Phân lập và thiết lập chất chuẩn afzelin từ dược liệu

Chia sẻ: Hạnh Thơm | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

68
lượt xem 4
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Afzelin là một flavonoid chính có trong nhiều dược liệu như đạm trúc diệp, tầm gửi, rau cần. Hiện nay, để xây dựng tiêu chuẩn cho các dược liệu này cần phải có chuẩn afzelin. Tuy nhiên, chuẩn afzelin vẫn chưa có sẵn ở Việt Nam mà phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá rất cao và thời gian đặt hàng kéo dài. Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là chiết xuất, phân lập và thiết lập chất chuẩn afzelin từ dược liệu.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phân lập và thiết lập chất chuẩn afzelin từ dược liệu

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học PHÂN LẬP VÀ THIẾT LẬP CHẤT CHUẨN AFZELIN TỪ DƢỢC LIỆU Võ Thanh Hóa*, Nguyễn Minh Đức**. TÓM TẮT Mở đầu – mục tiêu: Afzelin là một flavonoid chính có trong nhiều dược liệu như Đạm trúc diệp, Tầm gửi, Rau cần< Hiện nay, để xây dựng tiêu chuẩn cho c{c dược liệu này cần phải có chuẩn afzelin. Tuy nhiên, chuẩn afzelin vẫn chưa có sẵn ở Việt Nam mà phải nhập khẩu từ nước ngoài với giá rất cao và thời gian đặt hàng kéo dài. Vì vậy, mục đích của nghiên cứu này là chiết xuất, phân lập và thiết lập chất chuẩn afzelin từ dược liệu. Phương ph{p nghiên cứu: Sàng lọc dược liệu có chứa afzelin bằng HPLC-MS. Lựa chọn dược liệu. Chiết cao chiết toàn phần và tách c{c ph}n đoạn đơn giản bằng chiết phân bố giữ nước v| c{c dung môi có độ phân cực khác nhau. Phân lập afzelin bằng sắc ký cột cổ điển và sắc ký cột pha đảo. Cấu trúc afzelin phân lập được x{c định bằng phổ UV, IR, MS và NMR. Thẩm định và thiết lập chất chuẩn afzelin. Kết quả: Nghiên cứu đã s|ng lọc được c{c dược liệu có chứa afzelin: Cần nước, Tầm gửi, Đạm túc diệp, lá Bơ v| Sầu đ}u. Lựa chọn l{ Bơ l|m nguyên liệu phân lập afzelin. Từ 15 kg l{ Bơ khô ph}n lập được 1,2 g afzelin từ l{ Bơ Folia Perseae v| đã tiến h|nh đóng 100 lọ (10 mg/ lọ) với số lô AFZ-001-0914 với độ tinh khiết 94,31% tính theo nguyên trạng. Thết lập afzelin đạt tiêu chuẩn chất chuẩn gốc theo ISO Guide 35. Kết luận: Quy trình khảo sát sàng lọc dược liệu và phân lập afzelin đơn giản, hiệu quả. Afzelin phân lập được thiết lập thành chất chuẩn theo tiêu chí chuẩn gốc. Có thể sẵn s|ng để ứng dụng vào công tác nghiệm dược liệu. Từ khóa: Folia Perseae, afzelin, thiết lập chất chuẩn ABSTRACT ISOLATION AND ESTABLISHMENT OF REFERENCE STANDARD AFZELIN FROM HERBAL MEDICINES Vo Thanh Hoa, Nguyen Minh Duc * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 1- 2018: 307 - 314 Introduction - objectives: Afzelin is used as a marker for the quality control of some herbal medicine. However, afzelin standard has not been available in Vietnam and it took a high cost and long time for ordering from foreign countries. So the aim of this study was to develop a protocol to isolate and establish afzelin as reference standard. Methods: Herbal medicines containing afzelin were selected by sreening on HPLC-MS method. Ethanolic extract of herbal medicine was subjected to liquid-liquid distribution based on the solubility of compounds. Isolations were carried out by common and popular phytochemical methods. Structures of isolated compounds were deduced by means of UV, IR, MS and NMR spectroscopy. Quantitative analysis was validated and isolated afzelin was established as reference standard. Results: Five herbal medicines containing afzelin were invesgated such as Mistletoe (Loranthus chinensis), Avocado (Persea americana) leaves, Water dropwort (Oenanthe stolinefera), China tree (Azadirachta indica) and * Khoa Y học cổ truyền, Đại học Y DƣợcThành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: ThS. Võ Thanh Hóa ĐT: 0986414064 Chuyên Đề Dƣợc ** Khoa Dƣợc, Đại học Tôn Đức Thắng Email: hoavo0808@ump.edu.vn 307 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Cow grass (Lophatherum gracile). Avocado leaves were selected to isolate afzelin. 1,2 g of afzelin was isolated from avocado leaves and packed into 100 vials (10 mg/ vial) with batch number: AFZ-001-0914 and a content of 94,31%. Isolated afzelin was established as reference standard based on ISO Guide 35. Conclusions: The methods of invesgation and isolation were simple, effective. Isolated afzelin was established as primary standard. It could be used for controlling the quality of some herbal medicines. Keywords: Folia Perseae, afzelin, establishment of reference standard. ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, Việt Nam đang sử dụng rất nhiều dƣợc liệu để bảo vệ, chăm sóc sức khỏe ngƣời dân. Tuy nhiên, nhiều trong số c{c dƣợc liệu này nhƣ Tang ký sinh, Đạm trúc diệp... chƣa có hoặc có tiêu chuẩn nhƣng chƣa có tiêu chuẩn về hàm lƣợng. Điều n|y g}y khó khăn cho công t{c đảm bào chất lƣợng dƣợc liệu. Vì vậy, điều cần thiết là phải xây dựng tiêu chuẩn đầy đủ cho c{c dƣợc liệu này. Tuy nhiên, các chất điểm chỉ chính có trong c{c dƣợc liệu n|y nhƣ afzelin lại không có trên thị trƣờng Việt Nam, nếu mua từ nƣớc ngoài lại mất thời gian và giá thành cao, đôi khi không có. Do đó, đề t|i đƣợc thực hiện nhằm phân lập và thiết lập chất chuẩn gốc afzelin theo hƣớng dẫn của ISO Guide 35 để phục vụ cho công tác kiểm nghiệm dƣợc liệu. Điều kiện khai triển: Cột: Agilent C18, 250 x 4,6 mm, 5 µm; Nhiệt độ cột: 30 oC; Đầu dò: UV 265 nm; MS 6120, kỹ thuật ESI, bắn phá ion âm, dạng ion phân tử thu đƣợc [M-H]-; Thể tích tiêm mẫu: 20 µl; Pha động:Acetonitril (A) – Nƣớc (B), rửa giải gradient; Tốc độ dòng: 1,5 ml/ phút; Thời gian phân tích: 20 phút; Ghi nhận các ion phân tử của các chất trong khoảng: 300 – 500 m/ z. So sánh phổ MS của các chất ghi nhận đƣợc với phổ MS chuẩn của afzelin trong thƣ viện phổ. Xác định mẫu dƣợc liệu có chứa afzelin. Lựa chọn dược liệu phân lập afzelin Tiêu chí chọn dƣợc liệu: Dƣợc liệu có chứa afzelin; nguồn cung cấp dƣợc liệu dồi dào; dễ thu hái và xử lý mẫu; ngoài afzelin, ít chứa các polyphenol khác. Phân lập afzelin ĐỐI TƢỢNG-PHƢƠNGPH[P NGHIÊNCỨU Chiết xuất Đối tƣợng nghiên cứu Dƣợc liệu đƣợc chọn đƣợc chiết bằng phƣơng ph{p ngấm kiệt với dung môi cồn 70%, dịch chiết đƣợc cô thu hồi dung môi thu đƣợc cao cồn 70%. Dƣợc liệu Đạm trúc diệp đƣợc cung cấp bởi nhà thuốc T}n Nam Xƣơng, Quận 8, TP HCM; lá Bơ v| Tầm gửi thu hái tại Buôn Hồ, Đắk Lắk; Cần nƣớc thu hái tại Hoóc Môn, TP HCM; lá Sầu đ}u thu h{i tại Rạch giá, Kiên Giang. Phƣơng ph{p nghiên cứu Khảo s{t dược liệu chứa afzelin Cao cồn đƣợc ph}n t{n v|o nƣớc, tiến hành lắc phân bố lần lƣợt với ether dầu hỏa (60-90 oC) v| ethyl acetat. Thu ph}n đoạn ethyl acetat, cô thu hồi dung môi đƣợc cao EA. Xử lý mẫu bằng SPE Phân lập bằng sắc ký cột Bột dƣợc liệu (1 g) đƣợc chiết siêu âm trong 30 phút với 30 ml MeOH (2 lần). Lọc dịch chiết, cô đến cắn. Hòa cắn với 3 ml nƣớc cất x 2 lần. Tiến hành nạp mẫu và khai triển cột SPE (C18E 500 mg, 6 ml, 55 µm (Phenomenex) với vệ dung môi methanol – nƣớc, tỷ lệ methanol tăng dần. Kiểm tra ph}n đoạn bằng HPLC-MS để phát hiện sự có mặt của afzelin. C{c cao ph}n đoạn đƣợc phân lập các chất bằng phƣơng ph{p sắc ký cột cổ điển, sử dụng silica gel pha thuận cỡ hạt 40 – 63 µm (Merck); hệ dung môi đã khảo sát bằng phƣơng ph{p sắc ký lớp mỏng (SKLM). Tiến hành khai triển sắc ký cột v| theo dõi c{c ph}n đoạn bằng SKLM. Dựa vào kết quả SKLM để gom ph}n đoạn. 308 Sắc ký HPLC điều chế Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Hệ thống sắc ký Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu LC – 8A, đầu dò UV (Nhật). Cột: Discovery HS C18 (250 × 21,2 mm, 10 µm). Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng. Tốc độ dòng: 10 ml/phút. Thể tích bơm: 10 ml. Phát hiện: UV 265 nm. Pha động: methanol – nƣớc (45 : 55). Dung môi pha mẫu: Pha động. Nồng độ mẫu: 60 mg/ml. Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất phân lập bằng HPLC Điều kiện phân tích: Cột: C18, 250 x 4,6 mm, 5 µm. Pha động: acetonitril (A) – nƣớc (B), rửa giải gradient: 0 phút 25% A, 30 phút 30% A, 31 – 35 phút: 25% A. Tốc độ dòng: 0,75 ml/ phút. Đầu dò: PDA. Bƣớc sóng phát hiện: 265 nm. Thời gian phân tích: 25 phút. Thể tích tiêm mẫu: 10 µl. X{c định cấu trúc của hợp chất phân lập được Tiến h|nh x{c định cấu trúc của hợp chất phân lập đƣợc bằng c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm UV, MS, IR và NMR. Thiết lập chất chuẩn afzelin theo ISO Guide(2-4) Độ ẩm Đo bằng phƣơng (Thermogravimetric Analysis). ph{p TGA Định tính v| x{c định cấu trúc X{c định cấu trúc bằng c{c phƣơng ph{p phổ UV - Vis, IR, NMR và MS. Tạp chất liên quan Tiến hành kiểm tra bằng HPLC với quy trình đã thẩm định. Điều kiện sắc ký: Cột: Phenomenex C18 (250x4,6 mm,5 µm); Pha động: acetonitril – nƣớc (30:70); Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút; Detector: UV 265 nm; Nhiệt độ: Nhiệt độ phòng; Thể tích bơm: 10 µl; Dung môi pha mẫu: Pha động; Nồng độ mẫu: 300 ppm/ ml. Tiến hành phân tích với thời gian sắc ký gấp đôi thời gian lƣu của pic chính trong sắc ký đồ thu đƣợc từ dung dịch thử. X{c định tạp chất liên quan dựa trên tổng tạp, loại những pic có Chuyên Đề Dƣợc Nghiên cứu Y học chiều cao nhỏ hơn ba lần độ nhiễu đƣờng nền và các pic có trong mẫu trắng. Yêu cầu Tổng h|m lƣợng tạp chất có trong mẫu tính theo phần trăm diện tích pic nhỏ hơn 2%. Định lượng chất chuẩn afzelin Định lƣợng afzelin theo phƣơng ph{p quy về 100% diện tích pic. Thẩm định quy trình định lƣợng theo hƣớng dẫn của ICH (The International Conference on Harmonisation of Technical Requirement for Registration of Pharmaceuticals for Human Use), bao gồm các chỉ tiêu: Tính tƣơng thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ lặp lại. Đóng gói v| đ{nh gi{ đồng nhất lô trong quá trình đóng gói Afzelin đƣợc đóng th|nh 100 lọ nhỏ (10 mg/lọ), sử dụng lọ thủy tinh nâu và hàn kín có lớp đệm. Đóng lọ trong Glove-Box, nạp khí nitơ 99,99%, độ ẩm trong buồng xấp xỉ 10%. Lấy ngẫu nhiên 11 lọ (g = +1) để đ{nh gi{ đồng nhất lô trong qu{ trình đóng gói, mỗi lọ kiểm tra 2 lần. Đ{nh gi{ kết quả theo ISO Guide 35. Đ{nh gi{ chất chuẩn thông qua liên phòng thí nghiệm Afzelin sau khi đƣợc đóng gói v| đánh giá đồng nhất lô đạt yêu cầu đƣợc lấy ngẫu nhiên và tiến h|nh định lƣợng tại hai phòng thí nghiệm độc lập đạt GLP, trong đó có ít nhất một phòng thí nghiệm có đủ thẩm quyền v| có ý nghĩa ph{p lý đối với Việt Nam. Mỗi phòng thí nghiệm định lƣợng 6 lọ. Tính thống kê kết quả từ 2 phòng thí nghiệm theo Anova (n = 12). Nếu Ftn ≤ Ftc, kết quả trung bình của 2 phòng thí nghiệm khác nhau không có ý nghĩa, phƣơng ph{p ph}n tích có độ lặp cao, h|m lƣợng chất chuẩn không phụ thuộc vào phòng thí nghiệm tham gia đ{nh giá. Hai phòng thí nghiệm đạt GLP tham gia thẩm định chất chuẩn afzelin: 309 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Khoa Thiết lập chất chuẩn và chất đối chiếu, Viện kiểm nghiệm thuốc TP HCM(PTN1). Khoa Kiểm nghiệm mỹ phẩm, Viện Kiểm nghiệm thuốc TP HCM (PTN2). X{c định giá trị ấn định, độ không đảm bảo đo v| gi{ trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm Tiến h|nh x{c định giá trị công bố trên phiếu kiểm nghiệm khi kết quả đ{nh gi{ liên phòng thí nghiệm đạt yêu cầu (Ftn≤ Ftc). Gía trị ấn định x*(n) để đ{nh gi{ từng kết quả phân tích theo test-z, loại bỏ các kết quả tính có ; chọn các giá trị , tính giá trị trung bình. KẾT QUẢ Phân lập afzelin Xử lý mẫu bằng SPE Mẫu: 200 mg bột dƣợc liệu. Xử lý mẫu và khai triển cột SPE theo quy trình. Thu phân đoạn methanol 50%. Kiểm tra sự có mặt afzelin trong c{c ph}n đoạn n|y đƣợc phân tích bằng HPLC-MS. Kết quả: X{c định mẫu dƣợc liệu l{ Bơ, Tầm gửi, Đạm trúc diệp, Cần nƣớc, Sầu đ}u có chứa afzelin. Lựa chọn dược liệu phân lập afzelin Từ tiêu chí chọn dƣợc liệu, chọn l{ Bơ l|m nguyên liệu phân lập afzelin. Chiết xuất Từ 15 kg l{ Bơ khô, chiết ngấm kiệt đƣợc 1,2 kg cao cồn 70%. Từ 1,2 kg cao cồn 70% phân tán v|o nƣớc, tiến hành lắc phân bố lần lƣợt với ether dầu hỏa (60-90 oC) và ethyl acetat. Thu ph}n đoạn ethyl acetat, cô thu hồi dung môi đƣợc 200 g cao EA. Phân lập bằng sắc ký cột Sắc ký cột silica gel: Từ 80 g cao EA, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ether dầu hỏa – ethyl acetat, tăng dần tỷ lệ ethyl acetat với c{c ph}n đoạn. Thu đƣợc 4 ph}n đoạn, trong đó có ph}n đoạn 2 tƣơng ứng với hệ dung môi ether dầu hỏa – ethyl acetat (25 : 75) có 3 vết chính trên SKLM. Cô thu hồi dung môi phân đoạn 2 đƣợc 5,3 g cao PĐ 2. Phân lập bằng PLC điều chế Tiến hành phân lập các chất trong PĐ 2 bằng HPLC điều chế. Thu lấy chất tƣơng ứng với đỉnh ở thời gian lƣu l| 32 phút. Cô thu hồi dung môi đƣợc hợp chất tƣơng ứng là PA. Tiến h|nh điều chế với 5 g PĐ 2. Thu đƣợc 1,2 g hợp chất PA. Hợp chất PA cho một pic tại thời gian lƣu tR = 18,5 phút trên sắc ký đồ ở bƣớc sóng 265 nm. Và trên sắc ký đồ 3D, hợp chất PA gần nhƣ không xuất hiện các pic khác ở c{c bƣớc sóng khác. X{c định cấu trúc của PA Tiến h|nh đo phổ UV, MS, IR và NMR, dựa v|o c{c phƣơng ph{p phổ nghiệm x{c định đƣợc PA là afzelin. Kiểm tra độ tinh khiết hợp chất PA bằng HPLC phân tích Hình 1: Sắc ký đồ HPLC kiểm tra độ tinh khiết của hợp chất PA 310 Chuyên Đề Dƣợc Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Phổ IR Hình 2: Phổ IR của hợp chất PA Phổ IR của hợp chất PA đƣợc trình bày ở Hình 2. Phổ UV – Vis của hợp chất PA có đỉnh hấp thu đặc trƣng ở 265 nm và 345 nm (Hình 3). Phổ IR (KBr) của hợp chất PA có νmax: 1656; 1608; 1500; 1452; 1364; 1296; 1176; 1061; 833 cm-1. Phù hợp với phổ của afzelin. Phổ MS Phổ IR của hợp chất PA đƣợc trình bày ở Hình 4. Phổ ESI/MS của hợp chất PA cho pic ion m/ z = 455 [M + Na]+. Phù hợp với công thức phân tử C21H20O10, Δ = 12. Phổ NMR Hình 3: Phổ UV của hợp chất PA Chuyên Đề Dƣợc Dữ liệu phổ 13C-NMR và 1H-NMR của PA điều chế hoàn toàn phù hợp với dữ liệu phổ 13CNMR và 1H-NMR của afzelin theo tài liệu tham khảo (TLTK) số 1 (Bảng 1) 311