Phân tích vi sinh

Ố

Ặ

Ấ

Ể

I. Đ C ĐI M N M MEN, N M M C

1 N m ấ men

ấ ệ I.1 Khái ni m n m men

ậ ườ ể ọ Là sinh v t đi n hình cho nhóm nhân th t, tên g i thông th

ậ ấ ư ặ ạ ị

ộ ủ ng c a m t ể ố ấ nhóm n m có v trí phân lo i không th ng nh t nh ng có chung các đ c đi m sau đây:

- Có t n t

ồ ạ ạ ơ i tr ng thái đ n bào

- Đa s sinh sôi n y n theo l

ả ố ở ố ả ứ ồ i n y ch i, cũng có khi là hình th c phân c t t ắ ế

bào.

I.2 Hình thái, c u t o và kích th

ấ ạ ướ ấ c n m men

- M t t

ộ ế ả ấ ườ ấ ầ ớ bào n m men dài kho ng 5 – 7 µm th ng l n g p 10 l n so v i t ớ ế

bào vi khu nẩ

- Hình d ng n m men th

ấ ạ ộ ố ạ ụ ặ ầ

ộ ố ứ

ụ ề ơ ổ

ầ ườ ng là hình c u ho c hình b u d c, m t s lo i có ớ ư ạ hình que và m t s hình d ng khác nh : hình tr ng, hình ovan, hình mũ ph t, hình m n c m, hình sao th , hình cái li m, hình thuôn, hình thoi, hình tam giác...

ấ Saccharomyces cerevisiae Hình 1.1 N m men

ậ

ủ ế ầ ế ố ầ bào khá ph c t p, g n gi ng t ấ ế ế bào ch t, t ự bào th c v t bao ể ấ bào ch t, ty th ,

ấ ạ ế ấ ứ ạ - N m men có c u t o t ấ ạ ồ bào, màng t g m đ y đ các c u t o thành t ạ ự ữ ryboxom, nhân, không bào và các h t d tr .

ấ ớ

ở bào: c u t o b i hai l p phân t ầ ế

ử ồ i là protein, lipid và glucozamin. Trên thành t ấ ề ỗ ượ ẩ ợ g m 90% là h p ch t glucan và bào có ủ ả c h p thu và các s n ph m c a quá ng đ

ấ ạ ạ ấ , qua đó ch t dinh d ấ ượ ổ ế + Thành t mannan, ph n còn l nhi u l trình trao đ i ch t đ ưỡ ả c th i ra.

ấ ấ ạ ươ ự ng t

ấ ủ ấ ủ ả ế

ớ ủ ế ấ ủ ấ ấ ư ế ẩ ơ bào ch t c a vi khu n, đ nh t c a t bào ch t cao h n n ư nh màng ự ươ ng t c là 800

+ Màng nguyên sinh ch t: dày kho ng 8 nm có c u t o t ẩ nguyên sinh ch t c a vi khu n. T bào ch t c a n m men cũng t ướ ộ nh t l n.ầ

ấ ị

ề ấ

ể ứ + Nhân: là nhân đi n hình, có màng nhân, bên trong là ch t d ch nhân có ch a ạ ế ạ h ch nhân. Nhân t bào n m men ngoài AND còn có protein và nhi u lo i men.

ể ủ ế ượ

ơ ớ ụ ượ bào. Có hình b u d c đ ỏ

ứ ả ạ ầ ạ ố ượ ng và gi

ở ề ặ ủ c bao ng c a t + Ty th : là c quan sinh năng l ầ ấ ọ b c b i hai l p màng, màng trong g p khúc đính vô s các h t nh hình c u trên b m t, các h t này có ch c năng sinh năng l i phóng năng ượ l ể ng c a ty th .

ằ ế ấ ằ ạ + Riboxom có hai lo i: 80S n m trong t ể bào ch t và 70S n m trong ti th .

ề ấ ử ử ả : nhi u n m men có kh năng hình thành bào t ứ ộ , đó là m t hình th c

+ Bào t ả ủ ấ sinh s n c a n m men.

I.3 Sinh s n

ả ở ấ n m men

ả ứ Có 3 hình th c sinh s n:

ưỡ ứ ể ả ả ấ ồ ả - Sinh s n sinh d

ế ồ ch i và hình thành vách ngăn ngang phân đôi t ơ ả ng: là hình th c sinh s n đ n gi n nh t. G m ki u n y bào.

ồ ừ ộ ự ủ ế m t c c c a t ả ệ ề bào m trong đi u ki n thu n l bào con chui ra kh i t

ồ ầ ệ

ồ ấ ẹ ể ạ ẹ ặ bào m đ l

ạ ế ụ ả ớ ế ể ậ ợ ẹ ứ ả i + Hình th c n y ch i: t ỏ ế ộ ế ồ ấ n m men hình thành ch i và n y ch i thành m t t ẹ ế ế ữ bào. T bào con bào m , sau đó ch i d n phình to xu t hi n ngăn gi a hai t ế ẹ ế ể bào m và t có th tách kh i t bào con ho c có ồ th dính v i t i s o trên t i ti p t c n y ch i. ỏ ế ẹ bào m và l

ở ữ

ắ ở ế ầ ươ ỗ ế bào ra làm hai ph n t ng đ ọ gi a m c bào con

ế ứ bào dãn ra, + Hình th c phân c t ( chi Schizosaccharomyces): t ươ ra vách ngăn chia t ng nhau, m i t ộ ẽ s có m t nhân.

- Sinh s n đ n tính: là hình th c sinh s n b ng bào t

ứ ả ằ ả ơ ử ạ ử . Có hai lo i bào t :

ử ộ túi: là bào t

ươ ứ ử

ế , đôi khi đ n 12 bào t ả ủ ấ ng ch a t ụ ứ ừ ộ ỏ ọ ử hình thành trong m t túi nh g i là nang. Trong nang + Bào t ử ườ 1 – 8 bào t th ng th c hình thành . Ph ứ túi ph thu c vào hình th c sinh s n c a n m men.

ủ ế ử ờ sau khi hình thành nh năng l bào

ữ b n là nh ng bào t ố ứ ề ệ ộ ượ ử ắ ng c a t + Bào t ử ạ ắ . b n m nh v phía đ i di n. Đó là m t hình th c phát tán bào t

ế ế ợ ấ ớ

ữ - Sinh s n h u tính: do hai t phân chia hình thành các bào t

ử ằ n m trong nang, nang chín bào t ấ ế

ế ế ế ớ ợ ợ bào n m men k t h p v i nhau hình thành h p ử ướ c ế bào n m men có hình thái kích th ẳ c g i là ti p h p đ ng giao. N u hai t

ế ượ ọ ợ ế ấ ọ ị ả ử ợ ử . H p t t ượ đ c phát tán ra ngoài. N u hai t ợ ố gi ng nhau ti p h p v i nhau thì đ bào n m men khác nhau thì g i là ti p h p d giao.

ấ

ố 2 N m m c

ấ 2.1Khái ni m n m m c ố ệ

ấ Hình 2.1 N m m c ố Penicillium chrysogenum

ố ấ ể

ỉ ấ ấ

ụ ấ ấ ạ ư ấ N m m c là tên chung đ ch các nhóm n m không ph i n m men cũng ằ ướ ớ ớ c l n có th nhìn th y b ng không ph i các n m l n có tai (n m có kích th ấ ơ ắ m t th ả ấ ả ể ườ ng, có d ng nh ô dù. Ví d : n m r m, n m mèo,...).

ấ N m m c (fungus, mushroom) là vi sinh v t đa bào d ng s i phân nhánh, ể ả ạ ị ưỡ ế ạ , s ng d d

ế ấ ạ ộ

ậ ệ ụ ố ố bào không có di p l c t ủ ế ượ ộ ố ấ ầ ố th t n (thalophyte), t sinh, c ng sinh), vách t xellulose và m t s thành ph n khác có hàm l ở ợ ng (ho i sinh, ký bào c u t o ch y u là chitin, có hay không có ng th p.

ố ấ ố ộ ồ N m m c phân b r ng rãi trong t nhiên (trong đ t, phân chu ng, n

ấ ọ

ự ả ả ậ ấ ấ ệ ả nhiên, do chúng có kh năng phân gi

ư ướ ự c, ầ ả không khí,...). chúng đóng vai trò r t quan tr ng trong vi c b o đ m vòng tu n ấ ợ i các h p ch t hoàn v t ch t trong t nh : cellulose, protein, lipid, kitin, pectin,...

ấ ạ ướ ấ 2.2Hình thái c u t o và kích th ố c n m m c

ố ứ ố ấ ể ơ

ỏ ố ườ

ướ ớ ế ề

ụ ể ề

ưở ọ ợ ồ

ợ ấ ườ ầ ọ

ấ

ấ ộ ố ạ - M t s ít n m m c có th đ n bào có hình tr ng, đa s n m m c có d ng ợ ấ ợ ợ hình s i. S i n m có kích th c l n nh khác nhau tùy loài. Đ ng kính s i ừ ườ ấ ợ ậ ng t n m th 3 – 5 µm, có khi đ n 10 µm, th m chí đén 1mm. Chi u dài s i ấ ợ ấ ớ ể i vài ch c centimet. Các s i n m phát tri n chi u dài theo n m có th lên t ụ ộ ỉ ở ể ng ki u tăng tr ng n. Đ nh s i bao g m m t chóp hình nón có tác d ng ộ ố ệ ở ả ủ ợ ấ ng là m t ng che ch b o v cho ph n ng n c a s i n m. S i n m th ứ ụ hình tr dài và phân nhánh trong đó ch a các ch t nguyên sinh, nhân, các bào quan và emzyme.

ợ ượ ẩ ậ ấ - S i n m còn đ

ư ấ ệ ớ

ư ấ ỗ c g i là khu n ty, có vách ngăn nh n m b c cao ằ ng lên h v i nhau b ng ậ , không có vách ngăn nh n m b c th p (oomyctes, zygomycetes)

ợ ộ ề ố ọ ọ ườ (ascomycytes basicdiomycetes) các vách ngăn th ấ vách l ặ ho c hình ng có nhi u nhân g i là s i c ng bào.

ợ ấ ướ ể Hình 2.2 S i n m d i kính hi n vi

ợ ạ ẩ ố

ộ ỗ ế ố ứ

ở ặ ố ế ự ộ ẩ

ộ

bào là m t màng ngăn. Vách ngăn ở ữ đây không hoàn toàn mà có các l ế ề ủ ở ổ ự ữ ấ ượ ạ ấ c t o + D ng hình s i có vách ngăn (đa s các loài n m m c khu n ty đ ề ợ ấ bào n i ti p nhau). S i n m ch a m t, hai hay nhi u thành b i m t chu i t nhân ho c không có nhân do s di truy n c a nhân trong khu n ty. Ngăn cách ỗ ế hai t ổ h ng gi a vách ngăn giúp cho s trao đ i ch t gi a các t bào.

ợ ạ ậ

ẩ ế ề ố ấ rãi rác trong t ấ ọ bào ch t g i là các t

ộ ợ ấ ấ + D ng s i không có vách ngăn (n m b c th p khu n ty) toàn b s i n m ế ở phân nhánh trong su t có nhi u nhân bào đa nhân.

- H s i n m có th bi n hóa đ thích nghí v i các đi u ki n s ng khác nhau

ệ ợ ấ ệ ố ề ớ

ạ ệ ể ế ặ hình thành các d ng đ c bi ể t sau:

ễ ả ụ ễ ấ

ư ộ ấ ừ ơ ấ ưỡ ấ + R gi ặ ch t vào c ch t và h p thu ch t dinh d ố : gi ng nh m t chùm r phân nhánh, có tác d ng giúp n m bám ơ ấ ng t c ch t.

ợ ố ố ừ ọ

ộ ắ ủ ở ế bào ch , ể ợ ố ử ụ ấ ặ ợ ẩ n m m c s ng ký sinh b t bu c, chúng m c ra t khu n ty, ể ầ đó chúng có th có hình c u ừ ơ ể ưỡ c th ng t

ậ ở ấ + S i hút: có ọ phân nhánh và m c xuyên sâu vào t ấ ho c hình s i. N m m c s d ng s i hút đ hút ch t dinh d ủ ủ c a sinh v t ch .

ố ợ ệ

ế

ể ề ụ ủ ướ ủ ế ậ

ế i tác d ng c a enzyme do n m ti ủ ặ ấ ị ủ ị

ế ụ ẽ ấ ủ ể

ế ậ

ủ ư ợ ủ ế ầ ợ ấ ự ậ ệ ở ấ n m m c kí sinh trên th c v t. Ph n s i n m ti p xúc + S i áp: hi n di n ậ ủ ẽ ủ ớ ệ ồ ậ ớ v i sinh v t ch s ph ng to lên đ tăng di n tích ti p xúc v i sinh v t ch . ủ ậ ườ bào, áp ch t vào sinh v t ch . ng có hình đĩa, có nhi u nhân t Phàn này th ẽ ị ủ t ra s b phá Các mô c a sinh v t ch d ợ ầ ủ ừ h y t ng ph n hây b phân h y hoàn toàn. Qua các mô b phá h y này, s i ậ ấ n m s l n sâu vào bên trong sinh v t ch và ti p t c sinh enzyme đ phân ủ ể ủ h y sinh v t ch mà không phát tri n thành nhánh đâm sâu vào t bào còn ậ ố s ng c a sinh v t ch nh s i hút.

ạ ợ ấ ừ

ưỡ ầ

ng, có hình th ng ho c hình cung. Đ u mút c a s i bò ch m vào c ặ ủ ợ ấ ồ ễ ả ể ạ ầ ể ơ gi

ợ ấ ợ các s i n m + S i bò: đo n s i n m khí sinh không phân nhánh, phát sinh t ơ ặ ẳ dinh d ọ ấ ch t, phát tri n thành r đ bám ch t vào c ch t r i lan d n ra m i phía.

ạ ấ ữ ổ ủ ả

ấ ỏ ấ ể ạ ọ

ừ ậ ố ộ ữ

ắ ầ ợ ồ ồ

ấ ớ ợ ấ ế ắ ế t ra ch t dính trên kh p b m t đ gi ỏ ồ ế ụ ơ ể ộ ọ ậ ỏ

ế + Vòng n m và m ng n m: là nh ng bi n đ i c a các loài n m có kh năng ẫ ấ b y các loài đ ng v t nh trong lòng đ t. Vòng n m có th d ng b ng dính, ồ ỉ ẳ ọ nh ng cu ng ng n x p th ng góc v i s i n m chính. Đ nh ph ng m c ra t ề ặ ể ữ ặ ọ ấ to hình thành b ng hình c u ti ch t ạ con m i khi ch m vào. S i nhánh đâm xuyên qua v ngoài r i ph ng lên ợ thành m t b ng nh bên trong c th con v t và ti p t c phân nhánh các s i hút.

ử ấ ố ơ ườ ề ợ n m m c r i vào đi u ki n môi tr

ạ ẩ

ệ ợ ấ ẩ ơ ấ ưỡ ẽ ẩ ệ - Khi bào t ng thích h p, chúng s n y ẩ ệ ợ ấ ầ m m thành h s i n m. Trong h s i n m có hai lo i khu n ty: khu n ty ẩ dinh d ng (khu n ty c ch t) và khu n ty khí sinh:

ắ ườ ưỡ ng c m sâu vào môi tr ng dinh d ứ ng hút th c ăn làm

ẩ + Khu n ty dinh d ưỡ ệ ụ nhi n v nuôi d ưỡ ng.

ẩ ể ự ố ử do trong không khí mang cu ng bào t và

ụ ả ỗ + Khu n ty khí sinh phát tri n t ệ chu i làm nhi m v sinh s n.

ọ ở ộ ớ ọ

ượ ầ ư ậ

ọ ấ ườ ấ ợ ấ - S i n m đ ấ ượ ạ c l ế ế bào, thành t ư ở ự th c v t mà ng có hình tròn, đôi

ỏ c bao b c b i m t l p màng m ng g i là thành t ở ượ c bao b c b i xellulose nh ế bào ch t dày. Nhân: th i là ch t kitin. Màng t ộ ể bào n m h u nh không đ ng khi kéo dài. Ty th có hình elip và luôn di đ ng.

ả ở ấ 2.3Sinh s n ố n m m c

ưỡ ủ ề ẩ ấ ặ ộ ố

ệ ng: n u m t khu n ty c a n m m c đ t vào đi u ki n ể ẩ ớ ả - Sinh s n sinh d ậ ợ ẽ thu n l ế i s phát tri n thành khu n ty m i.

ả - Sinh s n vô tính:

ả ạ ử : g m các lo i bào t

ả ộ ượ ườ ạ ướ c. Chúng đ có m t ho c hai ừ ộ ặ c sinh ra t ng n

ộ ử ồ ằ + Sinh s n vô tính b ng các lo i bào t tiên mao có kh năng di đ ng trong môi tr ử . các nang đ ng bào t

ể ộ ử Hình 2.3 Các ki u đ ng bào t

ử ả ử ượ ừ túi (bào t l c): g m các b o t các nang bào t c sinh ra t đ

ử ọ ứ ồ ề

ứ ề ầ ầ ấ ỗ

ở ỏ ượ ế ầ ọ ổ c bao b c b i v chitin và bi n đ i thành bào t

ử + Bào t kín. Nang còn non ch a nhi u nhân, các nhân phân chia gián phân, sau đó ch t nguyên sinh trong nan phân chia ra làm nhi u ph n, m i ph n ch a 1 – ử 6 nhân. Các ph n này đ kín.

ử ầ ủ ể ầ ầ ử ỉ ợ ấ ả tr n sinh ra theo ki u c ph n đ u c a s i n m đ nh: bào t

ể + Bào t chuy n hóa thành.

ệ ế ấ ầ ượ ọ ử t n: s i n m xu t hi n t bào có vách d y đ c g i là bào t áo v ị

ợ ấ ử ả + Bào t trí khác nhau tùy loài.

ữ ậ ẳ ế ầ ọ bào vách d y g i

ử ố ợ ấ ử ố + Bào t là bào t đ t: s i n m kéo th ng, vuông hay ch nh t và t đ t.

- Sinh s n h u tính: x y ra khi có s k t h p gi a giao t

ự ế ợ ữ ữ ả ả ử ự ả đ c và cái, có tr i

ả ữ ả ạ ạ ả qa giai đo n gi m phân. Qúa trình sinh s n h u tính tr i qua 3 giai đo n:

ợ ế ế ấ ớ ự ợ ế ầ ủ ử + Ti p h p t bào ch t v i s hòa h p hai t bào tr n c a hai giao t

ợ ế ớ ự ủ ợ ử ể ạ ộ đ t o m t nhân d ị

+ Ti p h p nhân v i s hòa h p hai nhân c a hai giao t b iộ

ả ố ử ơ ộ + Gi m phân hình thành b n bào t đ n b i.

ƯỜ

Ấ II. HÓA CH T – MÔI TR

NG

ụ MTHóa ch t ấ M c đích

NaCl 85g,pepton 10g,nước cất 1000ml

Saline Pepton Water (SPW)

Pha loãng m u ẫ

DG 18 (Dichloran 18% Glycerol)

ố c yấ Nuôi ấ n m men ấ n m m c

ự

ẩ ậ

ủ ả S n ph m th y phân mô ậ ặ ộ đ ng v t ho c th c v t ằ b ng D enzyme, glucose,KH2PO4, Mg

glucose 10g,peptone 5g,K2HPO4 1g,MgSO4 0,5g,Rose Bengal (5%w/v) 0,5 ml,Dichloran (0,2% w/v trong ethanol)

DRBC (Dichloran Rose Begal Chloramphenicol)

1ml,Chloramphenicol 0,1g, Agar 15g,Nước cất 1000ml.pH 7,0±0,2

HCl 10%

ỉ Ch nh pH

NaOH 10%

Ế

III. CÁCH TI N HÀNH

Ị

ƯỢ

Ổ

Ố

Ấ

QUY TRÌNH Đ NH L

NG T NG N M MEN N M M C

Pha loãng

ằ ấ ẫ ồ Đ ng nh t m u b ng máy Stomacher trong 23 phút

∙∙∙

0,1ml 0,1ml 0,1ml 0,1ml

ử ẩ ị ẫ ầ

ề ố ớ ự ẩ

ự ặ ẩ

1. Chu n b M u th và huy n phù ban đ u (cid:0) Cân chính xác 10g/ 25g đ i v i th c ph m r n ho c đong 10/25ml đ i v i ố ớ ặ ắ ố (cid:0) ỏ ự th c ph m l ng (sai s 5%) cho vào túi nh a vô trùng (ho c bình tam giác).

(cid:0) Hut dung dich SPW 90ml/225ml cho vao tui đa ch a mâu.

́ ́ ̃ ́ ̀ ̃ ư ̣

(cid:0) Đông nhât mâu trong may dâp mâu (23p).

́ ́ ̃ ̀ ̃ ̣

(cid:0) Gi

̀ ́ ̀ ̀ ́ ư ̣ ̣ ̣ ̣ ̣ ́ ̃ ơ nhiêt đô dung dich băng v i nhiêt đô phong suôt qua trinh

(cid:0) Lăc huyên phu va dd pha loang (tranh co phân t

2. Pha loãng m uẫ

̀ ́ ̀ ̀ ́ ́ ̀ ̃ ́ ́ ử ́ co VSV lăng xuông)

(cid:0) Dung pipet hut 1ml dung dich huyên phu ̀

́ ̀ ̀ ̣ ̉ ̣

́ ư ị ̣

̃ ́ ở ươ b c chuân bi mâu cho vao ông nghiêm ch a 9ml dung d ch pha loãng SPW vô trùng ở ợ ̀ ́ ệ ộ t đ thích h p. nhi

(cid:0) ộ ể ị

ộ ồ

̀ ỹ ằ ở ở ứ Tr n k b ng máy vortex trong 510 giây đ thu đ pha loãng pha loãng ượ c dung d ch ặ ạ i quá trình các n ng đ khác nhau.N u c n thì l p l ̀ ́ ơ m c 10 ế ầ 4 ,105 …Qua trinh pha loãng theo s đô sau:

ủ ẫ ấ 3. C y và m u

(cid:0) Hut 0,3ml dung dich mâu pha loang 10

̃ ̀ ̃ ́ ̣

1 cho vao đia Petri đa co săn ̃ ̃ ̃ ́ ́ ́ ̀ ́ ươ c nay (nêu 2 ….kê tiêp cho đên mâu pha loang ̃ ́ ́

ươ ̣ ̣ ̣ ̀ ng DRBC hoăc DG18.Sau đo lăp lai cac b ́ ̃ ̃ ́

̀ ́ ́ môi tr ̃ ̀ cân) cho cac mâu pha loang 10 cuôi cung..

(cid:0) Dan đêu dich long khăp bê măt đia, tao điêu kiên cho tê bao tiêp xuc ́

̀ ́ ̀ ́ ̀ ̣ ̉ ̣ ̣ ̣

́ ́ ̀ ́ ơ ̃ ơ ̉ ̣ ̀ ́ ̀ tôi đa v i oxi KK va giam nguy c bât hoat.

(cid:0) ́ ̃ ́ ươ ư ̉ ̉ ́ ̀ ng hiêu khi, t ́ thê thăng

 L u ý:ư

̀ Cho vai tui ni lông.U đia trong môi tr – 1oC) trong 35 ngay. ̀ ́ư đ ng (25

ờ ằ ủ ấ ể ạ ử n m m c có th t o bào t

ể ạ

ấ ạ ủ , không đ

ờ ả ế ạ ặ

ớ ể ặ ẩ ạ ầ ễ ế ở ẫ ế ế ự ể và phát tri n trong ế ệ ượ ng này, ế ượ c ch m tay ho c di chuy n các đĩa cho đ n khi ể ế ử vào không khí, gay nhi m vào trong m u hay môi

ố ầ ư C n l u ý r ng trong th i gian ẩ ạ ườ ng nuôi c y t o nên các khu n l c m i. Đ h n ch hi n t môi tr ạ ố trong su t th i gian ế đ m k t qu . M t khác khi ti n hành đ m khu n l c c n h n ch m đĩa đ ạ ủ h n ch s phát tán c a bào t ấ ườ ng nuôi c y khác. tr

4. Đ m và ch n khu n l c đ kh ng đ nh

ẩ ạ ể ẳ ọ ế ị

́ ̃ ̉ ̀  Đêm trên đia u 35 ngay.

 Ch n các đĩa ít h n 150 khu n l c và đ m chúng.

ẩ ạ ế ơ ọ

 Kiêm tra băng kinh hiên vi đê phân biêt tê bao. nâm men, nâm môc va VK t

́ ̀ ́ ́ ̀ ́ ̉ ̉ ̉ ̣ ̀ ư ̀ ́ ̉ ̣ ́ ̀ khuân lac nêu cân.

́ ́ ́ ́ ́ ̀  Đêm riêng nâm men nâm môc nêu cân.

 Đê dê nhân biêt, chon vung phat triên hoăc cây trên môi tr

̃ ́ ̀ ́ ́ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ ̣ ̀ ̉ ươ ng phân lâp đê

5. K t quế

̉ kiêm tra.