Nhân dòng và phân tích trình tự gene 28S rRNA của chủng nấm đảm sinh tổng hợp cellulase

Trịnh Đình Khá và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 96(08): 115 - 118<br /> <br /> NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ GENE 28S rRNA<br /> CỦA CHỦNG NẤM ĐẢM SINH TỔNG HỢP CELLULASE<br /> Trịnh Đình Khá1*, Quyền Đình Thi2, Nghiêm Ngọc Minh2<br /> 1<br /> <br /> 2<br /> <br /> Trường Đại học Khoa học – ĐH Thái Nguyên<br /> Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Cellulase là enzyme xúc tác thủy phân liên kết β-1,4-glycoside trong phân tử cellulose. Cellulase<br /> có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp. Hiện nay, cellulase được sản xuất bằng<br /> phương pháp lên men các chủng vi khuẩn, nấm và nấm đảm.<br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi mô tả kết quả nhân dòng và phân tích trình tự gene 28S rRNA<br /> của chủng nấm đảm NDVN sinh tổng hợp cellulase phân lập ở Việt Nam. Trình tự gene 28S rRNA<br /> của chủng NDVN có kích thước 602 bp và có độ tương đồng cao với một đại diện của chi nấm<br /> đảm Peniophora (96 - 99,8%). Chủng NDVN được đặt tên là Peniophora sp. NDVN01. Trình tự<br /> gene 28S rRNA của chủng này đã được đăng ký trên Genbank với mã số JF 925333.<br /> Từ khóa: cellulase, nhân dòng, gene 28S rRNA, giải trình tự, Peniophora sp. NDVN01<br /> <br /> MỞ ĐẦU*<br /> Cellulase là hệ enzyme có khả năng thủy phân<br /> liên kết β-1,4-glycoside trong phân tử<br /> cellulose tạo thành các polysaccharide mạch<br /> ngắn, dextrin và glucose. Do đó, cellulase có<br /> ý nghĩa lớn và nhiều ứng dụng trong công<br /> nghiệp và nông nghiệp [1, 2]. Cellulase được<br /> sinh tổng hợp bởi các chủng vi khuẩn, vi nấm<br /> và nấm đảm. Một trong những công việc cần<br /> tiến hành khi nghiên cứu các chủng vi sinh<br /> sinh tổng hợp enzyme là phải phân loại chủng<br /> vi sinh đó. Hiện nay, để phân loại chủng vi<br /> sinh vật người ta có thể dựa vào những đặc<br /> điểm hình thái, sinh lý sinh hóa và phân loại<br /> phân tử. Trong đó, phân loại học phân tử dựa<br /> vào trình tự nucleotit của gene mã hóa rRNA<br /> đang là một công cụ hữu hiệu trong phân loại<br /> và bổ sung cho quá trình phân loại bằng các<br /> đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa.<br /> Gene 28S rRNA là gene mã hóa đặc trưng<br /> cho rRNA của các chủng nấm nói chung và<br /> nấm đảm nói riêng. Vùng D1, D2 trên gene<br /> 28S rRNA có trình tự với độ bảo thủ cao, do<br /> đó trình tự vùng này thường được dùng trong<br /> phân loại phân tử [4]. Cặp mồi NL1, NL4<br /> được thiết kế để nhân vùng D1, D2 đã được<br /> nhiều tác giả sử dụng trong nghiên cứu phân<br /> loại học phân tử các chủng nấm [3, 6]. Trong<br /> *<br /> <br /> Tel: 0983 034876, Email: trinhdinhkha.tnus@gmail.com<br /> <br /> nghiên cứu này, chúng tôi công bố kết quả<br /> nhân dòng và phân tích trình tự vùng D1, D2<br /> của gene 28S rRNA của chủng nấm đảm<br /> NDVN có khả năng sinh tổng hợp cellulase<br /> phân lập ở Việt Nam<br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> Vật liệu<br /> - Chủng giống<br /> Chủng nấm NDVN có khả năng sinh tổng<br /> hợp cellulase phân lập từ gỗ mục được cung<br /> cấp từ bộ sưu tập chủng giống của phòng thí<br /> nghiệm Sinh học – Khoa Khoa học Sự sống –<br /> Trường Đại học Khoa học – Đại học Thái<br /> Nguyên. Chủng E. coli DH10B được cung<br /> cấp bởi Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme –<br /> Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học<br /> và Công nghệ Việt Nam.<br /> - Hóa chất<br /> Kit nhân dòng pJET 1.2/blunt, XhoI, XbaI, T4<br /> – DNA ligase được mua từ hãng Fermentas,<br /> CMC (carboxylmethyl cellulose) từ Sigma,<br /> Peptone, cao nấm men, agarose từ Bio Basic<br /> (Canada).<br /> Phương pháp<br /> - Tách chiết DNA tổng số<br /> Chủng nấm NDVN được nuôi cấy trong môi<br /> trường PDA dịch thể sau 5 ngày thu pellet.<br /> Pellet nấm được nghiền nhanh trong ni tơ<br /> lỏng thành dạng bột mịn. Mẫu được chuyển<br /> 115<br /> <br /> Trịnh Đình Khá và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> vào tube 2 ml, bổ sung dung dịch phá tế bào<br /> và 50 µl protease K (200 mg/ml) trong 3h ở<br /> 56°C, thỉnh thoảng đảo nhẹ. Sau đó, mẫu<br /> được bổ sung 200 µl dung dịch 5M potassium<br /> acetate ủ 10 phút trong đá. Sau khi ly tâm 10<br /> phút ở 4°C với 10000 vòng/phút, dịch nổi<br /> chứa DNA tiếp tục được chiết bằng<br /> chloroform : isoamyl alcohol (24:1) để loại<br /> protein và tủa DNA bằng 100% isopropanol.<br /> DNA được hòa trong đệm TE, pH 8,0 điện di<br /> kiểm tra và bảo quản ở -20°C [6].<br /> - Phân tích trình tự gene 28S rRNA<br /> Cặp mồi NL1 (5´- GCA TAT CAA TAA<br /> GCG GAG GAA AAG - 3´) và NL4 (5´GGT CCG TGT TTC AAG ACG G - 3´)<br /> được sử dụng để nhân phân đoạn gene 28S<br /> rRNA có kích thước khoảng hơn 600 bp của<br /> chủng nấm NDVN. Hỗn hợp phản ứng gồm<br /> 1,5 µl DNA khuôn; 1 µl mồi mỗi loại; 2 µl<br /> MgCl2; 0,25 µl Taq polymerase; 2,5 µl đệm;<br /> nước cất khử ion đến 25 µl. PCR được tiến<br /> hành theo chu trình: 95°C/ 5 phút, 30 chu kỳ<br /> (95°C/1 phút, 50°C/1 phút, 72°C/1 phút),<br /> 72°C/10 phút.<br /> Sản phẩm PCR được lai vào vector pJET 1.2<br /> bằng T4 ligase theo kit của hãng Fermentas.<br /> Sản phẩm lai được biến nạp vào tế bào E. coli<br /> chủng DH10B và chọn lọc trên môi trường<br /> LB có bổ sung ampicillin nuôi cấy ở 37°C<br /> qua đêm. DNA plasmid được tách chiết và<br /> tinh sạch theo phương pháp của Sambrook và<br /> Russell (2001) [5].<br /> Trình tự gene 28S rRNA được đọc trên máy<br /> đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant<br /> Genetic Analyser. Trình tự nucleotit được xử<br /> lý và phân tích bằng phần mềm DNA star và<br /> Blast để xác định hệ số tương đồng và dựng<br /> cây phân loại.<br /> KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> Tách chiết DNA tổng số và khuếch đại<br /> gene 28S rRNA<br /> DNA tổng số của chủng nấm NDVN được<br /> tách chiết theo phương pháp đã mô tả. Kết<br /> quả điện di trên gel agarose cho thấy DNA<br /> không bị đứt gãy, đảm bảo độ sạch và đủ hàm<br /> lượng cho các nghiên cứu về nhân dòng gene<br /> (hình 1A). Sử dụng cặp mồi NL1, NL4 thiết<br /> 116<br /> <br /> 96(08): 115 - 118<br /> <br /> kế dựa trên trình tự vùng bảo thủ của gene<br /> 28S rRNA chúng tôi đã nhân được sản phẩm<br /> PCR tương đối đặc hiệu có kích thước khoảng<br /> 600 bp (hình 1B). Kết quả này phù hợp với<br /> tính toán lý thuyết về kích thước của phân<br /> đoạn gene 28S rRNA và tương đương với<br /> những nghiên cứu trước đây về phân đoạn<br /> gen 28S rRNA của chủng Aspergillus<br /> fumigatus, Emericella sp. DTQ-RM1.5 và<br /> Penicillium sp. DTQ-HK1 [6].<br /> <br /> M<br /> 1<br /> <br /> bp<br /> 2<br /> <br /> M<br /> <br /> 1000<br /> 3000<br /> 1000<br /> 500<br /> <br /> >600<br /> bp<br /> <br /> B<br /> <br /> A<br /> <br /> Hình 1. Hình ảnh điện di DNA<br /> tổng số (A) và sản phẩm PCR (B)<br /> M: Marker; 1: DNA tổng số; 2: Sản phẩm PCR<br /> <br /> A<br /> <br /> B<br /> <br /> Hình 2. Hình ảnh điện di plasmid (A) và sản<br /> phẩm cắt bằng enzyme giới hạn (B)<br /> dc: đối chứng pJET1.2; M: Marker; 1: plasmid<br /> không mang đoạn chèn; 2: plasmid có mang đoạn<br /> chèn; 3: sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng<br /> enzyme XhoI và XbaI<br /> <br /> Nhân dòng<br /> Sản phẩm PCR được lai vào vector pJET 1.2<br /> và biến nạp vào tế bào E. coli chủng DH10B.<br /> Plasmid tái tổ hợp đã được tinh sạch và điện<br /> di kiểm tra. Kết quả cho thấy dòng plasmid số<br /> <br /> Trịnh Đình Khá và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 2 cao hơn đối chứng âm (Hình 2A), rất có thể<br /> sản phẩm PCR đã được lai vào vector pJET<br /> 1.2. Để khẳng định chúng tôi đã tiến hành cắt<br /> plasmid tái tổ hợp bằng enzyme giới hạn XhoI<br /> và XbaI. Kết quả điện di cho thấy có sản<br /> phẩm cắt kích thước khoảng 600 bp (hình 2B)<br /> phù hợp với tính toán lý thuyết. Như vậy, sản<br /> PCR đã được được nhân dòng bằng vector<br /> pJET 1.2.<br /> Phân tích trình tự<br /> Sản phẩm plasmid tái tổ hợp mang phân đoạn<br /> chèn đã được đọc trình tự. Kết quả cho thấy<br /> phân đoạn gene 28S rRNA của chủng NDVN<br /> có kích thước 602 bp (hình 3).<br /> Sử dụng phần mềm Blast so sánh với các<br /> trình tự gene đã công bố trên Genbank chúng<br /> tôi nhận thấy, trình tự phân đoạn gene 28S<br /> rRNA của chủng NDVN có độ tương đồng<br /> cao với một số loài thuộc chi nấm đảm<br /> <br /> 96(08): 115 - 118<br /> <br /> Peniophora. Sử dụng phần mềm DNA star<br /> chúng tôi đã tính được hệ số tương đồng di<br /> truyền của chủng NDVN với một số chủng<br /> thuộc chi Peniophora và dựng được cây phát<br /> sinh chủng loại (hình 4).<br /> Hệ số di truyền về trình tự gene 28S rRNA<br /> của chủng NDVN tương đồng 99,8% với<br /> chủng Peniophora sp. M126-1 (mã số trên<br /> Genbank: HM 595612); tương đồng 99% với<br /> chủng Peniophoraceae sp. ZLY-2010 (mã số<br /> trên Genbank HM 595614); tương đồng<br /> 98,3% với chủng Peniophora aurantiaca (mã<br /> số trên Genbank HQ 604854) và tương đồng<br /> 96,3% với chủng Peniophora sp. CBS 122.91<br /> (mã số trên Genbank DQ 094783). Chủng<br /> NDVN đã được đặt tên là Peniophora sp.<br /> NDVN01 và trình tự phân đoạn gene 28S<br /> rRNA đã được đăng ký trên Genbank với mã<br /> số JF 925333.<br /> <br /> GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAGAAACTAACAAGGATTCCCCTAGTAACTGCGAGT<br /> GAAGCGGGATGAGCTCAAATTTAAAATCTGGCGTCTTCGGCGTCCGAGTTGTAATTT<br /> AGAGAAGCGTTTTCCGTGCTGGACCGTGTACAAGTCTCCTGGAACGGAGCGTCATAG<br /> AGGGTGAGAATCCCGTCTTTGACACGGACCCCCAGTGCTCTGTGATACGCTCTCGAA<br /> GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCAAAATGGGTGGTGAACTCCATCTAAAGCTA<br /> AATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACCGTGAGGGAAAGATGAAAAGCACT<br /> TTGGAAAGAGAGTGAAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAACACTTGAAGTCAG<br /> TCGCGTCCGCCGGGATTCAGCCGCAAGGTGTACTTTCCGGTGGACGGGCCAGCATCA<br /> CTTTCGATCATCGGAAAAGGGCGAGAGGAATGTGGCACCTCCGGGTGTGTTATAGCC<br /> TCTTGTCGTATACGGTGACCGGGAGTGAGGACCGCCTTTGTAGGATGCTGGCGTAAT<br /> GGCTTTAAACGACCCGTCTTGAAACACGGACC<br /> Hình 3. Trình tự nucleotit phân đoạn gene 28S rRNA của chủng NDVN<br /> Pci42 4.se q<br /> Ub c1 98 .s eq<br /> Pci78 6.se q<br /> Ps M6 12 .s eq<br /> Pa u8 54 .s eq<br /> Pin 42 5.se q<br /> Ab y597 .se q<br /> Pp i65 1.se q<br /> ND VN_ 28 .seq<br /> Ps M6 11 .s eq<br /> Ps Z6 14 .s eq<br /> Ps C7 83 .s eq<br /> Da p4 28 .s eq<br /> Vs p2 18 .seq<br /> Ss 12 41 .s eq<br /> <br /> 5.1<br /> 4<br /> <br /> 2<br /> Nu cle otide S ub stitu tio ns (x10 0)<br /> <br /> 0<br /> <br /> Hình 4. Cây phát sinh chủng loại chủng nấm NDVN phân lập ở Việt Nam<br /> Aby597: Amphinema byssoides (AF518597); Dap428: Dichostereum aff. pallescens KHL10258<br /> (AF506428); Pau854: Peniophora aurantiaca (HQ604854); Pci424: Peniophora cinerea (AF506424);<br /> Pci786: Peniophora cinerea (DQ094786); Pin425: Peniophora incarnate (AF506425); Ppi651:<br /> Peniophora pini (EU118651); PsC783: Peniophora sp. CBS 122.91 (DQ094783); PsM611: Peniophora sp.<br /> M104-3B (HM595611); PsM612: Peniophora sp. M126-1 (HM595612); PsZ614: Peniophoraceae sp.<br /> ZLY-2010 (HM595614); Ss1241: Scytinostroma sp. 171a (AB470241); Ubc198: Uncultured<br /> Basidiomycota clone bas07110 (HQ433198); Vsp218: Vararia sphaericospora (AY293218).<br /> <br /> 117<br /> <br /> Trịnh Đình Khá và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> KẾT LUẬN<br /> Đã nhân dòng và phân tích trình tự gene 28<br /> rRNA của chủng nấm NDVN phân lập ở Việt<br /> Nam. Phân đoạn gene 28S rRNA của chủng<br /> NDVN có kích thước 602 bp. Trình tự<br /> nucleotit tương đồng 96-99,8% với một số<br /> chủng thuộc chi nấm đảm Peniophora. Chủng<br /> NDVN đã được đặt tên là Peniophora sp.<br /> NDVN01 và trình tự nucleotit gene 28S<br /> rRNA đã được đăng ký trên Genbank với mã<br /> số JF 925333.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> [1]. Bhat M.K., (2000), "Cellulase and related<br /> enzymes in biotechnology", Biotechnol. Adv., 18,<br /> 355-383.<br /> [2]. Dürre P., (1998), "New insights and novel<br /> developments<br /> in<br /> clostridial<br /> acetone/butanol/isopropanol fermentation", Appl.<br /> Microbiol. Biotechnol., 49, 639-648.<br /> <br /> 96(08): 115 - 118<br /> <br /> [3]. Hans P.H., Steven F.H., Timothy J.L., David<br /> W.W., Christine J.M., (2005), "Assessment of<br /> ribosomal<br /> large-subunit<br /> D1-D2,<br /> internal<br /> transcribed spacer 1, and internal transcribed<br /> spacer 2 regions as targets for molecular<br /> identification of medically important Aspergillus<br /> species", J. Clin. Microbiol., 45, 2092–2103.<br /> [4]. Prasanna D.K., Daisy L.K., David N.F.,<br /> (2009), "Sequencing and analysis of fungal rRNA<br /> operons for development of broad-range fungal<br /> PCR assays", Appl. Environ. Microbiol., 75,<br /> 1559-1565.<br /> [5]. Sambrook J., Russell D.W., (2001), Molecular<br /> cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring<br /> Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,<br /> New York.<br /> [6]. Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ<br /> Lê Thanh, (2007), "Tuyển chọn và nghiên cứu ảnh<br /> hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng<br /> sinh tổng hợp cellulase của chủng Penicillium<br /> sp. DTQ-HK1", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5,<br /> 355-362.<br /> <br /> SUMMARY<br /> CLONING AND SEQUENCING ANALYSIS 28S rRNA GENE<br /> OF BASIDIOMYCETE STRAIN FOR CELLULASE PRODUCTION<br /> Trinh Dinh Kha1*, Quyen Dinh Thi2, Nghiem Ngoc Minh2<br /> 2<br /> <br /> 1<br /> College of Sciences – TNU<br /> Institute of Biotechnology – VAST<br /> <br /> Cellulase is an enzyme catalyzing hydrolysis of 1,4-β glycoside bonds in molecule cellulose.<br /> Cellulase has a broad variety of applications in industries and agricultures. Currently, the cellulase<br /> is produced by fermentation of bacteria, fungus and basidiomycetes.<br /> In this study, we described results from cloning and sequencing analysis 28S rRNA gene of<br /> basidiomycete strain for cellulase production. 28S rRNA gene of NDVN strain had size 602 bp.<br /> Gene sequence had high homology to some representatives of basidiomycetes genus Peniophora<br /> (96-99,8%). The 28S rRNA gene of NDVN strain was deposited in GenBank with accession<br /> number JF 925333 (Peniophora sp. NDVN01).<br /> Key words: cellulase, cloning, gene 28S rRNA, peniophora sp. NDVN01, sequencing<br /> <br /> *<br /> <br /> Tel: 0983 034876, Email: trinhdinhkha.tnus@gmail.com<br /> <br /> 118<br /> <br />