Nghiên cứu phân lập hai hợp chất terpenoid từ phân đoạn dịch chiết ethyl acetat của cây thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) trevis)

T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP HAI HỢP CHẤT TERPENOID TỪ<br /> PHÂN ĐOẠN DỊCH CHIẾT ETHYL ACETAT CỦA<br /> CÂY THẠCH TÙNG RĂNG CƯA (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis)<br /> Lê Đình Mạnh1; Nguyễn Văn Thư2; Trịnh Nam Trung2<br /> Nguyễn Duy Bắc2; Phạm Đức Thịnh2<br /> TÓM TẮT<br /> Mục tiêu: chiết xuất, phân lập, xác định được cấu trúc của một số hợp chất từ cây Thạch<br /> tùng răng cưa (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis). Đối tượng và phương pháp: mẫu nghiên cứu<br /> thu hái tại Vườn Quốc gia Tam Đảo được chiết xuất và chiết phân đoạn với các dung môi khác<br /> nhau, trong đó có ethyl acetat. Xác định cấu trúc các chất bằng phương pháp phổ. Kết quả và<br /> kết luận: từ phân đoạn ethyl acetat đã phân lập được 02 hợp chất thuộc nhóm terpenoid đó là:<br /> 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic axít-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat); 16-oxo-3α-hydroxyserrat-<br /> 14-en-21β-ol; các chất đều được khẳng định cấu trúc bằng NMR, MS, HMBC, HSQC.<br /> * Từ khóa: Terpenoid; 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic axít-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat);<br /> 16-oxo-3α-hydroxyserrat-14-en-21β-ol; Thạch tùng răng cưa.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ này được tiến hành nhằm mục tiêu:<br /> Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata Nghiên cứu phân lập hai hợp chất<br /> (Thunb.) Trevis) là một loài thuộc họ terpenoid từ phân đoạn dịch chiết ethyl<br /> Thông đất (Lycopodiaceae), theo kinh acetat góp phần cung cấp thêm những<br /> nghiệm dân gian được dùng để điều trị thông tin về thành phần hóa học của loài<br /> các bệnh như bị tổn thương, nôn ra máu, Thạch tùng răng cưa (Huperzia serrata<br /> đái ra máu, trĩ ra máu… [1, 2]. Cuối thế (Thunb.) Trevis).<br /> kỷ 20, Thạch tùng răng cưa được nghiên<br /> cứu và phân lập ra huperzin A, một alcaloid NGUYÊN LIỆU, DUNG MÔI, THIẾT BỊ<br /> có tác dụng ức chế acetylcholinesterase VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> mạnh, thuận nghịch, có chọn lọc và được 1. Nguyên liệu.<br /> hứa hẹn sẽ là một loại thuốc đầy tiềm Thu hái mẫu nghiên cứu tại Vườn<br /> năng cho điều trị các triệu chứng của Quốc gia Tam Đảo, tỉnh Vĩnh Phúc tháng<br /> bệnh Alzheimer [3]. 12 - 2018 và được TS. Đỗ Văn Hài,<br /> Tại Tam Đảo (Vĩnh Phúc) đã phát hiện Phòng Thực vật học, Viện Sinh thái và<br /> có một số loài thuộc chi Huperzia Bernh., Tài nguyên Sinh vật, Viện Hàn lâm Khoa<br /> trong đó có loài Thạch tùng răng cưa. học và Công nghệ Việt Nam giám định<br /> Ngoài ra, loài này còn phân bố rải rác tại tên khoa học. Tiêu bản mẫu (số hiệu tiêu<br /> các tỉnh trung du và vùng núi cao Tây Bắc, bản: LDM10122018) lưu tại Viện Sinh thái<br /> miền Trung và Tây Nguyên [2]. Nghiên cứu và Tài nguyên Sinh vật.<br /> <br /> 1. Trường Cao đẳng Quân y 1<br /> 2. Học viện Quân y<br /> Người phản hồi (Corresponding): Lê Đình Mạnh (mạnh.le40@gmail.com)<br /> Ngày nhận bài: 08/09/2019; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 08/10/2019<br /> Ngày bài báo được đăng: 10/10/2019<br /> <br /> 3<br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> 2. Dung môi, thiết bị. dung môi n-hexan/EtOAc (thay đổi từ tỷ lệ<br /> - Dung môi: ethanol 96%, nước cất, 15/1 đến 1/1, v/v). Kiểm tra bằng SKLM,<br /> n-hexan, methanol (MeOH), dichloromethan gom các bình có sắc ký đồ giống nhau,<br /> (CH2Cl2), ethyl acetat (EtOAc): đạt tiêu sau đó cất thu hồi dung môi thu được<br /> chuẩn tinh khiết phân tích; aceton, 5 phân đoạn, trong đó phân đoạn HSEII<br /> methanol: đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng thu được 3,6 g.<br /> trong phân tích NMR. Tách các hợp chất trong phân đoạn<br /> - Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân HSEII (3,6 g) dùng phương pháp sắc ký<br /> Bruker Avance A 500 (Đức), máy đo phổ cột silica gel pha thuận, sử dụng hệ dung<br /> khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) môi rửa giải n-hexan/aceton với độ phân<br /> AGILENT 1200 series LC-MSD Ion Trap cực của dung môi tăng dần (từ tỷ lệ 25/1<br /> (Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học đến 0/1, v/v). Kiểm tra bằng SKLM, gom<br /> và Công nghệ Việt Nam). Máy cất quay các ống nghiệm có sắc ký đồ giống nhau,<br /> Rotavapor R-200 (BUCHI), máy hứng mẫu sau đó cất thu hồi dung môi thu được các<br /> tự động Eyela DC-1200 (Nhật) (Học viện phân đoạn HSEII-1 (320 mg), HSEII-2<br /> Quân y). (1,2 g) và HSEII-3 (528 mg). Tiếp tục sắc ký<br /> phân đoạn HSEII-2 (1,2 g) trên cột silica<br /> 3. Phương pháp chiết xuất và phân lập. gel, rửa giải bằng hỗn hợp CH2Cl2/EtOAc<br /> Chiết hồi lưu 300 g bột mẫu nghiên (20/1, v/v) thu được hợp chất HSE-1<br /> cứu với 500 ml ethanol 96% trong thời (11,2 mg). Tiến hành sắc ký phân đoạn<br /> gian 2 giờ (chiết lặp lại 3 lần). Dịch chiết HSEII-3 (528 mg) trên cột MCI gel, rửa<br /> thu được cất thu hồi dung môi thu cắn, giải bằng hệ dung môi MeOH/H2O (9/1,<br /> phân tán cắn thu được trọng lượng tối 10/0), thu được hai phân đoạn HSEII-3-1<br /> thiểu nước cất nóng ở 700C (150 ml). và HSEII-3-2. Tiến hành tinh chế phân<br /> Tiến hành chiết lỏng-lỏng với n-hexan, đoạn HSEII-3-1 trên cột silica gel pha<br /> ethyl acetat. Phân đoạn dịch ethyl acetat thuận, rửa giải với hệ dung môi<br /> cất thu hồi dung môi, sấy tới khối lượng CH2Cl2/MeOH (75/1, v/v) thu được hợp<br /> không đổi (ký hiệu HSE) thu được 9 g. chất HSE-2 (9,8 mg).<br /> Lấy 10 mg cắn HSE hòa tan với 05 ml<br /> methanol để khảo sát bằng sắc ký lớp KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br /> BÀN LUẬN<br /> mỏng (SKLM). Hệ dung môi n-hexan/EtOAc<br /> (3/1) cho kết quả tách tốt nhất. Lựa chọn 1. Kết quả phân lập hai hợp chất.<br /> hệ dung môi n-hexan/EtOAc ở các tỷ lệ từ * Hợp chất HSE-1:<br /> 15/1 đến 5/1 để làm hệ dung môi rửa giải Hợp chất HSE-1 phân lập thu được<br /> trong sắc ký cột. dưới dạng bột màu trắng. Công thức<br /> Phân đoạn cắn ethyl acetat (HSE) phân tử: C39H54O7. Khối lượng phân tử:<br /> chạy sắc ký cột theo phương pháp nạp 634,2. Số liệu phổ NMR của hợp chất<br /> cột ướt. Quá trình rửa giải sử dụng hệ HSE-1 được trình bày ở bảng 1.<br /> <br /> 4<br />  T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> Bảng 1: Số liệu phổ NMR của hợp chất HSE-1 và hợp chất tham chiếu.<br /> a a<br /> b,≠ b δH b,≠ b δH<br /> C δC δC C δC δC<br /> (độ bội, J = Hz) (độ bội, J = Hz)<br /> 1 39,4 39,31 1,11, m; 1,92, m 21 70,2 70,11 4,61, br s<br /> 2 27,1 27,00 1,99, m; 2,20, m 22 44,0 43,89<br /> 3 80,1 80,01 5,11, dd (12,0, 4,0) 23 23,5 23,39 1,61, s<br /> 4 49,0 48,86 24 177,5 178,0<br /> 5 57,1 57,01 1,20, m 25 14,6 14,47 1,15, s<br /> 6 21,6 21,51 1,99, m; 2,15, m 26 20,3 20,18 0,91, s<br /> 7 45,9 45,81 1,25, m; 1,45, m 27 57,1 57,01 1,87, m; 2,33, m<br /> 8 37,8 37,69 28 14,6 14,47 0,87, s<br /> 9 63,1 62,99 0,85, m 29 65,6 65,41 3,99, d (10,8)<br /> 10 39,6 39,51 4,22, d (10,8)<br /> 11 27,1 27,00 1,15, m; 1,85, m 30 23,5 23,39 1,60, s<br /> 12 28,2 28,07 1,94, m; 2,01, m 1’ 168,2 168,1<br /> 13 58,0 57,87 2,10, m 2’ 116,4 116,28 6,77, d (16,0)<br /> 14 139,3 139,22 3’ 145,7 145,6 8,12, d (16,0)<br /> 15 124,5 124,12 5,51, br s 4’ 126,7 126,6<br /> 16 28,5 28,07 2,14, m; 2,25, m 5’ 131,2 131,05 7,56, d (8,4)<br /> 17 45,3 45,12 2,40, m 6’ 117,3 117,15 7,16, d (8,4)<br /> 18 36,9 36,74 1,85, m; 2,11, m 7’ 161,9 161,76<br /> 19 32,3 32,20 1,70, m; 2,05, m 8’ 117,3 117,15 7,16, d (8,4)<br /> 20 25,0 24,84 1,85, m; 2,11, m 9’ 131,2 131,05 7,56, d (8,4)<br /> <br /> (a: 1H NMR đo trong pyridine-d5; b: 13C NMR đo trong pyridine-d5; ±: Chất tham chiếu)<br /> * Hợp chất HSE-2:<br /> Phân lập hợp chất HSE-2 thu được dưới dạng bột màu trắng. Công thức phân tử:<br /> C30H48O3. Khối lượng phân tử: 457,2. Số liệu phổ NMR của hợp chất HSE-2 được trình<br /> bày ở bảng 2.<br /> Bảng 2: Số liệu phổ NMR của hợp chất HSE-2 và hợp chất tham chiếu.<br /> a a<br /> b,≠ b δH b,≠ b δH<br /> C δC δC C δC δC<br /> (độ bội, J = Hz) (độ bội, J = Hz)<br /> 1 33,8 33,8 16 201,3 201,85<br /> 2 26,7 26,5 17 59,0 58,7 3,05 (1H, s)<br /> 3 75,9 76,3 18 44,7 44,3<br /> 4 38,6 36,7 19 32,0 31,4<br /> <br /> <br /> 5<br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> 5 49,4 50,4 20 25,9 22,9<br /> 6 19,1 18,5 21 75,0 78,3<br /> 7 45,3 44,7 22 37,6 36,8<br /> 8 38,2 38,2 23 29,3 27,9 1,24 (3H, s)<br /> 9 62,5 62,4 24 22,6 21,7<br /> 10 38,2 38,0 25 16,0 14,8 0,83 (3H, s)<br /> 11 25,2 24,9 26 20,1 20,0 0,91 (3H, s)<br /> 12 26,7 26,4 27 56,1 55,8<br /> 13 59,5 58,5 28 15,2 15,3 1,06 (3H, s)<br /> 14 163,6 164,05 29 22,2 22,4 1,39 (3H, s)<br /> 15 128,9 129,48 5,97 (1H, s) 30 29,1 28,0 1,72 (3H, s)<br /> <br /> (a: 1H NMR đo trong pyridine-d5; b: 13<br /> C NMR đo trong pyridine-d5; ±: Chất tham chiếu)<br /> <br /> 2. Kết quả nhận dạng hai hợp chất. (δ 168,2), C-2’ (δ 116,4), C-3’ (δ 145,7),<br /> * Hợp chất HSE-1: C-4’ (δ 131,6), C-5’ (δ 126,7), C-6’ (δ 117,3),<br /> C-7’ (δ 161,9, s), C-8’ (δ 117,3) và C-9’<br /> Công thức phân tử hợp chất HSE-1<br /> (δ 126,7).<br /> được xác định là C39H54O7. Dựa trên phổ<br /> khối lượng ESI-MS xuất hiện của píc ion So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp<br /> giả phân tử ở m/z 635,1 [M+H]+. chất HSE-1 với hợp chất axít lycernuic A<br /> [4, 5] thấy có tương đồng, ngoại trừ khác<br /> Trên phổ 1H NMR của HSE-1 xuất hiện<br /> nhau tại vị trí C-3. Hợp chất axít lycernuic<br /> tín hiệu proton của 5 gốc methyl tại δH<br /> 0,87 (3H, s), 0,91 (3H, s), 1,15 (3H, s), A ở vị trí C-3 được thế bởi nhóm -OH,<br /> 1,60 (3H, s) và 1,61 (3H, s); 2 gốc methin còn hợp chất HSE-1 được thế bởi gốc<br /> oxy hóa tại δH 4,61 (s) và 5,11 (dd, J = 12,0 para-hydroxycinnamat.<br /> và 4,0 Hz); 3 olefinic proton tại δH 8,11 Để khẳng định chính xác cấu trúc hóa<br /> (1H, d, J = 16 Hz), 6,77 (1H, d, J = 16 Hz) học của hợp chất HSE-1, chúng tôi tiến<br /> và 5,51 (1H, brs); 4 proton thơm thế ở vị hành phân tích phổ 2D-NMR (HSQC và<br /> trí para tại δH 7,55 (2H, d, J = 8,4 Hz), HMBC). Kết quả phân tích phổ 2 chiều<br /> 7,15 (2H, d, J = 8,4 Hz, H-6' và H-8'). HSQC cho phép gắn các tín hiệu proton<br /> Trên phổ 13C NMR của HSE-1 cho với tín hiệu carbon tương ứng. Vị trí của<br /> thấy tín hiệu của 39 carbon xuất hiện, gốc para-hydroxycinnamat tại C-3 được<br /> trong đó 5 tín hiệu carbon của nhóm methyl; khẳng định dựa vào tương tác giữa<br /> 10 tín hiệu carbon của gốc methylen; 5 tín proton δH 5,11 (H-3α) với tín hiệu carbon<br /> hiệu carbon của gốc methin; 6 tín hiệu δC 168,2 (C-1’) trên phổ HMBC.<br /> của carbon bậc bốn; 2 tín hiệu của nhóm Ngoài ra, cũng quan sát thấy tương<br /> -CH-O-; một tín hiệu carbon của nhóm - tác HMBC giữa δH [3,99, d (10,8) 4,22,<br /> CH2OH; một tín hiệu carbon của nhóm d (10,8); H-29] với δC 70,2 (C-21) cho<br /> carbonyl; cùng với 9 tín hiệu carbon của phép khẳng định nhóm -CH2OH nối với<br /> gốc para-hydroxycinnamoyl tại δC C-1’ vị trí C-22.<br /> <br /> 6<br />  T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> So sánh dữ liệu phổ của hợp chất HSE-1 Phổ 13C NMR của HSE-2 cho thấy 30<br /> với 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-en-24- carbon xuất hiện, trong đó một tín hiệu<br /> oic axít-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat) [6] của keton carbon tại δC 201,9 (C-16);<br /> thấy hoàn toàn phù hợp tại các vị trí 2 tín hiệu olefinic carbon tại δC 164,1 (C-14)<br /> tương ứng. Từ đó có thể khẳng định HSE-1 và 129,5 (C-15); 2 tín hiệu của oxy methyl<br /> chính là 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14- carbon tại δC 76,3 (C-3) và 78,3 (C-21).<br /> en-24-oic axít-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat),<br /> So sánh dữ liệu phổ NMR của hợp<br /> có công thức phân tử C39H54O7 (khối lượng<br /> chất HSE-2 với hợp chất 16-oxo-3α-<br /> phân tử = 634,2) và có cấu trúc như ở<br /> hình 1. hydroxyserrat-14-en-21β-ol [7] cho thấy<br /> có sự tương tự tại các vị trí tương ứng<br /> Từ dữ liệu thu được của hợp chất<br /> (bảng 2).<br /> HSE-1, kết hợp với đối chiếu tài liệu tham<br /> khảo, xác định hợp chất này đã được Cấu trúc hóa học của hợp chất HSE-2<br /> phân lập từ cây Thông đất (Lycopodiella được khẳng định dựa trên kết quả phân<br /> cernua (L.) Pie.-Serm) [6]. tích phổ hai chiều HMBC. Trên phổ<br /> * Hợp chất HSE-2: HMBC quan sát thấy tương tác giữa<br /> proton δH 3,05 (H-17) với tín hiệu carbon<br /> Công thức phân tử hợp chất HSE-2<br /> δC 201,85 (C-16).<br /> được xác định là C30H48O3. Dựa trên phổ<br /> khối lượng ESI-MS xuất hiện của píc ion Do đó, HSE-2 được xác định có công<br /> phân tử ở m/z 457,2 [M]+. thức phân tử C30H48O3, với tên 16-oxo-3α-<br /> hydroxyserrat-14-en-21β-ol (khối lượng phân<br /> Trên phổ 1H NMR của hợp chất HSE-2<br /> tử = 457,2) và có cấu trúc như ở hình 1.<br /> xuất hiện tín hiệu của một olefinic proton<br /> tại δH 5,97 (1H, s, H-15); một tín hiệu Từ dữ liệu thu được của hợp chất<br /> proton tại δH 3,05 (1H, s, H-17); 7 tín hiệu HSE-2, kết hợp với đối chiếu tài liệu tham<br /> proton của gốc methyl tại δH 0,74 (3H, s), khảo, Hui Zhou và CS đã xác định hợp<br /> 0,83 (3H, s), 0,91 (3H, s), 1,06 (3H,s), chất này phân lập được từ loài Thạch<br /> 1,24 (3H, s), 1,39 (3H, s), 1,72 (3H, s). tùng răng cưa [7].<br /> <br /> <br /> 21 OH<br /> 12 H H CH2OH<br /> 25 26<br /> 30<br /> 1 28<br /> 9 14<br /> 16<br /> O 15<br /> 3' 1' 3 H<br /> 4' 4<br /> O 7<br /> (a) (b)<br /> 7'<br /> 2' 24 H 6<br /> <br /> HOOC 23<br /> HO<br /> <br /> Hình 1: Cấu trúc hóa học của hai hợp chất HSE-1 (a) và HSE-2 (b).<br /> <br /> 7<br /> T¹p chÝ y - d−îc häc qu©n sù sè 8-2019<br /> <br /> KẾT LUẬN 2. Phạm Hoàng Hộ. Cây cỏ Việt Nam. Nhà<br /> Xuất bản Trẻ. 1999, tập I, tr.22-26.<br /> Nghiên cứu đã phân lập được hai hợp<br /> 3. Ma X, Tan C, Zhu D et al. Huperzine A<br /> chất terpenoid từ phân đoạn chiết EtOAc<br /> của cây Thạch tùng răng cưa (Huperzia from Huperzia species - An ethnopharmacology<br /> serrata (Thunb.) Trevis) dựa vào các review. J. Ethnopharmacol. 2007, 113, pp.15-34.<br /> phương pháp sắc ký cột, SKLM. Nhận 4. Zhang Z, Elsohly H.N, Jacob M.R et al.<br /> dạng cấu trúc hóa học của hai hợp chất Natural products inhibiting Candida albicans<br /> phân lập dựa vào kết quả đo các loại phổ: secreted aspartic proteases from Lycopodium<br /> MS, 1H NMR, 13C NMR, HMBC và HSQC, cernuum. J Nat Prod. 2002, 65, p.979.<br /> kết hợp so sánh với dữ liệu đã công bố 5. Tsuda Y, Isobe K, Sano T. Triterpenoid<br /> về phổ của hai hợp chất này. Hai hợp chemistry. IX. Lycopodium triterpenoid. (6).<br /> chất phân lập được có tên là 3β, 21β,<br /> The structures of three new tetra-ols, lycocryptol,<br /> 29-trihydroxyserrat-14-en-24-oic axit-3β-yl-<br /> 21-epilycocryptol, and diepilycocryptol, and<br /> (7’-hydroxycinnamat) và 16-oxo-3α-<br /> two tew acids, lycernuic acid-A and -B. Chem<br /> hydroxyserrat-14-en-21β-ol. Trong đó,<br /> Pharm Bull. 1975, 23, pp.264-271.<br /> hợp chất 3β, 21β, 29-trihydroxyserrat-14-<br /> en-24-oic axít-3β-yl-(7’-hydroxycinnamat) 6. Nguyen V.T, To D.C, Tran M.H et al.<br /> lần đầu tiên được phân lập từ Thạch tùng Isolation of cholinesterase and β-secretase 1<br /> răng cưa. inhibiting compounds from Lycopodiella cernua,<br /> Bioorg Med Chem. 2015, 23, pp.3126-3134.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO 7. Zhou H, Tan C.H, Jiang S et al.<br /> 1. Võ Văn Chi. Từ điển cây thuốc Việt Nam. Serratene-type triterpenoids from Huperzia serrata.<br /> Nhà Xuất bản Y học. Hà Nội. 1997, tr.1119. J Nat Prod. 2003, 66 (10), pp.1328-1332.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 8<br />