So sánh đặc điểm thực vật và thành phần hóa học ở cây trồng – cây tự nhiên cam thảo đá bia (Jasminanthes TUYETANHIAE T.B.TRAN & Rodda apocynaceae, Asclepiadoideae)

Chia sẻ: Bigates Bigates | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:8

Thêm vào BST

Báo xấu

26
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài được thực hiện với các mục tiêu như sau: Định danh cam thảo đá bia (CTĐB) nuôi cấy mô trồng tại trung tâm nghiên cứu và sản xuất dược liệu miền Trung bằng phương pháp giải trình tự gen, so sánh kết quả với dữ liệu của cây tự nhiên đã công bố. - So sánh đặc điểm vi phẫu các bộ phận: Rễ, thân và lá cây trồng và cây tự nhiên. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học các bộ phận rễ, thân và lá cây trồng (6 tháng) và cây tự nhiên, so sánh thành phần hóa học bằng sắc kí lớp mỏng.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: So sánh đặc điểm thực vật và thành phần hóa học ở cây trồng – cây tự nhiên cam thảo đá bia (Jasminanthes TUYETANHIAE T.B.TRAN & Rodda apocynaceae, Asclepiadoideae)

SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT VÀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC Ở CÂY TRỒNG – CÂY TỰ NHIÊN CAM THẢO ĐÁ BIA (JASMINANTHES TUYETANHIAE T.B.TRAN & RODDA APOCYNACEAE, ASCLEPIADOIDEAE) Phạm Vi Minh Ngọc, Đoàn Minh Châu, Trần Hoàng Hương Thảo, Phạm Thị Cẩm Nhung, Phạm Duy Tú Anh Khoa Dược, Trường Đại học Công nghệ TP. Hồ Chí Minh GVHD: ThS.DS. Thái Hồng Đăng TÓM TẮT Mục tiêu: đề tài được thực hiện với các mục tiêu như sau: - Định danh cam thảo đá bia (CTĐB) nuôi cấy mô trồng tại trung tâm nghiên cứu và sản xuất dược liệu miền Trung bằng phương pháp giải trình tự gen, so sánh kết quả với dữ liệu của cây tự nhiên đã công bố. - So sánh đặc điểm vi phẫu các bộ phận: rễ, thân và lá cây trồng và cây tự nhiên. - Khảo sát ơ bộ thành phần hóa học các bộ phận rễ, thân và lá cây trồng (6 tháng) và cây tự nhiên, so sánh thành phần hóa học bằng sắc kí lớp mỏng. Phương pháp: - Tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá tươi CTĐB giải trình tự hai chiều sản phẩm PCR bằng phương pháp Sanger. Các trình tự sau khi thu nhận được lắp ráp và Blast so sánh với trình tự hai đoạn gen ITS và rbcL của cây tự nhiên. - Rễ, thân, lá được cắt thành tiêu bản mỏng, nhuộm kép. Quan sát, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm qua kính hiển vi. - Ba bộ phận rễ, thân, lá của cây trồng và cây tự nhiên được chiết lần lượt với 3 dung môi có độ phân cực tăng dần là ether, cồn 96% và nước, dùng các dịch chiết trên khảo sát thành phần hóa học và so sánh bằng sắc ký lớp mỏng. Kết quả: đoạn gen ITS, rbcL và thành phần hóa học của cây trồng và cây tự nhiên có nhiều nét tương đồng với nhau, các điểm khác biệt có thể do độ tuổi cây trồng. Kết luận: việc di thực cây tự nhiên từ núi Đá bia về trung tâm nghiên cứu và sản xuất Dược liệu miền Trung ít ảnh hư ng đến đoạn gen ITS và rbcL và thành phần hóa học của cây, cần tiếp tục nghiên cứu theo dõi thành phần hóa học cũng như tác dụng sinh học của cây trong tương lai. Từ khóa: ADN, cam thảo đá bia, Jasminanthes tuyetanhiae, PCR, Sanger, ITS, rbcL, vi phẫu. 683
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cam thảo đá bia (CTĐB) Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda Apocynaceae, Asclepiadoideae [1],[12], trước đâ có tên khoa học là Telosma procumbens (Blanco) Merr. [9], được phát hiện vùng núi Đá Bia (Đ ng Hòa, Phú Yên, Việt Nam) vào những năm 1980. Là dược liệu có vị ngọt và được sử dụng thay thế Cam thảo bắc (Glycyrrhiza glabra L.) trong các bài thuốc dân gian, kể từ khi được công bố, CTĐB bị khai thác triệt để dẫn đến chỉ còn số lượng cá thể rất ít và được xếp vào sách đỏ Việt Nam (EN B1 + 2b) năm 2007 [1]. Hiện nay, Trung tâm nghiên cứu và sản xuất dược liệu miền Trung (TTNCSXDLMT - Tuy Hòa, Phú Yên) đã tiến hành trồng và chăm sóc CTĐB với mục đích bảo tồn loại dược liệu này. Tuy nhiên, việc thay đổi môi trường sống (giữa điều kiện trồng và điều kiện tự nhiên) có thể dẫn đến sự khác nhau về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học của cây. Vì vậy, nghiên cứu “So sánh đặc điểm thực vật và thành phần hóa học ở cây trồng – cây tự nhiên của cây Cam thảo đá bia (Jasminanthes tuyetanhiae T.B.Tran & Rodda Apocynaceae, Asclepiadoideae)” được thực hiện với mục tiêu đánh giá, so sánh sự khác nhau về đặc điểm thực vật và thành phần hóa học giữa cây CTĐB phát triển từ cây nuôi cấy mô và cây tự nhiên nhằm đóng góp vào công tác bảo tồn, phát triển dược liệu CTĐB Việt Nam. 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Mẫu cây CTĐB mọc tự nhiên được thu hái từ hệ sinh thái núi Đá Bia, Đ ng Hòa, Phú Yên vào tháng 08/2017, được định danh về mặt hình thái dựa trên công bố của TS. Trần Thế Bách, lư mẫu tại TTNCSXDLMT Tuy Hòa, Phú Yên. - Mẫu cây CTĐB nuôi cấy mô được cung cấp từ Viện Sinh Học Nhiệt Đới, Thủ Đức Thành phố Hồ Chí Minh và được trồng 6 tháng tại TTNCSXDLMT Tuy Hòa, Phú Yên. (a) (b) Hình 1. Hình ảnh cây trồng (a) và cây tự nhiên (b) Hình 2. Cây CTĐB nuôi cấy mô 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân tích vi phẫu Rễ, thân, lá cắt thành lát mỏng và nhuộm tiêu bản bằng phương pháp nhuộm kép [3]. Quan sát, mô tả và chụp ảnh các đặc điểm qua kính hiển vi. 684
2.2.2 Định danh bằng phương pháp giải trình tự gen Mẫu lá CTĐB được xử lý và giải trình tự gen theo các bước mô tả như sau: Bảng 1. Quy trình giải trình tự gen Thu nhận ba mẫu lá của cây cam thảo đá bia trồng tại trung tâm ↓ Tách chiết DNA tổng số bằng PP Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) [7], [8] ↓ Thực hiện phản ứng PCR (đoạn mồi ITS1-ITS4 và rbcL) [5], [6], [10], [13] ↓ Tinh sạch sản phẩm PCR ↓ Giải trình tự theo phương pháp Sanger [11] ↓ Xử lý thành phẩm và thu nhận đoạn gen ↓ Truy cập ngân hàng gen NCBI ↓ 2.2.3 Sắc ký lớp mỏng Dịch chiết methanol của 3 mẫu rễ, thân, lá cây trồng và cây tự nhiên được chấm đồng lượng trên bản mỏng silicagel GF254 và được khai triển sắc ký với hệ dung môi cloroform- methanol-mước (65:35:10, lớp dưới), phát hiện bằng thuốc thử acid sulfuric 10% trong cồn. Sắc ký đồ được dùng để đánh giá sự giống và khác nhau về thành phần hóa học của các bộ phận cây trồng và cây tự nhiên. 2.2.4 Khảo sát thành phần hóa học Các bộ phận rễ, thân, lá của mẫu cây trồng và cây tự nhiên xay thành bột, chiết theo thứ tự: ether, cồn 96% và nước. Dùng các dịch chiết khảo sát ơ bộ và so sánh thành phần hóa học [2] giữa 2 mẫu. 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 So sánh vi phẫu rễ, thân, lá của cây trồng và cây tự nhiên Các mẫu vi phẫu rễ, thân, lá của cây trồng và cây tự nhiên sau khi được cắt thành lát mỏng, nhuộm kép và soi dưới kính hiển vi với độ phân giải 40x thu được kết quả dưới đâ : 3.1.1 Vi phẫu rễ Vi phẫu rễ CTĐB của cây trồng và cây tự nhiên được trình bày trong Hình 3 có các đặc điểm tương đồng như sau (từ ngoài vào trong): bần gồm các lớp tế bào hình chữ nhật vách uốn lượn. Kế tiếp là lớp mô mềm với những tế bào hình bầu dục, kích thước không đều; có 1 lớp 685
nội bì đai caspary giữa, ngăn cách lớp mô mềm vỏ và libe. Libe 2 tạo thành vòng quanh gỗ, 3-5 lớp tế bào hình đa giác hay chữ nhật, vách cellulose uốn lượn, xếp thành dãy xuyên tâm. Gỗ 2 chiếm tâm; mạch gỗ 2 hình đa giác, xếp lộn xộn. Ngoài ra còn có các tế bào mô cứng và tinh thể calci oxalat hình cầu gai rải rác trong mô mềm vỏ. Hình 3. Vi phẫu rễ cây trồng (bên trái) và rễ cây tự nhiên (bên phải): 1. Bần; 2. Mô mềm vỏ; 3. Tinh thể calci oxalat; 4. Tế bào mô cứng; 5. Nội bì đai Ca pari . Libe 2; 7. Gỗ 2 3.1.2 Vi phẫu thân Vi phẫu thân CTĐB của cây trồng và cây tự nhiên được trình bày trong Hình 4 có các đặc điểm tương đồng như sau (từ ngoài vào trong): bần gồm các lớp tế bào hình chữ nhật, vách tẩm bần và hơi uốn lượn. Kế tiếp là mô dày góc gồm 3 lớp tế bào hình đa giác kích thước không đều. Bên dưới lớp mô dày là mô mềm vỏ với nhiều lớp tế bào hình bầu dục, kích thước không đều, vách cellulose, xếp lộn xộn. Nằm rải rác trong mô mềm vỏ là các tinh thể calci oxalat hình cầu gai và tế bào mô cứng hình bầu dục, kích thước không đều, vách tẩm chất gỗ. Libe 2 gồm 3-5 lớp tế bào hình đa giác hay chữ nhật, vách cellulose rất uốn lượn, xếp thành dãy xuyên tâm. Ngay sát bên dưới libe 2 là gỗ 2; mạch gỗ 2 tế bào hình đa giác, vách tẩm chất gỗ, kích thước không đều; mô mềm gỗ 2 hình đa giác, vách tẩm gỗ, xếp thành dãy xuyên tâm với mô mềm libe 2. Phần tủy trong cùng là lớp libe quanh tủy xếp thành cụm. Mô mềm tủy là tế bào hình gần tròn, vách cellulose, kích thước không đều, xếp lộn xộn. Hình 4. Vi phẫu thân cây trồng (bên trái) và thân cây tự nhiên (bên phải): 1. Lớp bần; 2. Mô dày; 3. Tinh thể calci oxalat; 4. Mô mềm vỏ; 5. Tế bào mô cứng; 6. Libe 2; 7. Gỗ 2; 8. Libe quanh tủy; 9. Mô mềm tủy 686
3.1.3 Vi phẫu lá Vi phẫu lá CTĐB của cây trồng và cây tự nhiên được trình bày trong Hình 5 có các đặc điểm tương đồng như sau (từ ngoài vào trong): Ở ngoài cùng có lớp biểu bì trên và biểu bì dưới có hình dạng và kích thước giống nhau, gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật nằm hay đa giác. Nằm rải rác trên lớp biểu bì dưới là các lông che ch đa bào. Bên dưới lớp biểu bì là lớp mô dày trên gồm 2-3 lớp tế bào và mô dày dưới gồm 3-4 lớp tế bào hình gần tròn, kích thước không đều, kiểu mô dày tròn. Mô mềm tế bào hình tròn hoặc đa giác, kích thước không đều, xếp lộn xộn. Gỗ nằm trên và libe nằm dưới, trên gỗ có libe quanh tủy xếp thành hình cung gần liên tục. Mạch gỗ 1 có vách tẩm gỗ. Libe 1 là các tế bào hình đa giác, vách cellulose uốn lượn, kích thước nhỏ, xếp lộn xộn thành cụm. Libe quanh tủy xếp thành cụm và có cấu tạo giống libe 1. Ngoài ra, còn có các tinh thể calci oxalat hình cầu gai rải rác trong mô mềm. Hình 5. Vi phẫu vùng gân giữa lá cây trồng (bên trái) và lá cây tự nhiên (bên phải): 1. Biểu bì trên; 2. Mô dày trên; 3. Mô mềm vỏ; 4. Libe tủy; 5. Gỗ 1; 6. Libe 1; 7. Tinh thể calci oxalat . M dà dưới; 9. Biể bì dưới; 10. Lông che ch 3.2 Định danh bằng hương pháp giải trình tự gen Kết quả chiết tách và khuếch đại đoạn gen bằng kỹ thuật PCR thu được đoạn gen ITS1- ITS4 (~840 bp) và rbcL (~600 bp) của mẫu cây trồng (TR) (Hình 6). Hai đoạn gen này được giải trình tự bằng phương pháp Sanger [10] sau đó BLAST đối chiếu trình tự với mẫu CTĐB tự nhiên (TN) đã công bố trên Genbank [4]. Kết quả được trình bày Bảng 2 và Hình 6 dưới đâ : Hình 6. Kết quả PCR mồi ITS1 – ITS4 (bên trái) và Kết quả PCR mồi rbcL (bên phải) 687
Bảng 2. Kết quả so sánh trình tự gen ITS và rbcL cây trồng và cây tự nhiên Mã truy cập cây tự nhiên Mẫu so sánh Mức độ bao phủ (%) Tỷ lệ tương đồng (%) Jasminanthes tuyetanhiae TR1-ITS 86 97,61 isolate TN1 (MT084410.1) TR2-ITS 85 98,13 TR3-ITS 83 98,13 TN1-rbcL (MT089916.1) TR1-rbcL 98 100,00 TR2-rbcL 99 99,44 TR3-rbcL 99 100,00 Nhận xét: các đoạn ITS mẫu cây trồng khi so sánh với đoạn TN1-ITS của Jasminanthes tuyetanhiae trên Genbank (mã truy cập MT084410.1) cho tỷ lệ bao phủ từ 83 - 86% và mức độ tương đồng 97,6-98,1%. Kết quả của đoạn gen rbcL so sánh với đoạn TN1-rbcL của Jasminanthes tuyetanhiae trên NCBI (mã truy cập MT089916.1) cho tỷ lệ bao phủ từ 98 - 99% và mức độ tương đồng 99,44-100%. Như vậy, từ kết quả trên cho thấy: có sự tương đồng về gen ITS và gen rbcL giữa mẫu cây trồng tại trung tâm khi so sánh với mẫu cây tự nhiên. 3.3 So sánh thành phần hóa học giữa cây trồng và cây tự nhiên 3.3.1 Sắc ký lớp mỏng Hình 7. Sắc k đồ mẫu rễ, thân, lá cây trồng và cây tự nhiên Hình ảnh đối chiếu sắc ký giữa mẫu rễ, thân, lá cho thấy, các chất phân cực Rf (0-0,25) mẫu rễ và thân hoàn toàn giống nhau, lá có thành khác biệt so với thân và rễ, đa dạng và nhiều vết hơn so sánh giữa mẫu cây TR và cây TN cho thấy, mẫu rễ và thân lại có sự khác nhau, còn mẫu lá thì có sự tương đồng. Ở Rf (0,25-0,5), thành phần hóa học có sự tương đồng mẫu lá của cây TR và cây TN, nhưng lại khác nhau mẫu rễ và thân. Hai đoạn cuối là Rf (0,5-0,75) và Rf (0,75-1) thì thành phần hợp chất có sự giống nhau giữa cây TR và cây TN mẫu rễ và khác so với mẫu thân và lá. 3.3.2 Phương pháp hóa học Các dịch chiết ether, cồn cao độ và nước của cây trồng (TR) và cây tự nhiên (TN) 3 mẫu rễ, thân, lá được thực hiện định tính bằng các thuốc thử và có kết quả Bảng 3 như sau: 688
Bảng 3. Bảng kết quả so sánh thành phần hóa học của 3 mẫu rễ, thân, lá Mẫu rễ Mẫu thân Mẫu lá Nhóm hợp chất Tự Tự Tự Trồng Trồng Trồng nhiên nhiên nhiên Tinh dầu + Triterpenoid tự do + + Alkaloid + + + + + + Coumarin + + + + + + Flavonoid + Triterpenoid thủy phân + + + + Saponin + + + + + + Chất khử + + Hợp chất polyuronic + + + Chú thích: (+) Dương tính Nhìn chung, thành phần hóa học trong cây TR và cây TN 3 mẫu rễ, thân, lá đều có Alkaloid và Coumarin và Saponin. Tuy nhiên trong cây TN mẫu rễ, thân, lá lại có thêm thành phần hợp chất Polyuronic, đặc biệt mẫu lá còn có Tinh dầu, Triterpenoid tự do và thủy phân. Mặt khác, trong cây TR 3 mẫu đều có sự hiện diện của hợp chất Triterpenoid thủy phân và chất khử (trừ mẫu thân), riêng mẫu lá có thêm Flavonoid. 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua việc khảo sát vi phẫu ba bộ phận rễ, thân, lá cây TR và TN cho thấy giữa cây TR và cây TN có sự giống nhau về tất cả các bộ phận quan sát được. Đề tài củng cố đặc điểm định danh thực vật bằng phương pháp định danh gen, kết quả thu được mức độ sự tương đồng đoạn gen ITS và rbcL với tỷ lệ trên 98% giữa cây TR so với TN cho thấy không có các thay đổi về đặc điểm thực vật và di truyền từ quá trình di thực. Dựa vào kết quả sắc ký lớp mỏng và phản ứng hóa học cho thấy thành phần hóa học mẫu lá cây TR (6 tháng tuổi) và cây TN có sự tương đồng nhiều hơn so với mẫu rễ và thân bao gồm các hợp chất như: alkaloid, coumarin, triterpenoid thủy phân và saponin; nhưng cây TN có thêm hợp chất triterpenoid tự do và polyuronic mà cây trồng không có. Từ những kết luận trên, ta thấy rằng việc di thực cây TN trên núi Đá bia về Trung tâm nuôi trồng trong điều kiện có kiểm soát môi trường ít ảnh hư ng đến đoạn gen đã khảo sát và thành phần hóa học của cây. 4.2 Kiến nghị Vì mẫu cây CTĐB trong đề tài được trồng chỉ mới 6 tháng nên cần tiếp tục theo dõi đặc điểm thực vật, thành phần hóa học theo thời gian sinh trư ng của cây trồng.Thử nghiệm các tác dụng dược lý in vitro, in vivo; nghiên cứu bào chế sản phẩm mới từ nguồn nguyên liệu cây trồng. 689
TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Bộ Khoa học và Công Nghệ (2007) Sách đỏ Việt Nam phần II - thực vật, NXB. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, trang 14. [2] Nguyễn Văn Đàn Ng ễn Viết Tự (1 5) Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, Nhà xuất bản Y học, trang 1-20. [3] Nguyễn Viết Thân, (2003), Kiếm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, NXB khoa học và kỹ thuật, trang. 13-20. [4] Thái Hồng Đăng & cộng sự, (2020), "Xây dựng đặc điểm vi học và mã vạch ADN phục vụ định danh cây cam thảo đá bia." Bản B của Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam 62.12 [5] Asmaa Elframawy H D, Ranya El-Bakatoushi,, (1990), "Genetic Variation among Fragmented Populations of Atriplex halimus L. Using Start Codon Targeted (SCoT) and ITS1-5.8S-ITS2 Region Markers", American Journal of Molecular Biology 18 (1), pp. 315-322. [6] Fazekas AJ, Burgess KS K P, Graham SW, Newmaster SG e a, (2008), PLos One, 3 (7), pp. 1-12. [7] Huiling Di at al., (2014), "Rapid Detection of Genetically Modified Ingredients in Soybean Products by Real-Time Loop-Mediated Isothermal Amplification", 2 (7), pp. 363-368. [8] Jeff J Doyle, Jane L Doyle, (1987), "A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue", 19 (1), pp. 11-15. [9] Michele Rodda, (2019), "A revision of Jasminanthes (Apocynaceae) with four new species from Borneo", Phytotaxa, 405 (3), pp. 127–146. [10] Priyanka Mishra, (2016), "DNA barcoding: an efficient tool to overcome authentication challenges in the herbal market", Plant Biotechnology Journal, 14 pp. 8-21. [11] Sanger F. N S, Coulson A. R, , (1977), "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors", Proceedings of the national academy of sciences, 74 (12), pp. 5463-5467. [12] The Bach Tran, (2018), "Jasminanthes tuyetanhiae (Apocynaceae, Asclepiadoideae), a New Species from Vietnam, and J. pilosa New for Vietnam", 55 (1-3), pp. 163-169. [13] Dhivya Selvaraj Et.Al, (2014), "Evaluation of DNA barcode candidates for the discrimination of the large plant family Apocynaceae", Originl Artical, Plant Syst Evol, 10.1007/s00606-014-1149-y pp. 690