B GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HC BÁCH KHOA HÀ NI
Phan Th Thanh Hà
NGHIÊN CU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
MT S VI RÚT CÓ NGUY CƠ CAO TRONG NHUYN TH
HAI MNH V VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HC PHÂN T
Ngành: Công ngh Sinh hc
Mã s: 9420201
TÓM TT LUN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HC
Hà Ni 2024
Công trình được hoàn thành ti:
Đại hc Bách khoa Hà Ni
Người hướng dn khoa hc:
TS. Lê Quang Hòa
PGS.TS. Trương Tuyết Mai
Phn bin 1: PGS. TS. Đặng Th La
Phn bin 2: PGS. TS. Nguyn Hoàng Anh
Phn bin 3: PGS. TS. Trần Văn Tuấn
Luận án được bo v trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp
Đại hc Bách Khoa Hà Ni hp tại Đại hc Bách khoa Hà Ni
Vào hi 8 gi 30, ngày 16 tháng 1 năm 2024
Có th tìm hiu lun án tại thư viện:
1. Thư viện T Quang Bu - ĐHBK Hà Nội
2. Thư viện Quc gia Vit Nam
1
M ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Báo cáo thống ngành thủy sản toàn cầu của Tchức Lương thực
Nông nghiệp Liên hợp Quốc (FAO) cho thấy nhu cầu đối với các mặt
hàng nhuyễn thhai mảnh vỏ (NTHMV) tăng mạnh vào năm 2021 so
với 2020. Nhuyễn thể của Việt Nam đã được xuất khẩu đến 42 nước;
trong đó, Liên minh châu Âu (EU) thị trường nhập khẩu NTHMV lớn
nhất, chiếm 62% tổng giá trị xuất khẩu mặt ng này của Việt Nam ra
c thị trường trên thế giới. Tuy nhiên, EU ng thị trường có quy
định chặt chẽ nhất đối với các sản phẩm nhập khẩu, gây nhiều thách
thức đối với ngành nuôi trồng NTHMV ở Việt Nam.
Trong những năm qua, tình trạng viêm dạ dày ruột, viêm gan do tiêu
thNTHMV nhiễm vi rút luôn vấn đề được lưu tâm. Theo dấu hiệu
m sàng, đã xác định được n 100 loại vi rút đường ruột mặt trong
thực phẩm bị ô nhiễm; trong đó, Norovirus (NoV), vi rút viêm gan A
(HAV), vi rút viêm gan E (HEV) Astrovirus người (HAstV) các
vi rút y bệnh thường gặp trong NTHMV. Đáng chú ý, một số nghiên
cứu về các vi rút này tại Việt Nam đã cho thấy tình trạng đồng nhiễm
nhiều tác nhân vi rút trên cùng một mẫu bệnh phẩm.
Hin nay, trong khi quy tnh chuẩn ISO 15216-2:2013 có thể ng
dụng để xác đnh NoV HAV trong thực phẩm thì các quy trình
Real-time RT-PCR phát hiện HAstV HEV n chưa được chuẩn
a, y nhiều hạn chế trong công tác kim nghiệm. Vì vậy, việc y
dựng quy trình xác định HAstV HEV với bộ mồi, mẫu đảm bảo
độ bao phủ trên các biến chủng hiện có, đồng thời ti ưu các điều kiện
của phản ứng Real-time RT-PCR, cho phép xác định cùng lúc cbn
c nn NoV, HAV, HEV và HAstV với một chu trình nhiệt của ISO
15216-2:2013 s p phần rút ngắn thời gian pn ch, hỗ trợ kịp thời
cho công c điu tr.
Bên cạnh đó, các số liệu về đặc điểm sinh học phân tử của các vi t
gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại Việt Nam còn rất hạn
chế. vậy, việc xác định đặc điểm sinh học phân tử của vi rút thông
qua xác định kiểu gen (genotype) ng đoạn cần thiết để đánh giá
chính xác nguy bùng phát dịch bệnh y ra bởi c c nhân vi rút có
mặt trong NTHMV. Do vậy, luận án nghiên cứu sinh “Nghiên cứu xây
dựng phương pháp phân tích một svi rút nguy cao trong nhuyễn
thể hai mảnh vỏđặc điểm sinh học pn tử” đã được thực hiện.
2
2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
2.1. Mục tiêu nghiên cứu
- Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV
HAstV trong NTHMV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO
15216-2:2013.
- Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện định lượng vi rút gây
bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV trên thị trường
- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền
qua thực phẩm trên NTHMV.
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện định
lượng RNA của HEV và HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
2.2.1.1. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện định lượng
RNA của HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
- Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu cho phản ứng Real-time
RT-PCR phát hiện HEV
- Tách dòng và tổng hợp RNA hóa vùng gen đích của HEV bằng
phiên mã in vitro
- Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu
trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-2:2013
- Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này
- Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát
hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt
rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-2:2013
2.2.1.2. Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện định lượng
RNA của HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ
- Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu cho phản ứng Real-time
RT-PCR phát hiện HAstV
- Tách dòng tổng hợp RNA hóa vùng gen đích của HAstV
bằng phiên mã in vitro
- Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của với chu
trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-2:2013
- Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này
- Xác định đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát
hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình
nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-2:2013
3
2.2.2. Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh
truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh v
- Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm
trong NTHMV năm 2016
- Đánh giá tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm
trong NTHMV năm 2022
- So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm
trong NTHMV năm 2016 và năm 2022
2.2.3. Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh
truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh v
- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của NoV phát hiện trong
NTHMV
- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HEV phát hiện trong
NTHMV
- Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của HAstV phát hiện trong
NTHMV
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Thiết kế, hiệu chỉnh bộ mồi, mẫu độ bao phủ cao với các
trình tự HEV và HAstV hiện có trên ngân hàng dữ liệu GenBank.
- Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR để thể phát hiện được RNA
của HEV HAstV theo chu trình nhiệt được miêu tả trong ISO 15216-
2:2013; từ đó mở ra khả năng phát hiện được 4 tác nhân vi rút NoV,
HAV, HEV và HAstV trong một lần chạy Real - time RT-PCR.
- Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR
phát hiện RNA của HEV HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh các vi rút
này
- Xác định các kiểu gen (genotype) của NoV, HAV, HEV HAstV
nhiễm tạp trong NTHMV, góp phần đánh giá nguy bùng phát dịch
bệnh.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Cung cấp một quy trình phân tích cả 4 tác nhân NoV, HAV, HEV
và HAstV với tính chính xác cao (4 phản ứng Real-time RT-PCR riêng rẽ
chạy đồng thời với cùng một chu trình nhiệt) trong NTHMV nói riêng
trong các mẫu thực phẩm, bệnh phẩm, môi trường nói chung để các sở
xét nghiệm có thể ứng dụng trong phân tích.
- Góp phần nâng cao năng lực kiểm soát an toàn thực phẩm, tăng tính
cạnh tranh của NTHMV các mặt hàng thủy sản xuất khẩu trên thị
trường quốc tế.