến hành phân tích sắc kí theo ng và 500 trình đã xây dựng. Hiệu suất chiết bình và cao ở các khoảngphân tích, phương pháp Theo đó, của các chất nồng độ thấp, trung bình được tính bằng tỉ lệ % diện tích pic của dung dịch bình và cao của các chất phân tích, phương pháp được tính bằng tỉ lệ % diện tích pic của dung dịch và có của trị độ đúng (n =tích, phương pháphạn đều có giá 3) nằm trong giới đều chuẩn cùng nồng độ giữa chiết vàsuất chiết được chương trình đã xây dựng. Hiệu không chiết. đều caogiá trịcác đúng phân 3) nằm trong giới hạn độ chất (n = chuẩn cùng nồng độ giữa chiết và không chiết. cho phép từ 85-115%. Độ chính xác đáp ứng Kết quả khảo lệ % diện tíchchiết: tính bằng tỉ sát hiệu suất pic cho giá trị độ đúng (n = 3) nằm trong giới hạn cho có phép từ 85-115%. Độ chính xác đáp ứng Kết quả khảo sát hiệu suất chiết:của dung dịch chuẩn phép từ 85-115%. Độ chính
NGHIÊN CỨU - TRAO ĐỔI Bảng 3. Hiệu suất chiết TCP trong mẫu nước tiểu. Sắc kí khí khối phổ là một phương pháp phân tích hiện đại, có độ nhạy và chính xác cao, thường Độ thu hồi (%) STT dùng trong phân tích độc chất. Kết quả nghiên cứu 10 ng 100 ng 500 ng đã cho thấy tính phù hợp của hệ thống sắc kí khí 1 90,05 93,78 89,29 khối phổ tại thời gian lưu và diện tích pic, với thông 2 91,07 87,23 88,96 số RSD < 2%, phương pháp có tính chọn lọc, độ đặc hiệu cao, chứng tỏ hệ thống có tính phù hợp 3 87,03 90,15 84,39 cao, đáp ứng được yêu cầu phân tích TCP trong 4 88,51 85,26 92,28 nước tiểu. 5 84,29 91,87 90,17 Qua nghiên cứu này, chúng tôi cho rằng cần tiếp 6 89,46 88,29 86,98 tục nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định CP và các chất chuyển hóa trong mẫu máu; xây Trung bình 88,40 89,43 88,68 dựng phương pháp xác định chất chuyển hóa của RSD 2,76 3,49 3,06 một số thuốc trừ sâu nhóm phospho hữu cơ. Tại cả 3 mức nồng độ TCP được khảo sát, độ 5. KẾT LUẬN. thu hồi đều cao trên 80%. Hiệu suất chiết TCP từ Đã xây dựng được phương pháp xác định mẫu nước tiểu đạt trong khoảng từ 84,29-91,87%. 3,5,6-trichloro-2-pyridinol trong nước tiểu, làm cơ Kết quả giữa các lần phân tích có độ lặp lại tốt với sở để áp dụng trong giám định pháp y. Phương RSD < 5%. pháp có độ đặc hiệu cao, bảo đảm độ đúng, độ 3.3. Áp dụng quy trình phân tích mẫu thực tế: chính xác với khoảng tuyến tính rộng. Phương Dựa trên quy trình đã xây dựng, áp dụng để pháp đã được áp dụng hiệu quả khi định lượng định lượng TCP trong mẫu nước tiểu của người TCP trong 7 mẫu nước tiểu nghi ngờ ngộ độc CP. nghi ngờ ngộ độc CP; lặp lại 3 lần trên mỗi mẫu và TÀI LIỆU THAM KHẢO: tính kết quả trung bình. Kết quả cụ thể: 1. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn Bảng 4. Kết quả định lượng TCP trong mẫu (2019), Về việc loại bỏ thuốc bảo vệ thực vật chứa nước tiểu nghi ngờ. hoạt chất Chlorpyrifos ethyl và Fipronil ra khỏi danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng tại STT Họ và tên Nồng độ (ng/ml) Việt Nam, Quyết định số 501/QĐ-BNN-BVTV, ngày 1 Phạm Thị L. 249,27 ± 4,16 12/02/2019. 2 Ngô Công T. 81,24 ± 1,78 2. Emanuela Testai, Franca M. Buratti and Emma Di Consiglio (2010), “Chlorpyrifos”, Hayes’ 3 Đỗ Hải P. (-) Handbook of Pesticide Toxicology, pp. 1505-1526. 4 Cao Văn C. 63,32 ± 2,24 3. Berna van Wendel de Joode, Douglas 5 Ngô Trung O. 19,56 ± 1,79 Barraza, Clemens Ruepert, Ana Marı´a Mora, 6 Thái Anh T. (-) Leonel Co´ rdoba, Mattias O¨ berg, Catharina 7 Nguyễn Thị H. 32,99 ± 2,80 Wesseling, Donna Mergler, Christian H. Lindh (2012), “Indigenous children living nearby Kết quả phân tích 7 mẫu nước tiểu nghi ngờ ngộ plantations with chlorpyrifos-treated bags have độc CP, phát hiện 5 mẫu dương tính TCP và 2 mẫu elevated 3,5,6-trichloro-2-pyridinol (TCP) urinary không tìm thấy TCP. concentrations”, Environmental Research, Vol. 4. BÀN LUẬN. 117, pp. 17-26. Việc xác định được TCP trong nước tiểu có ý 4. Darcy D. Shackelford, Debra L. Young, nghĩa quan trọng trong giám định pháp y; đặc biệt Charles A. Mihaliak, Brad A. Shurdut, and Jeanne với các trường hợp nghi ngộ độc chlorpyrifos mà A. Itak (1999), “Practical Immunochemical Method không có mẫu phủ tạng gửi kèm. TCP trong nước for Determination of 3,5,6-Trichloro-2-pyridinol in tiểu tồn tại dưới cả dạng tự do và liên kết nên việc Human Urine: Applications andConsiderations for thủy phân mẫu giúp phân cắt liên kết của TCP với Exposure Assessment”, J. Agric. Food Chem, vol. acid glucoronic, xác định được tổng lượng TCP 47, pp 177−182. trong mẫu. Mẫu nước tiểu sau khi thủy phân có 5. Dung Tri Phung, Connell, Des, Miller, thể được chiết lỏng bằng các dung môi khác nhau Greg, Hodge, Mary, Patel, Renu, Cheng, Ron, hoặc chiết bằng các loại cột chiết pha rắn. EtOAc Abeyewardene, Manel, Chu, Cordia (2012), được lựa chọn làm dung môi chiết trong quy trình “Biological monitoring of chlorpyrifos exposure to phân tích do hiệu suất chiết cao, dịch chiết mẫu rice farmers in Vietnam”, Chemosphere, Vol. 87, sạch, ít tạp, tiết kiệm thời gian và chi phí. Issue 4, pp 294-300. q Tạp chí Y HỌC QUÂN SỰ, SỐ 360 (9-10/2022) 53