Nhân giống cây dâu tây nhật (Fragaria ananassa “Penihuble”) từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> NHÂN GIỐNG CÂY DÂU TÂY NHẬT (FRAGARIA ANANASSA “PENIHUBLE”)<br /> TỪ NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG<br /> <br /> Trần Thị Ngọc Lan1<br /> 1<br /> Trường Cao đẳng Kinh tế Kỹ thuật Lâm đồng<br /> <br /> Thông tin chung: ABSTRACT<br /> Ngày nhận bài: 18/01/2018<br /> Ngày nhận kết quả bình duyệt: A regeneration system was carried out to examine the competence of<br /> 18/02/2018 micropropagation from apical meristem culture of strawberry Fragaria<br /> Ngày chấp nhận đăng: 04/2018 ananassa “Penihuble”. The results showed that calli and somatic embryos were<br /> Title: formed from apical meristem culture of runner tips on the MS medium<br /> The process of supplemented with 30 g/l sucrose, 7 g/l agar, 0.2 mg/l NAA, 0.5 mg/l BA (with<br /> micropropagation of Fragaria the highest survival rate of 93.33%, the best induction callus rate of 60%, 5.33<br /> ananassa “Penihuble” through somatic embryos/sample). Calli which was multiplied with 8.56 - fold fresh<br /> apical meristem culture mass, formed somatic embryos with 15.78 embryos/initial callus when they<br /> Keywords: were subcultured on the MS medium supplemented with 30 g/l sucrose, 7 g/l<br /> α-naphtaleneacetic acid (NAA), agar, 0.5 mg/l BA. These embryos converted into normal plants on the ½ MS<br /> 6-benzyladenine (BA), Apical medium with the best regeneration rate of 100% without plant growth<br /> meristem, Fragaria ananassa regulators. Histological observation showed that these calli contained<br /> “Penihuble”, somatic embryos<br /> embryogenic cells. In the ex-vitro culture, the highest survival rate was<br /> Từ khóa: observed with mixture of Tribat substrate and rice husk ash in the ratio of 1:1<br /> α-naphtaleneacetic acid (72.33%) and no morphological variations were observed in these plantlets.<br /> (NAA), 6-benzyladenine<br /> (BA), cây dâu tây, đỉnh sinh<br /> trưởng, Fragaria ananassa TÓM TẮT<br /> “Penihuble”, phôi sinh Nghiên cứu khảo sát khả năng nhân giống dâu tây Nhật “Penihuble”. Nuôi cấy<br /> dưỡng<br /> đỉnh sinh trưởng từ các ngó dâu tây đạt tỷ lệ sống 93,33%, hình thành mô sẹo<br /> 60%, phôi sinh dưỡng (5,33 phôi/mẫu) trên môi trường MS bổ sung 0,2 mg/l<br /> NAA, 0,5 mg/l BA. Mô sẹo được tiếp tục nhân lên đạt tỷ lệ tăng trưởng 8,56 lần,<br /> hình thành phôi sinh dưỡng (15,78 phôi/mẫu) trên môi trường MS bổ sung 30<br /> g/l sucrose, 7 g/l agar, 0,5 mg/l BA. Môi trường ½ MS là phù hợp cho phôi sinh<br /> dưỡng phát triển thành cây với tỷ lệ 100% mà không cần bổ sung chất điều hòa<br /> sinh trưởng thực vật. Quan sát mô học mô sẹo cho thấy có nhiều tế bào có tiềm<br /> năng phát sinh phôi. Cây con trồng trong tự nhiên với giá thể thích hợp là hỗn<br /> hợp đất sạch Tribat và trấu hun (tỷ lệ 1:1), tỷ lệ sống 72,33%. Không có các sai<br /> hình nào được ghi nhận từ những cây này sau 30 ngày nuôi trồng.<br /> <br /> <br /> <br /> 1. GIỚI THIỆU của cây dâu tây giàu chất khoáng, các hợp chất<br /> Cây dâu tây (Fragaria ananassa) thuộc họ Hoa nhóm flavonoid... chống oxi hóa, giàu các loại<br /> hồng (Rosaceae) là loại cây cho quả ngon, màu vitamin nhóm B và đặc biệt là lượng vitamin C<br /> sắc và hương thơm quyến rũ, được sử dụng làm khá cao, cao hơn cả cam, dưa hấu. Đây là đặc<br /> thực phẩm với nhiều món ăn ngon, đa dạng. Quả điểm ưu việt của quả dâu tây, giúp tăng sức đề<br /> <br /> 19<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27<br /> <br /> kháng, chống nhiễm trùng, nhiễm độc, cảm cúm, 0,2 mg/l kinetin để nhân chồi, ra rễ trên môi<br /> tốt cho tim mạch và chống stress. Quả dâu tây trường MS bổ sung 0,1 mg/l BA và 0,2 mg/l IBA.<br /> cũng chứa nhiều acid ellagic, được xem là chất Ashrafuzzaman và cs. (2013) đã nhân giống chồi<br /> kháng ung thư (ICAR news, từ các ngó dâu tây trên môi trường MS bổ sung<br /> 2005). Vì vậy, đây là loại quả có tiềm năng kinh 0,5 mg/l BA, ra rễ trên môi trường MS bổ sung<br /> tế lớn. Trong các giống dây tây, giống dâu tây 0,5 mg/l IBA. Husaini và cs. (2008) đã có công<br /> Nhật nhập nội cho quả to, màu sắc đỏ, đẹp, đặc bố về sự hình thành phôi sinh dưỡng từ mô sẹo<br /> biệt có độ ngọt và mùi hương hấp dẫn. Tuy nhiên, dâu tây được hình thành từ những mẫu lá trên môi<br /> trong nhân giống dâu tây, phương pháp nhân trường MS bổ sung 4 mg/l TDZ. Tuy nhiên,<br /> giống sinh dưỡng từ ngó dâu thường dễ nhiễm phương pháp tạo phôi sinh dưỡng từ nuôi cấy<br /> bệnh và thoái hóa giống, phương pháp gieo hạt đỉnh sinh trưởng thì chưa được đề cập. Đây cũng<br /> thường cho cây biến dị, quả nhỏ. là phương pháp hữu hiệu trong nhân giống và gia<br /> Trên thế giới đã có các công bố về vi nhân giống tăng tỷ lệ không nhiễm virus. Vì vậy, trong nghiên<br /> dâu tây. Wang, Wergin và Zimmerman (1984), cứu này, mục tiêu mà chúng tôi hướng đến là<br /> nuôi cấy các phôi chưa trưởng thành của quả dâu nhân giống hàng loạt cây con từ nuôi cấy đỉnh<br /> tây để tạo phôi sinh dưỡng. Hassan và cs. (2010), sinh trưởng qua con đường phát sinh phôi sinh<br /> nhân giống các mắt đốt dâu tây Fragaria x dưỡng với giống dâu tây Nhật nhập nội có giá trị<br /> ananassa Duch trên môi trường MS bổ sung 1 kinh tế cao.<br /> mg/l BA và 0,1 mg/l NAA để nhân chồi, ra rễ trên 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN<br /> môi trường MS bổ sung 0,1 mg/l IAA và cho CỨU<br /> thấy sử dụng GA3 hay nước dừa không ảnh hưởng 2.1 Vật liệu<br /> đáng kể đến quá trình nhân chồi của dâu tây. Mir Đối tượng nghiên cứu: các ngó của giống dâu tây<br /> và cs. (2010), nhân chồi từ các mắt đốt dâu tây (Fragaria ananassa “Penihuble”), có xuất xứ từ<br /> trên môi trường MS bổ sung 2 mg/l BA và 0,5 Nhật, là các giống dâu cho trái to, ngọt và đẹp<br /> mg/l NAA. Moradi, Otroshy và Azimi (2011), được nhập nội (Hình 1a, 1b). Trên thị trường tại<br /> nhân giống các mắt đốt của cây dâu tây gieo hạt in Đà lạt, 1 kg dâu tây loại này có giá khoảng<br /> vitro trên môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l BA và 400000 Việt Nam đồng.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 1. Cây dâu tây (Fragaria ananassa “Penihuble”).<br /> a. Cây mang quả. b. Một đoạn ngó dâu tây.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 20<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27<br /> <br /> Môi trường nuôi cấy cơ bản: MS (Murashige, agar và các nồng độ khác nhau của BA (0, 0,5<br /> Skoog, 1962), pH được điều chỉnh 5,7, hấp vô mg/l) và NAA (0, 0,2 mg/l). Nuôi cấy 5 mẫu có<br /> trùng ở 121 οC, 1 atm. khối lượng 50 mg/bình, thể tích 250 ml với 40 ml<br /> 2.2 Phương pháp môi trường nuôi cấy. Mỗi nghiệm thức gồm 5<br /> bình. Quan sát và thu nhận số liệu về tỷ lệ tăng<br /> 2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa<br /> trưởng (khối lượng mô sẹo sau nuôi cấy/khối<br /> sinh trưởng thực vật lên quá trình nuôi<br /> lượng mô sẹo trước nuôi cấy), số phôi sinh dưỡng<br /> cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây<br /> trung bình hình thành sau 30 ngày nuôi cấy.<br /> Xử lý nhiệt chồi dâu tây<br /> 2.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ môi<br /> Các ngó dâu tây được bỏ các lá ngoài, có chiều trường MS lên sự sinh trưởng của phôi<br /> dài từ 1 cm – 1,25 cm, rửa sạch dưới vòi nước sinh dưỡng cây dâu tây<br /> đang chảy, rửa lại bằng nước rửa chén Sunlight,<br /> Các phôi sinh dưỡng thu nhận từ các thí nghiệm<br /> rửa lại dưới vòi nước đang chảy, khử trùng trong<br /> trên được nuôi cấy trên 3 loại môi trường: MS. ¾<br /> tủ cấy bằng ethanol 900, rửa nước đã hấp vô trùng,<br /> MS và ½ MS bổ sung 20 g/l sucrose, 1 g/l than<br /> khử trùng tiếp bằng HgCl2 0,1% trong 6 phút, bỏ<br /> hoạt tính (AC) và 7 g/l agar để khảo sát sự sinh<br /> bớt các lá ngoài, chỉ còn lại các chồi mang từ 4 - 5<br /> trưởng, hình thành cây và phát triển của các phôi<br /> lá non, rửa nước đã hấp vô trùng 3 lần. Nuôi cấy<br /> này. Nuôi cấy 20 mẫu/bình có thể tích 500 ml với<br /> các chồi này trong môi trường MS bổ sung 30 g/l<br /> 70 ml môi trường nuôi cấy. Quan sát và thu nhận<br /> sucrose, 7 g/l agar, cường độ ánh sáng 2000 lux<br /> số liệu về tỷ lệ hình thành cây con (số phôi hình<br /> và độ ẩm không khí 70%, ủ trong điều kiện chiếu<br /> thành cây con trên số phôi nuôi cấy *100), chiều<br /> sáng 16/24 giờ ở 37 οC trong 7 ngày nhằm tiêu<br /> cao, màu sắc của cây, số lá, số rễ và chiều dài rễ<br /> diệt virus (nếu có). Nuôi cấy 1 mẫu/bình có thể<br /> trung bình/cây sau 30 ngày nuôi cấy.<br /> tích 250 ml với 20 ml môi trường nuôi cấy.<br /> 2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của giá thể môi<br /> Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng<br /> trường lên khả năng sống sót và sinh<br /> Các chồi đã được nuôi in vitro như trên được tách trưởng của cây dâu tây sau 30 ngày nuôi<br /> tiếp các lá bao chồi, rửa nước đã hấp vô trùng 3 trồng trong điều kiện ex vitro<br /> lần, dùng dao và kẹp tách lấy đỉnh sinh trưởng<br /> Cây con từ nuôi cấy in vitro được giữ nguyên<br /> mang từ 2 - 3 lá sơ khởi (thao tác được thực hiện<br /> trong bình, chuyển ra ngoài vườn ươm trong 1<br /> dưới kính lúp, Hình 2a1.) và cấy vào môi trường<br /> tuần để thích ứng. Sau đó, cây con được lấy ra,<br /> MS bổ sung BA (0, 0,5 hoặc 1 mg/l), có kết hợp<br /> rửa sạch môi trường bám lên rễ, trồng trong các<br /> hay không kết hợp NAA (0, 0,2 mg/l), 30 g/l<br /> loại giá thể: vỏ trấu hun, đất sạch (Tribat 10<br /> sucrose và 7 g/l agar. Mỗi nghiệm thức gồm 5<br /> kg/bao) hay hỗn hợp tro trấu hun và đất sạch (tỷ lệ<br /> mẫu. Nuôi cấy 1 mẫu/bình có thể tích 250 ml với<br /> 1:1), có độ ẩm 85%. Cây được trồng trong các bầu<br /> 20 ml môi trường nuôi cấy. Theo dõi sự sống sót,<br /> nhựa polyethylene, đường kính bầu 8 cm; tưới cây<br /> sự phát sinh mô sẹo, phôi sinh dưỡng hay chồi<br /> 2 lần/ngày. Quan sát sự sống sót và sự sinh trưởng<br /> của mẫu cấy sau 15 ngày và 30 ngày nuôi cấy.<br /> của cây dâu tây. Số liệu được thu nhận sau 30<br /> 2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của NAA và BA lên ngày nuôi trồng.<br /> sự tăng trưởng của mô sẹo và hình thành<br /> 2.2.5 Quan sát mô học<br /> phôi sinh dưỡng dâu tây có nguồn gốc từ<br /> nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Làm các loại tiêu bản về mô sẹo với việc cắt lát<br /> theo chiều ngang mẫu mô sẹo cần quan sát, ngâm<br /> Các mô sẹo dâu tây hình thành từ nuôi cấy đỉnh<br /> trong dung dịch javel 10% trong 15 phút, rửa<br /> sinh trưởng (50 mg/mẫu) được nuôi cấy tiếp tục<br /> nước, ngâm trong dung dịch acid acetic 45%<br /> trên môi trường MS bổ sung 30 g/l sucrose, 7 g/l<br /> trong 15 phút, rửa nước, nhuộm màu bằng thuốc<br /> <br /> 21<br /> An Giang University Journal of Science – 2018, Vol. 19 (1), 19 – 27<br /> <br /> nhuộm hai màu đỏ carmin và xanh iod trong 15 xác suất P < 0,05) với phần mềm xử lý thống kê<br /> phút, rửa nước và quan sát trên kính hiển vi quang SPSS (Statistical Program Scientific System)<br /> học Olympus, Nhật với độ phóng đại 40 - 400 lần. 16.0.<br /> Quan sát đỉnh sinh trưởng cây dâu tây ở độ phóng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> đại 100 lần.<br /> 3.1 Ảnh hưởng của NAA và BA lên quá trình<br /> 2.2.6 Điều kiện thí nghiệm nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây<br /> Tất cả các thí nghiệm nhân giống in vitro và ex Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây với việc bổ<br /> vitro được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại ba sung các nồng độ khác nhau của NAA và BA, kết<br /> lần. Nhiệt độ phòng nuôi: 25 οC ± 1 οC, cường độ quả nhận được thể hiện qua Bảng 1.<br /> ánh sáng 2000 lux và độ ẩm không khí 70%. Chu<br /> Quan sát mẫu đỉnh sinh trưởng cây dâu tây trên<br /> kỳ chiếu sáng trong ngày: 16 giờ sáng và 8 giờ<br /> kính hiển vi có hình vòm (Hình 2a1). Đây là nơi<br /> tối. Trong thí nghiệm khảo sát sự thích nghi của<br /> chứa các tế bào mô phân sinh với những tế bào<br /> cây con trong điều kiện ex vitro thì sử dụng vườn<br /> kích thước nhỏ, nhân to và có tiềm năng phân chia<br /> ươm (có lưới che 50% ánh sáng trong 15 ngày<br /> mạnh mẽ. Có thể gọi đỉnh sinh trưởng là nơi chứa<br /> đầu), có nhiệt độ dao động ngày đêm là 17 οC –<br /> các tế bào gốc, nơi biệt hóa các cơ quan sau này.<br /> 25 οC ± 1 οC, cường độ ánh sáng: 7000 lux và độ<br /> Thông thường, các virus di chuyển dễ dàng trong<br /> ẩm không khí: 80%.<br /> cơ thể thực vật thông qua hệ thống mạch dẫn, là<br /> 2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu cấu trúc mà ở đỉnh phân sinh không có. Chính vì<br /> Các thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn vậy, mô phân sinh đỉnh thường khó nhiễm virus<br /> toàn ngẫu nhiên, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 (Morel, 1960). Hơn nữa, hoạt tính trao đổi chất<br /> lần. Các số liệu thu được là giá trị trung bình của cao trong quá trình phân chia của các tế bào mô<br /> 3 lần lặp lại. Số liệu thu thập được xử lý trên phần phân sinh cũng như nồng độ auxin nội sinh cao ở<br /> mềm Excel 2010 và được phân tích thống kê bằng trong các đỉnh chồi có thể ức chế sự sinh sản, sao<br /> phép thử Duncan (sự khác biệt có ý nghĩa ở mức chép của virus.<br /> <br /> Bảng 1. Ảnh hưởng của NAA và BA lên quá trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng cây dâu tây sau 30 ngày nuôi cấy.<br /> <br /> Môi trường nuôi cấy bổ Tỷ lệ hình<br /> Tỷ lệ sống sót Số phôi/mẫu Tỷ lệ hình<br /> sung thành mô sẹo<br /> (%) thành chồi (%)<br /> NAA(mg/l) BA(mg/l) (%)<br /> 0 0 66,67b* 20,00d 1,67c 46,67a<br /> 0,2 0 26,67d 26,67c 1,67c 0,00e<br /> 0 0,5 66,67b 40,00b 2,00c 26,67c<br /> 0,2 0,5 93,33a 60,00a 5,33a 33,33b<br /> 0,2 1 53,33c 40,00b 3,67b 13,33d<br /> Chú thích: *: Các mẫu tự khác nhau (a,b,...) trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa với P