Nhân dòng và phân tích trình tự promoter của gene Igf2 từ nhau thai chuột

TAÏP CHÍ KHOA HOÏC ÑAÏI HOÏC SAØI GOØN Soá 31 (56) - Thaùng 8/2017<br /> <br /> <br /> <br /> Nhân dòng và phân tích trình tự promoter<br /> của gene Igf2 từ nhau thai chuột<br /> <br /> Cloning and analysing the sequence of Igf2 gene’s promoter from the mouse’s placenta<br /> <br /> Đỗ Mỹ Hiếu, Trường Đại học Sư phạm Huế<br /> Do My Hieu, Hue University of Education<br /> <br /> TS. Phạm Quang Chinh, Trường Đại học Sư phạm Huế<br /> Nguyen Thi Thu Hang, Ph.D., Hue University of Education<br /> <br /> TS. Trần Văn Giang, Trường Đại học Sư phạm Huế<br /> Tran Van Giang, Ph.D., Hue University of Education<br /> <br /> Tóm tắt<br /> Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) là gene in dấu, chỉ biểu hiện trên allele có nguồn gốc từ cá thể<br /> đực (bố). Nó giữ nhiều chức năng quan trọng, cơ chế kiểm soát biểu hiện của gene Igf2 khá phức tạp và<br /> được điều khiển trực tiếp bởi các promoter. Hai promoter P2 và P3 của gene Igf2 đã được tách chiết,<br /> khuếch đại, tinh sạch và nhân dòng từ mô nhau thai chuột 17 ngày. Trình tự promoter P2 và P3 của gene<br /> Igf2 có chiều dài lần lượt là 420 và 212 nucleotid. Trình tự của các promoter này có độ tương đồng rất<br /> cao với trình tự (U71085.1) và (AH001929.2) trên GenBank.<br /> Từ khóa: gene in dấu, Igf2, nhau thai, nhân dòng, promoter.<br /> Abstract<br /> Gene Igf2 (Insulin-like growth factor 2) is an imprinted gene which is expressed from only one of the<br /> parental chromosomes. This gene plays a lot of important functions; the mechanism for controlling its<br /> expression is quite complex and is carried out by the promoters. The P2 and P3 promoters of Igf2 have<br /> been successfully split, amplified, purified and cloned from placental tissues of 17-day-old male mice.<br /> The P2 and P3 promoters of the Igf2 gene are 420 and 212 nucleotides in length, which are very much<br /> similar with GenBank sequences (U71085.1 and AH001929.2 respectively).<br /> Keywords: imprinted gene, Igf2, placenta, cloning, promoter.<br /> <br /> <br /> <br /> 1. Đặt vấn đề đều có sự biểu hiện như nhau. Thế nhưng,<br /> Động vật có vú là những loài có bộ một số gene chỉ biểu hiện bản sao có nguồn<br /> nhiễm sắc thể lưỡng bội, đời con thừa gốc từ bố hoặc mẹ. Hiện tượng đó được gọi<br /> hưởng bộ nhiễm sắc thể của cả bố và là in dấu hệ gene (Genomic imprinting). Có<br /> mẹ. Như vậy, chúng có hai bản sao của mỗi hơn 100 gene in dấu, trong đó điển hình là<br /> gene. Theo quy luật Mendel, thông thường gene Igf2 (Insulin - like growth factor 2)<br /> cả hai bản sao từ bố hoặc mẹ của mỗi gene nằm trên nhiễm sắc thể số 7 của chuột và số<br /> <br /> 11<br /> NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T<br /> <br /> <br /> 11 của người [4 5]. Ở người, gene in dấu exon 6. Trong đó, exon 4 là exon đầu tiên<br /> (Imprinting gene) này chỉ biểu hiện trên và mang bộ ba mã hóa amino acid mở đầu.<br /> allele có nguồn gốc từ bố, còn bản sao này Hai promoter P2 và P3 biểu hiện phổ biến<br /> từ cơ thể mẹ truyền cho con thì không được trong tất cả các mô và nằm gần exon 4, nên<br /> biểu hiện [3]. Gene này mã hóa một protein nó liên quan rất lớn đến cơ chế biểu hiện<br /> hoạt động như một yếu tố điều hòa sinh của gene Igf2. Khi nghiên cứu mức độ biểu<br /> trưởng, đặc biệt hoạt động mạnh trong giai hiện promoter P2 và P3 trên chuột thì thấy<br /> đoạn phôi thai ở động vật có vú cũng như ở rằng hai promoter này biểu hiện cao hầu hết<br /> người. Gene Igf2 kiểm soát sự tăng sinh, các mô cơ quan được nghiên cứu (gan,<br /> sinh trưởng và biệt hóa của tế bào và đặc thận, tim). Còn các promoter khác như P0<br /> biệt là liên quan đến sự điều hòa phát triển và P1 thì biểu hiện khá thấp [3]. Vì vậy, xác<br /> phôi và sự phát triển của nhau thai. Với định được trình tự của các promoter này<br /> chức năng đó, gene Igf2 biểu hiện sớm trong nhau thai để từ đó nghiên cứu chính<br /> trong quá trình phát triển phôi ở tất cả các xác mức độ biểu hiện của gene Igf2 trong<br /> loại mô nội bì, ngoại bì và trung bì, ở cơ thể nhau thai chuột thực sự là cần thiết.<br /> trưởng thành, gene này biểu hiện thấp [1]. 2. Nguyên liệu và phương pháp<br /> Gene Igf2 trên chuột được điều khiển 2.1. Nguyên liệu và hóa chất<br /> bởi 4 promoter khác nhau và các promoter 2.1.1. Nguyên liệu<br /> này có trình tự bảo thủ cao giữa gene Igf2 Các mẫu nhau thai chuột đực 17 ngày<br /> trên chuột và người và chúng chỉ biểu hiện tuổi được thu nhận tại phòng thí nghiệm<br /> trên allele có nguồn gốc từ cá thể đực (bố) Giải phẫu - Sinh lý thuộc khoa Sinh,<br /> truyền cho đời con [2]. Mức độ biểu hiện trường Đại học Sư phạm Huế, xử lý mẫu<br /> của gene này chủ yếu do các promoter với nitơ lỏng và bảo quản ở nhiệt độ -20oC<br /> quyết định, 4 promoter đã được biết liên để tiến hành tách chiết ADN (Hình 1 A).<br /> quan đến sự biểu hiện của gene là P0, P1 và Cặp mồi đặc hiệu được sử d ng để thực<br /> P2 và P3 [7]. Các promoter này điều khiển hiện quá trình khuếch đại và nh n dòng<br /> biểu hiện của 3 exon là exon 4, exon 5 và (Bảng 1).<br /> <br /> Bảng 1. Trình tự cặp mồi đặc hiệu sử dụng trong nghiên cứu<br /> <br /> Tên mồi Trình tự Chiều dài<br /> <br /> P2F 5'-CTATAAGAACCGGGGGTTGG-3' 21N<br /> <br /> P2R 5'-GGACAGGCGTGGCGGCGCTC-3' 20N<br /> <br /> P3F 5'-GGGAGTGGTCAGCAGGGAGGGG-3' 22N<br /> <br /> P3R 5'-CTCCTGGCTCCACAGCCCTG-3' 20N<br /> <br /> - Chủng vi khuẩn E. coli DH5α do Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế cung cấp.<br /> - Vertor tạo dòng pGEM-T Easy (Promega) (Hình 1 B).<br /> <br /> <br /> <br /> 12<br />  ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Vị trí lấy mẫu tách chiết ADN (A). Cấu tạo vector pGEM-T Easy (Promega) (B)<br /> <br /> 2.1.2. Hóa chất và thiết bị 2X. Sau 4 giờ ủ ở nhiệt độ 50°C, dịch tế<br /> Các hóa chất được sử d ng trong bào được chiết với 4 ml phenol/chloroform<br /> nghiên cứu: Các môi trường LB lỏng, LB (1:1). Ly tâm dịch chiết trong 30 phút ở<br /> đặc. Các dung dịch: phá tế bào (10mM 20°C (6000v/1phút). Dịch nổi được tủa<br /> Tris, 100mM EDTA, 2% SDS, pH 8,0), bằng 8 ml (EtOH) 70% và 300 µl NaCl 5<br /> dung dịch tủa protein (Ammonium acetate M ở nhiệt độ -20°C trong 12 giờ hoặc qua<br /> 7,5 M), PCI (Phenol - Chloroform - đêm. Ly t m thu lấy tủa, rửa tủa bằng 500<br /> Isoamylchloroform: 25:24:1), đệm TE µl (EtOH) 70%. Ly tâm loại bỏ cồn, làm<br /> (10Mm Tris-HCl; 1mM EDTA; pH 8,0), khô ADN ở nhiệt độ phòng.<br /> cồn rửa (70% EtOH). Tris, EDTA, SDS, 2.2.2. Phản ứng PCR<br /> ammonium acetate, protein K, agarose, Thành phần phản ứng PCR bao gồm: 1<br /> chloroform, ethanol, loading dye (5X), µl ADN; 6 µl đệm 2X PCR master mix<br /> ampicillin,… (2,4 mM dNTP mỗi loại; 0,3 đơn vị Taq<br /> Các thiết bị được sử d ng trong nghiên ADN polymerase), 0,5 µl mồi xuôi, 0,5 µl<br /> cứu như: Máy PCR (Mỹ), máy ly tâm lạnh mồi ngược và bổ sung nước vô trùng để đạt<br /> (Đức), máy vortex (Đức), hệ thống đọc UV thể tích phản ứng là 12 µl. Phản ứng PCR<br /> trực tiếp (Mỹ), hệ thống điện di (Mỹ). Máy được thực hiện theo chu trình sau: biến tính<br /> pH tự động (Th y Sỹ), nồi khử trùng (Nhật ADN bộ gene 95oC/5 phút; tiếp đến là 30<br /> Bản), tủ lạnh (Nhật Bản), tủ lắc (Đức), tủ chu kỳ: 95oC/1 phút, 48oC/30 giây, 72oC/1<br /> cấy (Nhật bản), tủ ấm (Nhật bản), cân phân phút; cuối cùng là 72oC/10 phút [8].<br /> tích (Đức). 2.2.3. Điện di agarose gel<br /> 2.2. Phương pháp nghiên cứu Chuẩn bị agaro gel 0,8%, sau khi gel<br /> Các phương pháp sinh học phân tử đã đông, tra mẫu vào các giếng, chạy với<br /> được tham khảo theo Sambrook và Ruesel điện trường 100 V trong 30 phút. Sau khi<br /> (2001) [9] có cải tiến. Các thí nghiệm được kết thúc điện di, nhuộm bản gel với<br /> thực hiện từ 10/2015 - 5/2017 tại phòng thí ethidium bromide (EtBr) có nồng độ 0,5<br /> nghiệm trọng điểm Di truyền - Vi sinh thuộc g/ml trong 15 phút, rửa lại bằng nước cất<br /> khoa Sinh trường Đại học Sư phạm Huế. và cho vào hệ thống máy đọc gel. Ch p<br /> 2.2.1. Tách chiết ADN tổng số ảnh và phân tích kết quả.<br /> 2 ml dịch mô tế bào được giải đông ở 2.2.4. Gắn sản phẩm PCR vào vector<br /> nhiệt độ phòng. Thêm 40 µl proteinase Sản phẩm PCR được gắn trong vector<br /> (20µg/ml) đã được hòa tan trong đệm pK pGEM®-T Easy (Promega), thành phần<br /> <br /> 13<br /> NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T<br /> <br /> <br /> phản ứng gắn bao gồm: 1 µl vector, 5 µl phút. Cuối cùng, chuyển cột lọc sang ống<br /> đệm 2X (2X Rapid Ligation Buffer), 1 µl Eppendorf mới, thêm 50 µl dung dịch thôi<br /> T4 ADN ligase, 1 µl sản phẩm, sau đó bổ rửa lên trên màng lọc, để ở nhiệt độ phòng<br /> sung nước vô trùng để đạt thể tích cuối cùng trong 1 phút. Ly tâm trong 30 giây, bỏ cột<br /> 10 µl, phản ứng được ủ ở 4oC qua đêm. lọc và thu được dịch chứa ADN plasmid<br /> 2.2.5. Biến nạp sản phẩm gắn dính vào tinh sạch ở dưới. Toàn bộ quá trình thực<br /> tế bào khả biến E. coli hiện với tốc độ ly tâm là 12000 vòng/phút.<br /> Vector mang sản phẩm PCR được biến 2.2.7. Giải trình tự ADN<br /> nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng Giải trình tự ADN theo nguyên lý của<br /> phương pháp shock nhiệt. Hỗn hợp biến phương pháp Sanger dựa trên các dideoxyl.<br /> nạp bao gồm: 10 µl dung dịch gắn chứa ADN polymerase xúc tác gắn các<br /> vector mang sản phẩm PCR, 200 µl dung deoxynucleotide vào đầu 3’-OH của mạch<br /> dịch tế bào khả biến DH5α. Hỗn hợp được đơn ADN đang tổng hợp, khi gặp các<br /> trộn nhẹ nhàng, ủ 30 phút trong tủ đá, sốc deoxynucleotide không có nhóm 3’-OH<br /> nhiệt ở 42oC trong 45 giây, ngay lập tức phản ứng tổng hợp sẽ bị ngừng lại. Kết quả<br /> chuyển sang khay đá, ủ 3 phút. Sau đó hỗn là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao<br /> hợp được nuôi trong môi trường LB lỏng gồm các polynucleotide có kích thước hơn<br /> (800 µl) (không có kháng sinh), ủ ở 37oC, kém nhau 1 nucleotide được phát hiện bằng<br /> lắc 200 vòng/phút trong 1 giờ. Lấy 200 µl đầu dò huỳnh quang trên máy đọc chương<br /> dung dịch biến nạp trải trên môi trường LB trình tự động ABI PRISM 3100 Avant<br /> đặc có bổ sung 50 µg/ml ampicillin, 30 µl Gentic Analyzer. Các phản ứng tổng hợp bị<br /> X - Gal 40 µg/ml, 30 µl IPTG 100 mM. dừng bằng cách bổ sung formamite ngăn<br /> 2.2.6. Tách chiết và tinh sạch plasmid không cho các sợi ADN bắt cặp với nhau,<br /> tái tổ hợp các phân tử ADN mới được tổng hợp được<br /> Lấy 1 ml dịch nuôi cấy các plasmid tái điện di trên gel polyacrylamite để tách<br /> tổ hợp đưa vào ống Eppendorf 1,5 ml, ly nhau ra. Dịch chiết plasmid tinh sạch được<br /> t m 6000 vòng/phút trong 2 phút để thu tế gửi đến công ty Biomedic để giải trình tự<br /> bào. Sau ly tâm bỏ dịch phía trên, giữ cặn thông qua Viện công nghệ Sinh học – Đại<br /> tế bào bên dưới. Thêm 600 µl nước cất vào học Huế.<br /> để hòa tan cặn, dùng pipet hút nhẹ lên 2.2.8. Phân tích trình tự các promoter<br /> xuống vài lần cho đều. Thêm 100 µl dung Các trình peomoter của gene IGF2<br /> dịch phá tế bào vào hỗn dịch trên để phá trong nhau thai chuột 17 ngày được phân<br /> màng tế bào, đảo nhẹ nhàng, ủ ở nhiệt độ tích bằng chương trình BLAST. Các trình<br /> phòng trong 5 phút. Thêm 350 µl dung tự được chỉnh sửa và sắp xếp bằng phần<br /> dịch rửa (nhiệt độ 4 - 8oC), trộn nhẹ nhàng, mềm BioEdit 7.0.<br /> sau đó ly t m trong 10 phút, nhiệt độ 4oC. 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận<br /> Lấy dịch trong bên trên đưa lên màng của 3.1. Tách chiết và khuếch đại ADN<br /> cột lọc. Ly tâm trong 1 phút, bỏ dịch dưới. tổng số<br /> Bổ sung 200 µl dung dịch rửa lên trên Mẫu nhau thai chuột được sử d ng để<br /> màng lọc, sau đó ly t m, bỏ dịch bên dưới. tách chiết ADN tổng số. ADN tổng số sau<br /> Rửa với 400 µl dịch rửa, ly tâm tiếp trong khi được tách chiết được điện di trên gel<br /> 1 phút. Làm khô cột bằng ly tâm trong 2 agarose 0,8 % (Hình 2 A).<br /> <br /> <br /> <br /> 14<br />  ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 2. Điện di đồ ADN tổng số (A). Khuếch đại promoter P3,<br /> M: ADN marker 1 kb, 1: sản phẩm PCR (B). Khuếch đại promoter P2,<br /> M: ADN marker 1 kb, 2: sản phẩm PCR (C)<br /> <br /> Kết quả điện di cho thấy ADN tổng số trắng được chọn vì khuẩn lạc trắng là<br /> được tách chiết từ nhau thai chuột tập trung khuẩn lạc có thể mang gene tái tổ hợp và<br /> thành một băng khá đậm, tương đối sạch, ít tiếp t c nuôi trong môi trường LB lỏng có<br /> bị đứt gãy, đảm bảo chất lượng cho các bổ sung ampicillin. Dịch nuôi qua đêm<br /> nghiên cứu tiếp theo. được sử d ng để tách chiết plasmid và<br /> Từ ADN tổng số, các promoter P2 và kiểm tra sự có mặt của các plamid tái tổ<br /> P3 của gene Igf2 được nhân lên bằng phản hợp mang các promoter.<br /> ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu. Sản phẩm<br /> PCR tập trung một băng rõ nét, với kích<br /> thước khoảng hơn 200 bp đối với promoter<br /> P3 (Hình 2 B) và khoảng hơn 400 bp đối<br /> với promoter P2 (Hình 2 C). Kích thước<br /> ph n đoạn được nh n lên tương đương với<br /> kích thước của P2 và P3 được tính toán<br /> trên l thuyết.<br /> 3.2. Nhân dòng các promoter P2 và P3<br /> 3.2.1. Gắn sản phẩm PCR vào vector<br /> và biến nạp vào tế bào khả biến Hình 3. Khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch<br /> Sản phẩm PCR được gắn vào vector 3.2.2. Tách chiết và kiểm tra plasmid<br /> pGEM - T Easy, sau đó biến nạp vào tế bào tái tổ hợp<br /> tế bào khả biến. Dung dịch biến nạp được Các khuẩn lạc trắng được nuôi trong<br /> trải lên đĩa chứa môi trường chọn lọc (LB môi trường LB lỏng có chứa 50 µg/ml<br /> + agar + 50 µg/ml ampicillin + X-Gal 40 ampicillin để tiến hành tách plasmid.<br /> µg/ml + IPTG 100 mM). Nuôi qua đêm ở Plasmid sau khi được tách chiết được điện di<br /> nhiệt độ 37oC, các khuẩn lạc sẽ xuất hiện kiểm tra với khuẩn lạc chỉ có vertor không<br /> trên đĩa thạch (Hình 3). Các khuẩn lạc mang gene chèn làm đối chứng âm (Hình 4).<br /> <br /> <br /> 15<br /> NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 4. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp, (ĐC) plasmid đối chứng, (1, 2, 3, 4, 5)<br /> plasmid được tách chiết (A). PCR kiểm tra plasmid 5 (B). PCR kiểm tra plasmid 1<br /> (C), M: marker<br /> <br /> Ba plasmid (1, 2, 3) tách chiết từ các tinh sạch được gửi đi giải trình tự. Kết quả<br /> khuẩn lạc mang sản phẩm biến nạp là PCR giải trình tự promoter P2 có 420<br /> P2, trong đó chỉ có plasmid 1 có chênh so nucleotide, 44 đảo CpG (Hình 5) và kết<br /> với đối chứng, nghĩa là nó có khả năng quả giải trình tự promoter P3 có 212<br /> mang tái tổ hợp, nên kích thước lớn hơn và nucleotide, có 6 đảo CpG (Hình 5). Quá<br /> di chuyển chậm hơn, các plasmid này tiếp trình methyl hóa ADN chủ yếu xảy ra ở vị<br /> t c PCR với mồi đặc hiệu để kiểm tra độ trí phân tử carbon C5 của cytosine nằm<br /> chính xác, sản phẩm trên điện di đồ cho trong các đảo CpG, thành dạng 5-<br /> thấy, kích thước đúng với sản phẩm PCR methylcytosine. Sự thay thế này không<br /> P2 từ ADN tổng số cũng như tính toán trên làm thay đổi trình tự ADN nhưng liên<br /> lý thuyết (Hình 4 A C). Ba plasmid (4, 5, quan rất lớn đến cơ chế biểu hiện của gene<br /> 6) tách chiết từ các khuẩn lạc mang sản [6]. Với sự có mặt nhiều đảo CpG trong<br /> phẩm biến nạp từ PCR P3, trong đó chỉ có trình tự P2 thì promoter này dễ bị methyl<br /> plasmid 4 có chênh so với đối chứng, nghĩa hóa và ảnh hưởng lớn đến quá trình biểu<br /> là nó có khả năng mang tái tổ hợp, nên kích hiện của gene Igf2 so với promoter P3.<br /> thước lớn hơn và di chuyển chậm hơn, các Quá trình methyl hóa ADN thường xảy ra<br /> plasmid này tiếp t c PCR với mồi đặc hiệu ở vị trí dinucleotide CpG, gọi là đảo CpG,<br /> để kiểm tra độ chính xác, sản phẩm trên nó thường diễn ra ở một số vùng nhất định<br /> điện di đồ cho thấy, kích thước đúng với như vùng promoter hoặc vùng exon đầu<br /> sản phẩm PCR P3 từ ADN tổng số cũng tiên. Ở nhiều bệnh, như ung thư, đảo CpG<br /> như tính toán trên l thuyết (Hình 4 A &B). trong promoter của gene có sự methyl hóa<br /> 3.3. Giải trình tự và so sánh với quá mức bất thường, sẽ gây ra sự bất hoạt<br /> trình tự trên GenBank quá trình phiên mã và có thể được di<br /> Mẫu plasmid tái tổ hợp mang promoter truyền cho các tế bào con bởi sự phân<br /> P2 và P3 của chuột Mus musculus sau khi bào [9].<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 16<br />  ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 5. Trình tự promoter P2 và P3<br /> <br /> Sau khi khuếch đại và giải trình tự 2 kích thước lớn với 1 vị trí TSS, tiếp đến P1<br /> promoter P2 và P3, kích thước và vị trí [10] và kích thước nhỏ nhất là P0 và P3.<br /> đoạn khuyếch đại được so sánh với các Cả 2 promoter này không có hộp TATA<br /> promoter khác của gene Igf2 (Hình 6). như các promoter điển hình của một số loài<br /> Trong tương quan các promoter thì P2 có sinh vật nhân chuẩn khác.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6. Vị trí và kích thước các bản sao P2, P3 trong tương quan với các promoter khác<br /> <br /> <br /> <br /> 17<br /> NHÂN DÒNG VÀ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ PROMOTER CỦA GENE IGF2 TỪ NHAU THAI CHU T<br /> <br /> <br /> Trình tự promoter sau khi phân tích, độ tương đồng promoter P3 với trình tự<br /> tiến hành so sánh với trình tự (U71085.1) (AH001929.2) là 100% (Hình 7 B). Điều<br /> và (AH001929.2) trên GenBank bằng phần này chứng tỏ promoter P3 không có sự đa<br /> mềm BLAST. Kết quả cho thấy promoter hình di truyền, còn promoter P2 có hai<br /> P2 so với trình tự (U71085.1) có mức độ điểm SNP, nhìn chung hai promoter này có<br /> tương đồng promoter là 99%, có hai tính bảo thủ cao. Đồng thời, trong quá trình<br /> nucleotide sai khác (Hình 7 A). Còn mức thực nghiên cứu không xảy ra sai sót.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> A<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> B<br /> Hình 7. So sánh P2 và P3 với trình tự trên GenBank<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 18<br />  ĐỖ MỸ HIẾU - PHẠM QUANG CHINH - TRẦN VĂN GIANG<br /> <br /> <br /> 4. Kết luận 2583 - 2592.<br /> ADN tổng số được tách chiết từ mô 4. Elly, H. (2003) The many levels of control of<br /> nhau thai của chuột Mus musculus 17 ngày Igf2 expression, Nature, 5, 91 - 102.<br /> có nồng độ cao, sạch, ít bị đứt gãy và tập 5. Firth, M., Ganeshprasad, U., Baxter, R. C.<br /> trung thành băng rõ nét. Đã giải trình tự và (1998) Structural determinants of ligand and<br /> phân tích trình tự của promoter P2 có 44 cell surface binding of insulin-like growth<br /> đảo CpG và có 420 nucleotide, giải trình tự factor-binding protein-3, J. Biol. Chem,<br /> 273(5): 2631 - 2638.<br /> promoter P3 có 6 đảo CpG và có 212<br /> nucleotide. Trong tương quan các promoter 6. Kim, M., S., Lee, J., Sidransky, D. (2010)<br /> ADN methylation markers in colorectal cancer,<br /> thì P2 có kích thước lớn với 1 vị trí TSS,<br /> Cancer Metastasis Review, 29. 181 - 206.<br /> P3 ngắn hơn và 1 TSS. Cả 2 promoter này<br /> 7. Monk, D., Sanches, R., Arnaud, P.,<br /> không có hợp TATA như promoter của<br /> Apostolidou, S., Hills, F., Abu-Amero, S.,<br /> một số loài sinh vật nhân chuẩn khác. Murrell, A., Friess, H., Reik, W., Stanier, P.,<br /> Trình tự promoter P2 có độ tương đồng là Constância, M., Moore, G. E. (2006)<br /> 99% so với trình tự trên GenBank Imprinting of IGF2 P0 Transcript and Novel<br /> (U71085.1), còn promoter P3 có độ tương Alternatively Spliced INS-IGF2 Isoforms<br /> đồng là 100% so với trình tự trên GenBank Show Differences between Mouse and<br /> (AH001929.2). Human.” Human molecular genetics, 15(8):<br /> 1259 – 1269.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 8. Rand, K., Clark, S. J., Molloy, P. (2002)<br /> 1. Christiansen, J., Kofod, M., Nielsen, F., C. Conversion-specific detection of DNA<br /> (1994) A Guanosine Quadruplex and Two methylation using real-time polymerase chain<br /> Stable Hairpins Flank a Major Cleavage Site reaction (ConLight-MSP) to avoid false<br /> in Insulin-like Growth Factor II mRNA. positives. Methods: 27 (2): 114 - 120.<br /> Nucleic acids research, 22(25): 5709 – 5716. 9. Sambrook, J. and Russel, D. W. (2001)<br /> 2. Constância, Hemberger, M., Hughes, J., Molecular cloning: A laboratory manual, cold<br /> Dean, W., Smith, F., Fundele, R,, Stewart, F., spring harbor labortory press.<br /> Kelsey, G., Fowden, A., Sibley, C., Reik, W. 10. Tran, V. G., Court, F., Duputié, A., Antoine,<br /> (2002) Placental - Specific IGF - II is a Major E., Aptel, N., Milligan, L., Carbonell, F.,<br /> Modulator of Placental and Fetal growth, Lelay-Taha, M., Piette, J., Weber, M.,<br /> Nature, 417(6892): 945 - 948. Montarras, D., Pinset, C., Dandolo, L., Forné,<br /> 3. Butler, J. E., Kadonaga, J. T. (2002) Regulation T., Cathala, G. (2012) H19 Antisense RNA<br /> of gene expression the RNA polymerase II core Can up-Regulate Igf2 Transcription by<br /> promotor: A Key component in the regulation Activation of a Novel Promoter in Mouse<br /> of gene expression, Gene and development, 16. Myoblasts. PloS one, 7(5): e37923.<br /> <br /> <br /> Ngày nhận bài: 30/6/2017 Biên tập xong: 15/8/2017 Duyệt đăng: 20/8/2017<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 19<br />