Quản lý dịch bệnh thủy sản

Chia sẻ: Le Quang Hoang | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:72

Thêm vào BST

Báo xấu

598
lượt xem 242
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Thời gian qua dịch bệnh thủy sản vẫn thường xuyên xảy ra, gây thiệt hại nặng nề cho người nuôi trồng. Điển hình nhất là con tôm, dù đây là mặt hàng chiến lược với giá trị xuất khẩu lớn nhưng lại là loài nuôi chứa đựng nhiều rủi ro nhất vì dịch bệnh luôn có thể bùng phát. Thống kê của Tổng cục Thủy sản cho thấy, mặc dù năm 2010 diện tích nuôi tôm nước lợ bị thiệt hại do môi trường, dịch bệnh đã giảm đáng kể so với những năm trước nhưng vẫn ở mức cao...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Quản lý dịch bệnh thủy sản

Quản lý dịch bệnh thủy sản
QUẢN LÝ DỊCH BỆNH THỦY SẢN TỔNG QUAN 1
1. NỘI DUNG - Các vấn đề chung trong quản lý dịch bệnh thủy sản - Phát hiện bệnh ở thủy sản - Các bệnh thường gặp: • Bệnh truyền nhiễm • Bệnh không truyền nhiễm - Các phương pháp chẩn đoán bệnh ở thủy sản • Mô bệnh học • Miễn dịch học • Sinh học phân tử - Các phương pháp phòng và trị bệnh ở thủy sản 2. THÔNG ĐIỆP TRỌNG TÂM - Những xét nghiệm ở phòng thí nghiệm chỉ là một phần của quản lý dịch bệnh - Quản lý dịch bệnh là sự tiếp cận từ nhiều phía - Nên tránh tập trung phát triển các kỹ thuật xét nghiệm phân tử mà xem nhẹ việc thường xuyên tiếp cận với người nuôi thủy sản 3. TẠI SAO PHẢI NGHIÊN CỨU BỆNH THỦY SẢN ? Nghiên cứu Xác định nguyên nhân Đề xuất giải pháp xử lý GIÚP NGƯỜI NUÔI THỦY SẢN 4. CÁC VẤN ĐỀ VỀ BỆNH THỦY SẢN - Bệnh thủy sản rất phức tạp • Bệnh truyền nhiễm Mầm bệnh + Sốc + Vật chủ = Bệnh 2
• Bệnh không truyền nhiễm + Dinh dưỡng hoặc môi trường + Thường là sự kết hợp nhiều nguyên nhân Mầm bệnh + Vật chủ = Bệnh • Không bao giờ đơn giản như vậy - Muốn đề xuất giải pháp phòng và trị bệnh hữu hiệu, phải: • Xác định được nguyên nhân: Mầm bệnh hoặc bệnh lý Chưa đủ kết luận là nguyên nhân gây ra dịch bệnh - Ví dụ: Aeromonas hydrophila ở cá chép • Định danh vi khuẩn và chẩn đoán lâm sàng sẽ không giúp ích gì cho người nuôi • Cần phải xác định nguyên nhân gây ra bệnh: thường là do môi trường/sự quản lý • Cần phải có những giải pháp thích hợp tùy theo thực tiễn của mỗi trường hợp: thuốc và hóa chất chỉ có tác dụng rất nhỏ để giải quyết vấn đề dịch bệnh 5. PHÁT HIỆN BỆNH - Đủ sớm để có giải pháp kịp thời - Khó thực hiện trong một lần khảo sát - Cần sự theo dõi liên tục: thường là do người nuôi thực hiện - Ghi nhận các thông tin về ao nuôi là rất quan trọng: nhưng thường ít khi được thực hiện - Thông tin về sản xuất: tăng trưởng/cho ăn/tỷlệ sống - Diễn biến của bệnh - Quan sát hoạt động tôm/cá: hoạt động/quan sát tổng quan - Thông tin về môi trường nuôi: PH/độ trong/nhiệt độ/độ mặn/Oxy hòa tan 6. THÔNG TIN VỀ SẢN XUẤT - Dấu hiệu trước tiên về sức khỏe thủy sản thường là: giảm ăn/giảm bắt mồi - Các dạng bệnh có ảnh hưởng lâu dài • Ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản lượng • Chỉ có thể phát hiện qua thông tin về sản xuất: tăng trưởng/FCR/etc. 3
7. ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG 8. DIỄN BIẾN CỦA BỆNH * Những diễn biến quan trọng trong việc xác định nguyên nhân gây ra dịch bệnh - Quá trình lây lan và vị trí phát tán mầm bệnh - Có liên quan đến: • Các biến động về môi trường • Nguồn tôm/cá giống • Thức ăn sử dụng * Dịch tể học - Nghiên cứu dạng bệnh ở các quần thể • Các nghiên cứu dịch tể của bệnh ở mức quần thể • Phương thức truyền thống nghiên cứu ở mức cá thể - Cần phải thực hiện cả hai để có thể kiểm soát bệnh một cách hiệu quả - Người nuôi luôn luôn theo dõi các vấn đề cơ bản liên quan đến dịch tể của bệnh 4
• Bám sát diễn biến bộc phát của bệnh: sự phân bố về mặt địa lý và thời gian • Có sự kết hợp giữa quản lý và sản lượng: cách cho ăn sao cho có hiệu quả * Những dạng bộc phát của bệnh - Lây lan - thường là bệnh truyền nhiễm - Có tính chất tại chỗ • Truyền nhiễm e.g: mẻ tôm/cá giống bị nhiễm • Không truyền nhiễm e.g: do ô nhiễm hoặc độc tố 9. LÂY LAN 5
Point source 9. QUAN SÁT - Hoạt động, các vùng bị tổn thương, vừa mới chết - Thường không giúp ít nhiều cho việc đề xuất giải pháp • Nên kết hợp với những thông tin khác • Nhiều mầm bệnh gây ra dấu hiệu lâm sàng giống nhau • Dấu hiệu bệnh khác nhau theo cá thể và quần thể 6
- Quan sát hoạt động • Cá và tôm là những sinh vật đơn giản • Có rất ít thay đổi về hoạt động/tập tính khi bị bệnh: tấp vào mé bờ/lờ đờ/tăng hoạt động - Có rất ít dấu hiệu bệnh lý Ở tôm: • Hầu như tất cả những tổn thương đều có dấu hiệu bệnh lý là những đốm đen hoặc có biểu hiện melanin hóa Do nhiễm bệnh hoặc các yếu tố sinh lý e.g đen mang có thể do rất nhiều nguyên nhân • Có rất nhiều yếu tố gây sốc và nhiễm vi sinh vật gây ra hiện tượng đỏ thân 10. THÔNG TIN VỀ MÔI TRƯỜNG - Cần được theo dõi thường xuyên và có ghi nhận các chỉ tiêu về môi trường - Thường không thể phát hiện ra nguyên nhân ở một lần khảo sát - Khi dịch bệnh đã bộc phát thì thường đã quá trễ để có thể cứu vãn - Không thể đòi hỏi người nuôi giám sát các chỉ tiêu về thủy hóa phức tạp - Các ghi nhận về chỉ tiêu môi trường phải: • Đơn giản • Người nuôi hiểu được rằng các chỉ tiêu họ cần ghi nhận là rất có lợi • ĐỪNG ĐÒI HỎI QUÁ NHIỀU SỐ LIỆU !!! 11. CÁC XÉT NGHIỆM - Xét nghiệm là nhằm mục đích định danh mầm bệnh/xác nhận bệnh lý/xác định tác nhân gây bệnh • Mô học, vi trùng học, sinh học phân tử và miễn dịch học • Không giúp ích gì cho những ao nuôi đang bị bệnh - Xét nghiệm chỉ là một phần nhỏ trong việc xác định nguyên nhân gây nên dịch bệnh - Xét nghiệm nhằm: • Nhận dạng mầm bệnh • Chọn loại kháng sinh có hiệu lực với mầm bệnh • Cho ý kiến về khả năng thu hoạch khẩn cấp • Xác định người nuôi tôm/cá phi bệnh tật • Đối phó với những vấn đề mới có liên quan đến dịch bệnh (*) Không giúp ích gì cho những ao nuôi đang bị nhiễm bệnh 7
12. XÁC ĐỊNH CÁC VẤN ĐỀ LIÊN QUAN ĐẾN BỆNH - Ảnh hưởng của bệnh • Tác hại đến lợi nhuận/kế sinh nhai • Các vấn đề khác? • Vấn đề nào là quan trọng nhất? • Nguyên nhân nào là chủ chốt? 12. GIẢI QUYẾT VẤN ĐỀ - Hiệu quả kinh tế - Khống chế bệnh phải phù hợp với hệ thống nuôi/khả năng của người nuôi - Khi cần thiết phải thuyết phục người nuôi 13. THẤT THOÁT DO BỆNH - Thất thu do cá/tôm chết - Mất năng suất - Mất lòng tin trong đầu tư - Mất cơ hội - Tốn kém cho việc phòng và trị bệnh - Nguồn tự nhiên: bố mẹ/đánh bắt 14. ĐỐI PHÓ - Không làm gì cả: thường không được chấp nhận - Thay đổi phương thức quản lý - Tát ao: thất thu hoặc phải thu hoạch sớm - TRỊ BỆNH 8
15. VAI TRÒ CỦA PHÒNG THÍ NGHIỆM Nghiên cứu Xác định nguyên nhân Đề xuất giải pháp xử lý GIÚP NGƯỜI NUÔI THỦY SẢN - Kết hợp hay riêng lẻ • Xác định nguyên nhân và khuyến cáo các xử lý • Lưu giữ và cung cấp thông tin về những vấn đề dịch bệnh xuất hiện trong khu vực • Tìm hiểu nguyên nhân của những bệnh mới - Sẽ không giúp ích người nuôi nếu chỉ xác định mầm bệnh và bệnh lý - Sẽ giúp ích người nuôi nếu • Hợp tác với cán bộ khuyến ngư và người nuôi • Có những phương cách quản lý ao nuôi hợp lý 16. KẾT LUẬN - Mục tiêu là giúp người nuôi - Phòng thí nghiệm không thể đơn phương thực hiện - Các xét nghiệm của phòng thí nghiệm phải được sử dụng kết hợp với những dữ liệu khác để xác định nguyên nhân gây ra bệnh - Liên kết và hỗ trợ từ cán bộ khuyến ngư và người nuôi để có những khuyến cáo hữu ích về mặt quản lý - Tránh lập lại những hạn chế mà các phòng thí nghiệm khác đã gặp --------------------- 9
KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN NGUYÊN LÝ VÀ ỨNG DỤNG 10
1. GIỚI THIỆU - Quá trình xét nghiệm bệnh phẩm thủy sản người phân tich mẫu thường bị nhầm lẫn giữa các tác nhân gây bệnh cơ hội hơn là tác nhân gây bệnh chủ yếu. - Kết quả chẩn đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào: + tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán đang được áp dụng ở phòng thí nghiệm + lảnh vực nghiên cứu của người chẩn đoán + những phép chẩn đoán được phát triển trên cơ sở các loài địa phương - Nắm vững nguyên tắc của các kỹ thuật đoán và đọc kết quả một cách chuẩn xác có ý nghĩa rất quan trọng - 2. NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG * Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu - Thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến kết quả của các phép chẩn đoán bệnh - Thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu mẫu, phương pháp cố định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng của môi trường phân lập, thời gian sử dụng của các dung dịch hóa chất sau khi chuẩn bị… đều là những vấn đề cần được cân nhắc trong quá trình phân tích mẫu - Số lần mẫu được đông lạnh rồi rả đông cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích Giữa các phòng thí nghiệm và các phép phân tích được sử dụng phải đồng nhất thì kết quả đạt được mới có ý nghĩa về mặt so sánh * So sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm Các yếu tố cần xem xét khi so sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm bao gồm: - Các dạng kết quả và ý nghĩa của chúng - Phương thức so sánh, ví dụ: - Mật số virus, vs, hàm lượng kháng thể - Giới hạn xác định kết quả dương và âm tính - Độ nhạy của phương pháp (i.e. % kết quả dương tính thật trên số kết quả dương tính) - Tính chuyên biệt (i.e. % kết quả âm tính thật trên số kết quả âm tính) - Các tính toán và đọc kết quả - Các đối chứng * Các vấn đề khác - Cần phải xác lập những giá trị giới hạn cho những phép phân tích mà kết quả thu được có tính định lượng để xác định kết quả âm tính và dương tính 11
- Giá trị giới hạn này sẽ ảnh hưởng đến kết quả âm tính và dương tính giả cũng như kết quả âm tính và dương tính thật - Một phương pháp phân tích mẫu hay thử nghiệm có tính hiệu lực là phương pháp có thể cho ra kết quả phân biệt rõ ràng giữa kết dương tính và âm tính hoặc giữa cá thể bị nhiễm bệnh và không bị nhiễm bệnh - Tính hiệu lực của phương pháp biểu hiện qua hai đặc điểm: + tính nhạy (khả năng xác định chính xác mẫu có nhiễm hay không) + tính chuyên biệt (khả năng phát hiện mẫu không có nhiễm bệnh) Tính hiệu lực của phương pháp được xác định bằng cách so sánh các cá thể cùng loài trong cùng một mẫu. Trong trường hợp khác kết quả phải được kiểm định bằng các kỹ thuật mô học - Tính ổn định của phương pháp Một phương pháp được gọi là ổn định khi phương pháp đó cho ra kết quả tin cậy và giống nhau sau nhiều lần lập lại Hai yếu tố quyết định cho tính ổn định của phương pháp là: + biến động giữa các cá thể phân tích (Intra – subject variation) + biến động giữa các lần đọc kết quả (Inter – observer variation) - Đối chứng: Đối chứng phải được bố trí trong tất cả các phân tích. Bao gồm: + đối chứng dương + đối chứng âm Trong trường hợp các kỹ thuật phân tử phải có đối chứng AND được ly trích, AND của cá thể phân tích và đối chứng PCR * Chẩn đoán lâm sàng Qua chẩn đoán lâm sàng những ảnh hưởng của bệnh được ghi nhận và mô tả: - Từ việc quan sát tông quát - Những thay đổi về tập tính hay hoạt động - Những vết lở loét hay vùng bị tổn thương khác ở bên ngoài - Những quan sát, ghi nhận và mô tả ở mức hiển vi bệnh lý của các nội quan * Những biện pháp sàng lọc Những biện pháp sàng lọc bao gồm tất cả những phương pháp xét nghiệm được áp dụng trên cơ thể sinh vật khỏe nhằm để kiểm tra xem chúng có bị nhiễm những mầm bệnh truyền nhiễm có khả năng gây bệnh về sau hay không * Phát hiện bệnh - Xác định sự hiện diện của nhóm hay loại mầm bệnh nào đó - Xác định mức độ cảm nhiễm (tự nhiên hay nhân tạo) của mầm bệnh trong mẫu phân tích * Chẩn đoán bệnh 12
- Xác định sự hiện diện của mầm bệnh chuyên biệt ở mức loài, chủng hay các dạng biến hóa của mầm bệnh đó - Mức độ cảm nhiễm dù ít hay nhiều của mầm bệnh qua chẩn đoán có ý nghĩa là vật chủ đang bị nguy hiểm - Chẩn đoán bệnh: + chẩn đoán sơ bộ (Presum Diagnosis) - các chẩn đoán bước đầu dựa trên những quan sát tổng quan và những chứng cứ gián tiếp. Qua chẩn đoán sơ bộ thường thấy có nhiều tác nhân gây bệnh + chẩn đoán xác định (Confirmatory Diagnosis) - kết quả xét nghiệm dương tính thật của mầm bệnh với độ tin cậy của phương thức xét nghiệm cao * Các mức độ trong chẩn đoán bệnh thủy sản - Mức độ I: quan sát vật nuôi và môi trường xét nghiệm lâm sàng tổng quát công việc này do cán bộ kỹ thuật, quản đốc… thực hiện - Mức độ II: ký sinh trùng vi khuẩn nấm mô bệnh học công việc này do các cán bộ chuyên môn về KST, VK, nấm, mô bệnh học thực hiện - Mức độ III: virus hiển vi điện tử sinh học phân tử miễn dịch công việc này do cán bộ chuyên môn về virus, hiển vi điện tử, sinh học phân tử, miễn dịch thực hiện - Mức độ IV: trên thế giới chỉ có một vài phòng thí nghiệm thực hiện 3. CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN Phân thành ba dạng chính: quan sát, các kỹ thuật huyết thanh và các kỹ thuật phân tử * Quan sát - Quan sát trực quan và các thủ thuật hiển vi - Các kỹ thuật mô học đặc biệt - Kỹ thuật hiển vi điện tử - Nuôi vi sinh vật Các kỹ thuật quan sát + Quan sát tổng quan 13
+ Kính phết + Mô học Các kỹ thuật mô học đặc biệt + Kỹ thuật nhuộm đặc biệt + Miễn dịch mô hóa học (immunohistochemistry)/ huỳnh quang (immunofluorescent chemistry) Kỹ thuật hiển vi điện tử + Scanning + Transmission Nuôi vi sinh vật + Vi khuẩn + Virus + Ký sinh trùng + Nấm * Các kỹ thuật huyết thanh - Sử dụng kháng thể - Sử dụng kháng nguyên * Những kỹ thuật phân tử - PCR, RT – PCR và qRT – PCR - Mẫu dò (DNA probe) (RFLP và DNA fingerprinting) - Lai tại chỗ (in – situ hybridization) 4. CÁC KỸ THUẬT QUAN SÁT 4.1. CÁC THAO TÁC GIỮ TÔM CÒN SỐNG SAU CHẨN ĐOÁN * Kính phết huyết tương: dùng để kiểm tra hình thái của hồng cầu và sự hiện diện của vi trùng/ký sinh trùng trong máu - Nhân co lại (bệnh vibrio hoặc bệnh đầu vàng) - Nhân bị vỡ và có nhiều thể vùi trong tế bào chất (biểu hiện đặc trưng của sự nhiễm YHV) - Vi bào tử trùng (Microsporidium) cũng thường được tìm thấy trong máu Có thể nhuộm mẫu huyết tương bằng phương pháp nhuộm Gram, nhuộm Wright hay nhuộm Heamatocyline & Eosin (H & E) * Quan sát tiêu bản tươi Bằng cách lấy mẫu của mang, phụ bộ hay bất kỳ bộ phận nào cần quan sát mà không làm chết tôm, cho vào một giọt dung dịch 2,8% NaCl hoặc nước biển vô trùng, đậy bằng lam và quan sát dưới kính hiển vi - Vi khuẩn dạng sợi - Nguyên sinh động vật 14
- Phẩy khuẩn, vi khuẩn hình que - Nấm mycosis, tảo lục và mùn bã hữư cơ Ở những chỗ bị đen dưới vỏ/trong cơ thì dùng dao tiểu phẩu để cắt mẫu và đặt lên phiến kính với một giọt dung dịch 2,8% NaCl. Quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn gây bẩn, nguyên sinh động vật và nấm Furasium * Cố định mang tôm bằng dung dịch HCI Davidson và nhuộm bằng thuốc nhuộm H & E - WSSV, YHV và IHHNV - Vi khuẩn gây bệnh đóng rong - Nguyên sinh động vật và nấm mycosis - Hiện tượng sắc tố 4.2. CÁC THAO TÁC LÀM CHẾT TÔM SAU CHẨN ĐOÁN * Kính phết Chuẩn bị bằng cách lấy mẫu gan tụy, cơ và cơ quan sinh dục đặt lên lam cho vào một giọt cố định Davidson, phết đều, để khô và nhuộm bằng thuốc nhuộm H & E - Phát hiện các thể ẩn MBV/HPV trong trường hợp tôm bị nhiễm nặng - Ngoài ra cũng có thể phát hiện nhóm Vibrio và vi bào tử trùng * Quan sát tiêu bản tươi Cơ quan gan tụy, cơ, cơ quan sinh dục và ruột già cho vào một giọt 2,8% NaCl hoặc nước biẻn vô trùng, đậy bằng lam và quan sát dưới kính hiển vi * Mô bệnh học - Nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào (vi thể) - So sánh đối chiếu các tổn thương với những biểu hiện lâm sàng của vật chủ để tìm hiêu mối quan hệ mật thiết giữa biến đổi hình thái và các rối loạn chức năng làm cơ sở cho việc chẩn đoán - Mô bệnh học là phương pháp xác định các tổn thương ở các mô tế bào dựa trên các thủ thuật nhuộm tế bào và quan sát bằng kính hiển vi. Phương pháp này cho phép người phân tích kết luận tính chất của các vùng tổn thương - So sánh và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngoài là công việc rất cần thiết để có được một chẩn đoán đúng. Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các dữ liệu khác có liên quan đến cá tôm bệnh thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình thái tổn thương của vài bệnh có thể giống nhau và gây nhầm lẫn trong chẩn đoán - Mô bệnh học và những điều cần lưu ý: + Kết quả phân tích mô học có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán bệnh hiển thị quan hệ trực tiếp giữa tá nhân gây bệnh và vật chủ + Khi thực hiện các phân tích mô học cần phải ghi nhận và phân loại những biến đổi về hình thái và cấu tạo ở mức tế bào. Mỗi loại mô, tế bào có những biểu hiện khác nhau với tác nhân gây bệnh - Phương pháp mô học bao gồm các bước: 15
+ cắt lát tế bào + nhuộm + soi kính lát cắt để nhận định kết quả (i) Các giai đoạn tạo lát cắt tế bào (tiêu bản mô học) • Thu mẫu (e.g. theo phương pháp của Lightner, 1996) • Cố định mẫu (theo phương pháp Davidson AFA của Humason, 1972) • Sau đó trữ chúng trong ethy alcohol 50 – 70% • Cắt mẫu • Tách nước • Đúc parafin • Cắt mẫu bằng microtom • Tách parafin ra khỏi lát cắt bằng cách dùng xylen để loại parafin ra khỏi lát cắt (ii) Nhuộm lát cắt bằng phương pháp nhuộm H & E (iii) Soi kính lát cắt và nhận định kết quả 5. CÁC KỸ THUẬT CHẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) * Nguyên tắc - Tất cả các AND polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch AND mới từ mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt (một mồi xuôi và một mồi ngược so với chiều phiên mã của gen) - Mồi là những đoạn AND ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và AND polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới - Nếu hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự AND thì chỉ đoạn AND nằm giữa hai mồi để tổng hợp. Hai mồi này gồm: mồi xuôi và mồi ngược * Ứng dụng Phát hiện mầm bệnh vi khuẩn, virus, ký sinh trùng (Protozoa hay Metazoa) và nấm Có 3 dạng PCR trong chẩn đoán: - Conventional PCR: phát hiện và xác định trình tự của AND virus, vi khuẩn… - Reverse transcriptase PCR: phát hiện và xác định trình tự ARN của virus, vi khuẩn… - Real-time PCR: là dạng biến hóa của PCR được sử dụng để phát hiện trình tự và số lượng AND hoặc ARN của mầm bệnh 16
* Các giai đoạn của PCR - Giai đoạn biến tính (denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử AND được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của chúng, thường là ở 94 - 950C trong vòng 30 giây đến 1 phút - Giai đoạn lai ((hybridization): nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi cho phép các mồi bắt cặp với khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 700C tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 giây đến 1 phút - Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension): nhiệt độ được tăng lên đến 0 72 C giúp cho AND polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian tùy thuộc độ dài của trình tự AND cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút Chu kỳ gồm 3 giai đoạn nói trên sẽ được lập đi lập lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng gấp đôi lượng AND của lần trước. Sau 30 chu kỳ sự khuếch đại sẽ là 106 so với lượng bản mẫu ban đầu 17
* Reverse transcriptase PCR (RT – PCR): men phiên mã ngược (RT) PCR * Phương pháp PCR bao gồm các giai đoạn - Ly trích AND từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn - Chuẩn bị các thành phần của phản ứng (PCR reaction mix) - Khuếch đại bằng máy của chu kỳ nhiệt - Điện di - Đọc kết quả * Đối chứng Một xét nghiệm PCR tiêu chuẩn cần phải có những đối chứng sau: - Không có AND/ARN: phản ứng PCR không có mạch khuôn AND để kiểm soát trường hợp bị tạp nhiễm - ADN/mRNA của vật chủ: để chắc chắn acid nucleic mẫu cũng được khuếch đại và mồi không đặc hiệu với hệ gen của vật chủ - Đối chứng dương: phản ứng PCR có mạch khuôn AND đặc hiệu với mồi 18
* Các hạn chế của phương pháp PCR - Phương pháp PCR thông thường không hoạt động được với những đoạn AND lớn hơn 3 Kb (kết quả tốt với các đoạn AND dưới 1,5 Kb) - Sự ngoại nhiễm do sản phẩm khuếch đại của những lần thao tác trước - Các sai sót gây ra do tạo polymerase (khoảng 10.000 nucleotic thì enzym gắn sai 1 nucleotic) ------------------------- 19