Phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatis

Chia sẻ: Văng Thị Bảo Yến | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

57
lượt xem 1
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu được tiến hành nhằm phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Chlamydia trachomatis. Các mẫu bệnh được khảo sát là của các bệnh nhân tới khám chữa bệnh tại bệnh viện Phụ sản Bắc Giang từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011,... Mời các bạn cùng tham khảo.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện vi khuẩn Chlamydia trachomatis

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX - PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN CHLAMYDIA TRACHOMATIS Nguyễn Ngọc Chỉnh1, Phạm Đăng Bảng2, Trần Hậu Khang2, Đặng Xuân Nghiêm1 1 Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, 2Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu được tiến hành nhằm phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn Chlamydia trachomatis. Các mẫu bệnh được khảo sát là của các bệnh nhân tới khám chữa bệnh tại bệnh viện Phụ sản Bắc Giang từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2011. Điều kiện tối ưu của phản ứng PCR nhằm phát hiện các đoạn DNA đặc thù của Chlamydia trachomatis bằng 5 cặp mồi CtP, CtM, CtR, NO, Chlamp và cặp mồi đối chứng dương AR, đã được khảo sát và cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu của từng cặp mồi nằm trong khoảng từ 53oC đến 57oC. Đồng thời, điều kiện tối ưu cho phản ứng Multiplex PCR với 4 cặp mồi: CtP, NO, Chlamp và AR đã được xác định là 56oC. Kết quả khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh ở các bệnh nhân đến khám phụ khoa ở bệnh viện Phụ sản Bắc Giang cho thấy có 31 mẫu dương tính trong số 251 mẫu nghiên cứu, chiếm 12,35%. Từ khóa: chẩn đoán nhanh, Chlamydia trachomatis, Multiplex PCR I. ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh nhiễm khuẩn đường sinh dục do vi phương pháp có độ chính xác cao. Ratti và khuẩn Chlamydia trachomatis (C. trachomatis) cộng sự (1991) dùng cặp mồi Chlamp để xác định vi khuẩn C. trachomatis [2]. Năm 1993, là bệnh phổ biến trên toàn Thế giới và có mức độ lây nhiễm cao. Theo Tổ chức Y tế Thế giới, Roosendaal và cộng sự đã so sánh độ nhạy của phương pháp chuẩn đoán bằng PCR, sử mỗi năm có khoảng 90 triệu người mắc bệnh do nhiễm vi khuẩn này. Nhiễm C. trachomatis dụng 4 cặp mồi AR, CtM, CtR, CtP để xác định vi khuẩn C.trachomatis [3]. Đến năm là nguyên nhân gây viêm vùng chậu, với khoảng 80% nữ giới và 70% nam giới nhiễm 2006, Viroj cùng các cộng sự đã dùng cặp mồi C. trachomatis không biểu hiện triệu chứng, NLO để xác định các mẫu bệnh [1]. Mục tiêu nghiên cứu nhằm khảo nghiệm, tối ưu hóa việc đây là nguyên nhân bệnh lây bệnh ra cộng đồng [1]. Vi khuẩn C. trachomatis là vi khuẩn ứng dụng các cặp mồi đã công bố để phát hiện vi khuẩn C. trachomatis bằng phương pháp kí sinh nội bào, bệnh ít biểu hiện ra bên ngoài nên cần có biện pháp phát hiện nhanh vi PCR; phát triển phương pháp multiplex PCR phát hiện vi khuẩn C. trachomatis và xác định khuẩn để có biện pháp chữa kịp thời tránh gây tỷ lệ nhiễm C. trachomatis tại Bắc Giang bằng biến chứng cho các bệnh nhân. Việc sử dụng các cặp mồi đã nghiên cứu và công bố trên phương pháp multiplex PCR. thế giới để phát triển thành kít phát hiện vi khuẩn C. trachomatis ở các bệnh nhân là Địa chỉ liên hệ: Đặng Xuân Nghiêm, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Email: dxnghiem@hua.edu.vn Ngày nhận: 12/01/2013 Ngày được chấp thuận: 20/6/2013 TCNCYH 83 (3) - 2013 II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 1. Đối tượng 20 mẫu DNA của vi khuẩn C. trachomatis thu thập và tách chiết tại Bệnh viện Da liễu Trung Ương được sử dụng để tối ưu hóa phản ứng PCR, 251 mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân nữ đến khám phụ khoa tại bệnh viện Phụ sản Bắc Giang tình nguyện tham gia 27 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC nghiên cứu từ ngày 15/03/2011 đến ngày vortex 30 giây, ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng. 13/05/2011. Sau đó, 200µl chloroform được thêm vào và trộn đều sao cho toàn bộ dung dịch trong ống 2. Phương pháp 2.1. Phương pháp thu thập mẫu eppendorf chuyển thành màu trắng đục, hỗn hợp được ly tâm ở 4oC, 13000 vòng/phút Mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân nữ tham gia nghiên cứu được thu thập qua hai trong 10 phút. Dịch nổi được chuyển vào ống eppendorf mới có sẵn 600µl isopropanol lạnh, dạng: nước tiểu và mẫu quệt cổ tử cung. Mẫu được bảo quản trong ống eppendorf có trộn đều và ủ -20oC 30 phút. DNA được thu đệm PBS (Phosphate-buffered saline) và ly tâm 14000 vòng/phút trong 15 phút trong 4oC bằng cách ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút và rửa bằng 900µl ethanol 70%, để khô để thu các tế bào trong mẫu bệnh. Sau đó các ethanol ở nhiệt độ phòng và hòa tan bằng 50µl dung dịch đệm TE 10mM, pH 8. Mẫu tế bào được rửa bằng đệm PBS và bảo quản ở - 20oC. DNA được bảo quản ở - 20oC [4]. Phương pháp sử dụng proteinase K và 2.2. Phương pháp tách chiết DNA Phương pháp sử dụng Trizol: 200 µl mẫu được trộn đều với 900 µl dung dịch Trizol pH 8, phương pháp đun sôi được tiến hành theo nghiên cứu của Jenab và cộng sự (2010) [5]. 2.3. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR, Multiplex PCR Bảng 1. Các mồi sử dụng trong nghiên cứu Vị trí đoạn gen được nhân Tên mồi Kích thước (bp) Trình tự mồi (5’ – 3’) Chlamp - 1 CCAAAGCTATTCAAAATCGGAGCTCTAAGA Chlamp - 4 GTCTTCTGCTTACAATGCTCTTGCATATTA 610 - 612 Nhiễm sắc thể vi khuẩn NLO ATGAAAAAACTCTTGAAATCG NRO CTCAACTGTAACTGCGTATTT AR1 GGCGGTGACGGAGCTGGGGCG AR2 CGCCGCTGCACTGTGAAGCTC CtP1 TAGTAACTGCCACTTCATCA CtP2 TTCCCCTTGTAATTCGTTGC CtM1 GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCCTC 1128 DNA người 153 Plasmid Gen MOMP trên NST vi khuẩn 201 129 CtM2 CCAAGTGGTGCAAGGATCGCA CtR1 GTGGATAGTCTCAACCCTAT CtR2 CCCTAAGTGTTGGCAACTAA Riboxôm 28 310 TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Để đánh giá độ nhạy và tiềm năng xác định 2.4. Khảo sát tỷ lệ nhiễm bệnh ở Bắc Giang mẫu bệnh phẩm có nhiễm vi khuẩn C. tracho- Nghiên cứu tiến hành khảo sát 251 mẫu bệnh thu thập tại bệnh viện Phụ sản Bắc matis bằng phản ứng PCR, 5 cặp mồi nghiên cứu và cặp mồi đối chứng dương đã được sử dụng (bảng 1). Mỗi cặp mồi nhân các đoạn DNA khác nhau của vi khuẩn C. trachomatis, ngoại trừ cặp AR là đối chứng dương trong phản ứng PCR, nhân một trình tự của HLA người - đoạn gen mã hóa cho kháng nguyên bạch cầu HLA lớp 2 trong tế bào người. Trong Giang. Các mẫu bệnh được tách chiết DNA và chạy multiplex PCR. Nếu phản ứng multiplex PCR dương tính thì mẫu bệnh có chứa vi khuẩn C. trachomatis, nếu không phản ứng mẫu bệnh được kết luận không chứa vi khuẩn gây bệnh. III. KẾT QUẢ mỗi xét nghiệm, đoạn DNA sản phẩm do cặp mồi AR phải luôn được nhân lên để xác định DNA được tách từ mẫu bệnh phẩm thành công. Đồng thời, DNA khuôn tách chiết từ các mẫu của người đã biết chắc chắn mang bệnh và không mắc bệnh cũng được chạy cùng như một đối chứng dương và âm tương ứng. Cặp mồi Chlamp, NO nhân đoạn DNA trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn [6; 7], cặp mồi CtP nhân đoạn DNA trên plamid 7,5 kb phổ biến, 1. Kết quả tách chiết DNA từ mẫu bệnh DNA tổng số của các mẫu bệnh được tách chiết theo 3 phương pháp khác nhau: phương pháp sử dụng Trizol, phương pháp sử dụng protein K và phương pháp đun sôi. Nồng độ và chất lượng DNA tổng số đã được kiểm tra bằng máy đo quang phổ hấp thụ và điện di. Kết quả của nhiều thí nghiệm lặp lại cho thấy phương pháp sử dụng Trizol cho chất lượng CtR nhân đoạn DNA của gen mã hóa riboxôm và số lượng DNA tốt nhất. Ngoài ra, mẫu bệnh phẩm là tế bào thu từ ly tâm nước tiểu cho kết 16S, cặp mồi CtM nhân đoạn DNA không biến quả tách chiết kém hơn so với mẫu dịch tiết đổi của gen mã hóa protein trên màng tế bào cổ tử cung. Độ nhạy khi xét nghiệm các bệnh phẩm bằng nước tiểu thấp hơn nhiều so với của vi khuẩn C. trachomatis [3]. bệnh phẩm là mẫu quệt cổ tử cung. Thành phần PCR: PCR buffer (50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 10 mM Tris - HCl pH = 8,3); 200 µM mỗi loại dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP); 50 pmol cho mỗi mồi và 1 U Taq polymerase. Trong phản ứng Multiplex PCR, để phản ứng tối ưu, mỗi phản ứng Multiplex PCR cũng có 200 µM mỗi loại dNTP, 1,5 mM MgCl2 2. Kết quả kiểm nghiệm điều kiện tối ưu để chạy mỗi cặp mồi Mỗi cặp mồi nghiên cứu nhân các đoạn DNA khác nhau có kích thước khác nhau. Qua khảo sát với các DNA khuôn từ mẫu bệnh đối chứng dương tách chiết bằng kít chuẩn IVA pDNA Extraction Kit - Code VA.A92- và 50 pmol cho mỗi mồi. Chu trình nhiệt: 95oC 002A, các điều kiện khác nhau về thành phần 5 phút, 95oC 1 phút, 50 - 60oC 2 phút, 72oC Mg2+, hàm lượng dNTP, thời gian bắt cặp o 1,5 phút, lặp lại 35 chu kỳ, kết thúc 72 C trong của các cặp mồi cho ta thấy kết quả khác 10 phút. Sản phẩm PCR được điện di trên gel nhau không có ý nghĩa. Tuy nhiên, hình 1 agarose 2,5%. cho thấy nhiệt độ gắn mồi tối ưu của mỗi cặp mồi là khác nhau. TCNCYH 83 (3) - 2013 29 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình 1. Sản phẩm PCR của các cặp mồi nghiên cứu Nhiệt độ tối ưu cho các cặp mồi đã được và kích thước sản phẩm PCR, phản ứng nghiên cứu và lựa chọn dựa theo các nghiên cứu của Ratti cùng cộng sự (1991), Roosen- multiplex PCR được tiến hành xây dựng để phát hiện nhanh và chính xác vi khuẩn C. daal cùng cộng sự (1993), Viroj cùng cộng sự (2006). Trong nghiên cứu này, nhiệt độ tối ưu trachomatis. 4 cặp mồi, AR, CtP, Chlamp và NO, có nhiệt độ gắn mồi gần giống nhau được đã được xác định lại riêng cho từng cặp mồi như sau: cặp mồi AR, NO, CtR, CtM có nhiệt chọn để chạy phản ứng multiplex PCR. Nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR được độ gắn mồi tối ưu là 55oC, cặp mồi Chlamp có khảo sát lại ở dải nhiệt độ từ 47oC tới 56oC và nhiệt độ gắn mồi tối ưu là 53oC và cặp mồi CtP có nhiệt độ gắn mồi tốt nhất ở 57oC. Như kết quả được thể hiện trong hình 2. vậy, nhân tố nhiệt độ bắt cặp ảnh hưởng mạnh tới kết quả của phản ứng PCR. Hình 1 còn cho thấy, ngoại trừ mồi AR, các cặp mồi nghiên cứu đều rất nhạy và cho ra các sản phẩm rõ nét, đúng kích thước. Sản phẩm PCR của 5 cặp mồi cũng đã được khẳng định là DNA của C. trachomatis bằng việc cắt bằng enzyme giới hạn thích hợp và giải trình tự. Việc khảo sát này được thực hiện nhằm tìm ra các cặp mồi tốt nhất, có nhiệt đội gắn mồi tối ưu gần giống nhau để dùng trong phản ứng multiplex PCR. 3. Kết quả multiplex PCR Dựa vào kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi 30 Hình 2. Sản phẩm phản ứng Multiplex PCR với 4 cặp mồi: AR, CtP, Chlamp và NO M: Thang DNA 100 bp; 1: 47oC; 2: 50oC; 3: 53oC; 4: 56oC TCNCYH 83 (3) - 2013 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Nhiệt độ gắn mồi tốt nhất cho phản ứng o Multiplex PCR là 56 C. 4. Kết quả khảo sát các mẫu bệnh từ bệnh viện Phụ sản Bắc Giang Trong nghiên cứu này, có 251 mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân được thu thập. Căn cứ vào nhóm tuổi, tình trạng hôn nhân, quê quán và nghề nghiệp, các bệnh nhân được phân ra nhiều các nhóm nhỏ khác khác nhau theo đặc điểm trên. Đáng ngạc nhiên là các phản ứng multiplex PCR với các mẫu nghiên cứu hoặc cho sản phẩm đầy đủ của các cặp mồi thành phần với độ nét cao hoặc không có bất kỳ sản phẩm nào ngoài DNA do cặp mồi AR nhân lên. Kết quả này có sự khác biệt với công bố của Roosendaal cùng cộng sự (1993) rằng cặp mồi CtP có độ nhạy cao hơn các cặp mồi khác. Kết quả phản ứng multiplex PCR phát hiện ra 31 mẫu trong tổng số 251 mẫu bệnh phẩm của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu có kết quả dương tính, chiếm 12,35%. Hình 3. Tỷ lệ các bệnh nhân dương tính với phản ứng Multiplex PCR theo lứa tuổi, nơi sống, tình trạng hôn nhân và nghề nghiệp TCNCYH 83 (3) - 2013 31