Phân lập một số hợp chất từ thân rễ cây ngải trắng curcuma aromatica salisb., zingiberaceae trồng tại An Giang

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> PHÂN LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT TỪ THÂN RỄ<br /> CÂY NGẢI TRẮNG CURCUMA AROMATICA SALISB.,<br /> ZINGIBERACEAE TRỒNG TẠI AN GIANG<br /> Võ Thanh Hóa***, Nguyễn Thị Tường Vy*, Huỳnh Thanh Tuấn**,<br /> Đỗ Đức Minh**, Lê Kiều Minh**, Nguyễn Đức Hạnh*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mở đầu – mục tiêu: Dược liệu Ngải trắng Curcuma aromatica được trồng và sử dụng như một vị thuốc<br /> nam phổ biến tại An Giang. Hiện nay, chưa có công trình nghiên cứu nào công bố thành phần hóa học của dược<br /> liệu này trồng tại An Giang. Do đó, việc phân lập các hợp chất từ dược liệu Ngải trắng đóng vai trò quan trọng<br /> trong việc nghiên cứu thuốc và kiểm ngiệm dược liệu Ngải trắng trồng tại An Giang.<br /> Phương ph{p nghiên cứu: Dược liệu Ngải trắng được chiết bằng cồn 96%, cô thu hồi dung môi được cao.<br /> Từ cao cồn 96%, t{ch c{c ph}n đoạn đơn giản bằng phương ph{p chiết phân bố giữa nước v| c{c dung môi có độ<br /> phân cực khác nhau. Phân lập các hợp chất tinh khiết bằng phương ph{p sắc ký cột cổ điển và sắc ký cột pha đảo.<br /> Cấu trúc các chất phân lập được x{c định bằng phổ NMR.<br /> Kết quả: Từ 1,5 kg dược liệu Ngải trắng, chiết xuất được 170 g cao cồn 96%. Bằng phương ph{p chiết phân<br /> bố thu được 62 g cao ph}n đoạn ether dầu v| 70 g cao ph}n đoạn ethyl acetat. Từ cao ph}n đoạn ether dầu, phân<br /> lập được 50 mg hợp chất germacron và 107 mg hợp chất curdion. Từ cao ph}n đoạn ethyl acetat phân lập<br /> được120 mg hợp chất zedoarondiol.<br /> Kết luận: Các hợp chất phân lập được là những hợp chất đã được nghiên cứu và công bố có tác dụng dược lý<br /> chống ung thư, chống oxy hóa, kháng viêm(1-3). Do đó những hợp chất này phù hợp để lựa chọn làm chất điểm chỉ<br /> cho dược liệu Ngải trắng trồng tại An Giang.<br /> Từ khóa: Curuma aromatica, germacron, curdion, zedoarondiol, An Giang<br /> <br /> ABSTRACT<br /> ISOLATION OF COMPOUNDS FROM RHIZOME OF CURCUMA AROMATICA SALISB,<br /> ZINGIBERACEAE GROWN IN AN GIANG PROVINCE<br /> Vo Thanh Hoa, Nguyen Thi Tuong Vy, Huynh Thanh Tuan, Do Duc Minh, Le Kieu Minh,<br /> Nguyen Duc Hanh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 296 - 306<br /> Introduction - objectives: Ngai trang Curcuma aromatica is popularly used in the folk medicine in An<br /> Giang province. Until now there is no report on compounds isolated from C. aromatica grown in An Giang<br /> province. Hence, the aim of this study is to isolate and identify structures of compounds from C. aromatica<br /> rhizome.<br /> Methods: Dried C. aromatica rhizome was extracted by ethanol 96% to obtain the dried extract. The extract<br /> was further subjected to liquid-liquid distribution based on the solubility of compounds. Isolation of compounds<br /> from simple fractions was carried out by common and popular phytochemical methods. Structures of isolated<br /> compounds were deduced by means of NMR spectroscopy.<br /> * Khoa Dƣợc, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh<br /> ** Trung tâm Y Sinh học phân tử, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh<br /> ***Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y Dƣợc Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Đức Hạnh<br /> ĐT: 0913576748<br /> <br /> 298<br /> <br /> Email: duchanh@ump.edu.vn<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Results: 170 g of dried ethanolic extract were obtained from 1.5 kg of dried C. aromatica rhizome. By liquidliquid distribution, 70 g of petroleum ether extract and 62 g of ethyl acetate extract were obtained. From petroleum<br /> ether extract, 50 mg of germ crone and 107 mg of curdione were isolated. From ethyl acetate extract, 120 mg of<br /> zedoarondiol were isolated.<br /> Conclusions: Three major compounds of C. aromatica rhizome such as germ crone, curdione and<br /> zedoarondiol, were isolated and identified. These compounds were reported on pharmacological activities such as<br /> anti-cancer, anti-oxidant, anti-inflammation (1-3). The compounds could be used as markers for controlling the<br /> quality of C. aromatica grown in An Giang.<br /> Keywords: Curuma aromatica, germacrone, curdione, zedoarondiol<br /> môi, thu đƣợc c{c cao ph}n đoạn PE và EA<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> tƣơng ứng.<br /> Ngải trắng Curcuma aromatica, một loài thuộc<br /> Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột pha<br /> họ Gừng (Zingiberaceae) hiện nay mọc hoang và<br /> thuận<br /> đƣợc trồng chủ yếu ở vùng Bảy Núi, thuộc tỉnh<br /> C{c cao ph}n đoạn đƣợc phân lập các chất<br /> An Giang. Trong các bài thuốc dân gian, Ngải<br /> bằng<br /> phƣơng ph{p sắc ký cột cổ điển, sử dụng<br /> trắng đƣợc dùng để trị đau dạ d|y, đau bụng,<br /> silica gel cỡ hạt 40 – 63 µm (Merck); hệ dung môi<br /> viêm gan, làm lành vết thƣơng, kh{ng viêm v|<br /> đã khảo sát bằng phƣơng ph{p sắc ký lớp mỏng<br /> phối hợp trong các bài thuốc trị ung thƣ. C}y<br /> (SKLM). Tiến hành khai triển sắc ký cột và theo<br /> thuốc n|y đƣợc tỉnh An Giang đƣa v|o danh<br /> dõi c{c ph}n đoạn bằng SKLM. Dựa vào kết quả<br /> sách những dƣợc liệu cần bảo tồn và nghiên cứu<br /> SKLM để gom ph}n đoạn.<br /> phát triển nhằm mang lại lợi ích kinh tế cho<br /> ngƣời d}n. Đề t|i đƣợc tiến hành với mục đích<br /> phân lập một số hợp chất chính góp phần<br /> nghiên cứu thành phần hóa học và kiểm nghiệm<br /> dƣợc liệu Ngải trắng trồng tại An Giang.<br /> <br /> ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPH[P NGHIÊNCỨU<br /> Đối tƣợng nghiên cứu<br /> Thân rễ của cây Ngải trắng thu hái tại tỉnh<br /> An Giang đã đƣợc định danh bằng phƣơng<br /> pháp giải trình tự gen tại Trung tâm Y Sinh học<br /> phân tử, ĐH Y Dƣợc TP Hồ Chí Minh.<br /> Phƣơng ph{p nghiên cứu<br /> <br /> Phân lập một số hợp chất từ thân rễ cây Ngải<br /> trắng<br /> Chiết xuất<br /> Thân rễ Ngải trắng khô đƣợc chiết bằng<br /> phƣơng ph{p ngấm kiệt với dung môi cồn 96%.<br /> Dịch chiết đƣợc cô thu hồi dung môi thu đƣợc<br /> cao cồn 96%.<br /> Cao cồn 96% đƣợc ph}n t{n v|o nƣớc và tiến<br /> hành lắc phân bố lần lƣợt với ether dầu hỏa (PE)<br /> (60 – 90oC) và ethyl acetat (EA). Cô thu hồi dung<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột pha đảo<br /> C{c cao ph}n đoạn đƣợc phân lập bằng<br /> phƣơng ph{p sắc ký cột pha đảo, sử dụng silica<br /> gel RP18 cỡ hạt 40 – 63 µm (Merck); hệ dung môi<br /> methanol – nƣớc, tăng dần tỷ lệ methanol. Tiến<br /> hành khai triển sắc ký cột và theo dõi các phân<br /> đoạn bằng SKLM. Dựa vào kết quả SKLM để<br /> gom ph}n đoạn.<br /> Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập được<br /> Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng<br /> Bằng phƣơng ph{p SKLM, c{c hợp chất<br /> đƣợc kiểm tra độ tinh khiết. Khai triển các hợp<br /> chất này với 3 hệ dung môi khác nhau. Phát<br /> hiện bằng UV 254 và 365 nm, thuốc thử H2SO4<br /> 10%/ cồn.<br /> <br /> X{c định cấu trúc của các hợp chất phân lập<br /> X{c định cấu trúc của các chất phân lập đƣợc<br /> bằng phƣơng ph{p phổ NMR. Phổ NMR đƣợc<br /> đo với c{c kĩ thuật 1-D (1H-, 13C-) (M{y đo phổ<br /> cộng hƣởng từ hạt nhân Brüker AVANCE 500 Mỹ). Từ các dữ liệu phổ ghi nhận đƣợc, kết hợp<br /> với các dữ liệu từ các tài liệu tham khảo, định<br /> <br /> 299<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> hƣớng, x{c định cấu trúc hóa học của các chất<br /> phân lập.<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Phân lập<br /> <br /> Chiết xuất<br /> 1,5 kg dƣợc liệu khô, chiết ngấm kiệt bằng<br /> cồn 96%, thu hồi dung môi thu đƣợc 170 g cao<br /> cồn 96%. Từ 150 g cao cồn 96% lắc phân bố phân<br /> bố lần lƣợt với PE và EA thu đƣợc 62 g cao PE và<br /> 70 g cao EA.<br /> Phân lập các hợp chất trong cao EA bằng sắc<br /> ký cột pha thuận<br /> Từ 20 g cao EA, tiến hành sắc ký cột silica gel<br /> pha thuận với hệ dung môi ether dầu hỏa – ethyl<br /> acetat, với tỷ lệ tăng dần ethyl acetat. Thu đƣợc 5<br /> ph}n đoạn, trong đó ph}n đoạn 3 (PĐ 3) tƣơng<br /> ứng với tỷ lệ dung môi ether dầu – ethyl acetat (6<br /> : 4) cho 1 vết chính trên SKLM, cô thu hồi dung<br /> môi đƣợc 4,1 g PĐ 3.<br /> Tinh chế PĐ 3 bằng sắc ký cột pha đảo<br /> Từ 3 g PĐ 3, tiến hành sắc ký cột pha đảo hệ<br /> dung môi methanol – nƣớc, với tỷ lệ tăng dần<br /> methanol. Thu đƣợc 3 ph}n đoạn, trong đó ph}n<br /> đoạn 3-1 tƣơng ứng với tỷ lệ dung môi methanol<br /> 40% cho 1 vết trên SKLM, cô thu hồi dung môi<br /> đƣợc 120 mg hợp chất CA1.<br /> Phân lập các hợp chất trong cao PE bằng sắc<br /> ký cột pha thuận<br /> Từ 10 g cao PE, tiến hành sắc ký cột silica<br /> gel với hệ dung môi n-hexan – ethyl acetat, với<br /> tỷ lệ tăng dần ethyl acetat. Thu đƣợc 6 phân<br /> đoạn, trong đó ph}n đoạn 2 tƣơng ứng với hệ<br /> dung môi n-hexan – ethyl acetat (9 : 1) và phân<br /> đoạn 4 tƣơng ứng với hệ dung môi n-hexan –<br /> ethyl acetat (8 : 2) cho 1 vết trên SKLM, cô thu<br /> hồi dung môi, thu đƣợc 90 mg hợp chất CA2<br /> và 107 mg hợp chất CA3 tƣơng ứng với từng<br /> ph}n đoạn.<br /> <br /> Cloroform – Acid acetic (9 : 1); Hệ 2: n-Hexan –<br /> Ethyl acetat (4 : 6); Hệ 3: Ether dầu hỏa – Ethyl<br /> acetat (6 : 4). Phát hiện: Thuốc thử H2SO4<br /> 10%/ethanol. Cả 3 hợp chất CA1, CA2 và CA3<br /> đều cho 1 vết trên SKLM ở điều kiện phân tích.<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết bằng HPLC phân tích<br /> Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao<br /> Shimadzu LC – 8A, đầu dò UV (Nhật). Cột:<br /> Discovery HS C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm). Nhiệt độ:<br /> Nhiệt độ phòng. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Thể tích<br /> bơm: 20 µl. Bước sóng phát hiện: 214 nm. Pha động:<br /> acetonitril – nƣớc, rửa giải gradient. Dung môi<br /> pha mẫu: Pha động.<br /> Các hợp chất CA1, CA2 v| CA3 đều cho 1<br /> pic trên sắc ký đồ ở điều kiện phân tích.<br /> Tiến h|nh đo v| đối chiếu tài liệu, biện giải<br /> phổ của các hợp chất CA1, CA2 và CA3.<br /> X{c định cấu trúc của các hợp chất phân lập<br /> đƣợc<br /> <br /> Hợp chất CA1<br /> Phổ 1H và 13C-NMR của hợp chất CA1 đƣợc<br /> trình vày trong Hình 2, Hình 3 và Bảng 1.<br /> Từ phổ 1H- NMR cho thấy CA1 có chứa 4<br /> nhóm methyl tại 1,19 ppm, 1,2 ppm, 1,8 ppm và<br /> 1,9 ppm.<br /> Từ phổ 13C – NMR cho thấy hợp chất có 15C<br /> ứng với 15 tín hiệu. Phổ 13C – NMR của hợp chất<br /> CA1 cho 1 tín hiệu ceton tại 202,9 ppm, ngoài ra<br /> còn xuất hiện tín hiệu của >C= (tại C7 và C11,<br /> tƣơng ứng với 134,6 ppm và142,1 ppm).<br /> Từ kết quả phổ NMR, so sánh với tài liệu<br /> tham khảo(4), kết luận hợp chất CA1 chính là<br /> zedoarondiol và công thức cấu tạo nhƣ sau:<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết các chất phân lập<br /> <br /> Kiểm tra độ tinh khiết bằng sắc ký lớp mỏng<br /> Bản mỏng: Silica gel F254; Hệ dung môi: Hệ 1:<br /> <br /> 300<br /> <br /> Hình 1: Công thức cấu tạo của zedoarondiol<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Hình 2: Phổ 1H – NMR (500 MHz, CDCl3) của hợp chất CA1<br /> <br /> Hình 3: Phổ 13C – NMR (125 MHz, CDCl3) của hợp chất CA1<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br /> 301<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bảng 1: Bảng so sánh dữ liệu phổ NMR (CDCl3, 500/125 MHz) của CA1 với zedoarondiol (CDCl3, 90/22,5<br /> MHz) theo tài liệu(4)<br /> Vị tr<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> 11<br /> 12<br /> 13<br /> 14<br /> 15<br /> <br /> Zedoarondiol<br /> <br /> C (ppm)<br /> 55,9<br /> 22,9<br /> 28,5<br /> 79,9<br /> 52<br /> 39,7<br /> 134,6<br /> 202,9<br /> 59,8<br /> 72,7<br /> 142,1<br /> 21,9<br /> 22,2<br /> 22,7<br /> 20,6<br /> <br /> H (ppm, J/Hz)<br /> <br /> 2,60 d (13); 2,98 d (13)<br /> <br /> 1,84 s<br /> 1,94 s<br /> 1,18 s<br /> 1,20 s<br /> <br /> CA1<br /> <br /> C (ppm)<br /> 55,9<br /> 22,9<br /> 28,5<br /> 79,9<br /> 52<br /> 39,7<br /> 134,6<br /> 202,9<br /> 59,8<br /> 72,7<br /> 142,1<br /> 21,9<br /> 22,2<br /> 22,7<br /> 20,6<br /> <br /> H (ppm, J/Hz)<br /> <br /> 2,59 d (13); 2,94 d (13)<br /> <br /> 1,83 s<br /> 1,94 s<br /> 1,18 s<br /> 1,20 s<br /> <br /> Hợp chất CA2<br /> Phổ 1H và 12C-NMR của hợp chất CA2 đƣợc<br /> trình vày trong Hình 6, Hình 7 và Bảng 2.<br /> <br /> Hợp chất CA3<br /> Phổ 1H và 12C-NMR của hợp chất CA3 đƣợc<br /> trình bày trong Hình 8, Hình 9 và Bảng 3.<br /> <br /> Từ phổ 1H – NMR cho thấy CA2 có chứa 4<br /> nhóm methyl tƣơng ứng tại 1,776 ppm, 1,725<br /> ppm, 1,629 ppm và 1,441 ppm. Từ phổ 13C –<br /> NMR cho thấy hợp chất CA2 có 15C ứng với 15<br /> tín hiệu. Từ phổ này cho thấy có 1 tín hiệu ceton<br /> tại 207,9 ppm, ngoài ra còn xuất hiện 4 tín hiệu<br /> của >C= (tại C4, C7,C10, C11 ứng với 126,6 ppm,<br /> 129,5 ppm, 134,6ppm và 137,2 ppm) và 2 tín hiệu<br /> -CH= (tại C1 và C5 ứng với 132,6 ppm và 125,3<br /> ppm).<br /> <br /> Từ phổ 1H- NMR cho thấy CA3 có chứa 3<br /> nhóm methyl >C-CH3 tại 0,88 ppm, 0,95 ppm,<br /> 0,99 ppm; và chứa 1 nhóm methyl >C=C-CH3 tại<br /> 1,65 ppm. Từ phổ 13C – NMR cho thấy CA3 có<br /> 15C ứng với 15 tín hiệu, ngoài ra CA3 chứa 2<br /> nhóm ceton với hai tín hiệu tƣơng ứng với C5 và<br /> C8 tại 214,4 ppm và 211,1 ppm. Bên cạnh đó CA3<br /> còn chứa 1 tín hiệu >C= (ứng với C10 tại 129,9<br /> ppm) và một -CH= (ứng với C1 tại 131,6 ppm).<br /> <br /> Từ kết quả phổ NMR, so sánh với tài liệu<br /> tham khảo(5), kết luận hợp chất CV2 chính là<br /> germacron và công thức cấu tạo nhƣ sau:<br /> <br /> Hình 4: Công thức cấu tạo của germacron<br /> <br /> 302<br /> <br /> Từ kết quả phổ NMR, so sánh với tài liệu<br /> tham khảo(5), kết luận hợp chất CV3 chính là<br /> curdion và có công thức cấu tạo nhƣ sau:<br /> <br /> Hình 5: Công thức cấu tạo của curdion<br /> <br /> Chuyên Đề Dƣợc<br /> <br />