Sự hiện diện của Porcine Parvovirus 1 (PPV1) ở lợn nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận

Chia sẻ: ViBandar2711 ViBandar2711 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

44
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Nghiên cứu này đã tìm hiểu sự có mặt của PPV1 ở nhóm lợn giai đoạn nuôi thịt tại Hà Nội và vùng phụ cận bằng phản ứng huyết thanh học, PCR và phân tích trình tự gen. Kết quả cho thấy 88,2% (60/68) mẫu huyết thanh có kháng thể kháng PPV1, với 18/60 mẫu có kháng thể ở mức cao (HI >1/512).

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Sự hiện diện của Porcine Parvovirus 1 (PPV1) ở lợn nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận

Vietnam J. Agri. Sci. 2020, Vol. 18, No. 7: 495-503 Tạp chí Khoa học Nông nghiệp Việt Nam 2020, 18(7): 495-503 www.vnua.edu.vn SỰ HIỆN DIỆN CỦA PORCINE PARVOVIRUS 1 (PPV1) Ở LỢN NUÔI TẠI HÀ NỘI VÀ VÙNG PHỤ CẬN Nguyễn Văn Giáp, Mai Thị Ngân, Lê Văn Trường, Vũ Thị Ngọc, Võ Văn Hiểu, Tạ Thị Kim Chung, Vũ Đức Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ* Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: huynhtmle@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 19.05.2020 Ngày chấp nhận đăng: 24.06.2020 TÓM TẮT Porcine Parvovirus (PPV1) là một trong những nguyên nhân chính gây rối loạn sinh sản ở lợn nái và là một yếu tố kích hoạt trong cơ chế sinh bệnh của Porcine circovirus type 2. Ở Việt Nam, sự hiện diện và vai trò gây rối loạn sinh sản của PPV1 đã được chứng minh, nhưng vẫn còn ít công bố về PPV1. Nghiên cứu này đã tìm hiểu sự có mặt của PPV1 ở nhóm lợn giai đoạn nuôi thịt tại Hà Nội và vùng phụ cận bằng phản ứng huyết thanh học, PCR và phân tích trình tự gen. Kết quả cho thấy 88,2% (60/68) mẫu huyết thanh có kháng thể kháng PPV1, với 18/60 mẫu có kháng thể ở mức cao (HI >1/512). Hiện tượng virus huyết khá phổ biến khi phát hiện được ở 10/18 mẫu, với đặc điểm không phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể kháng PPV1. Kết quả giải mã một phần gen NS1 cho biết 10 chủng PPV1 của Việt Nam thuộc nhóm di truyền 1. Cùng với các nghiên cứu khác, kết quả này cho thấy sự lưu hành của PPV1 ở lợn nuôi tại Việt Nam. Từ khóa: Porcine Parvovirus 1, phát hiện virus, đặc điểm sinh học phân tử. Investigating the Presence of Porcine Parvovirus 1 (PPV1) in Pigs in Hanoi and Neighboring Provinces ABSTRACT Porcine Parvovirus (PPV1) is one of the main pathogens inducing reproductive failure in sows. PPV1 is also known as a triggering factor of porcine circovirus type 2. In Vietnam, the presence of PPV1 and its association with reproductive disorders of sows had been confirmed. However, few publications are available on this topic. This study investigated the occurrence of PPV1 in growing pigs risen in Hanoi and neighboring provinces by serology test, PCR and genetic analysis. It was revealed that 88.2% (60/68) sera contained detectable antibodies against PPV1. Of these, 18/60 sera had high antibody titres (HI >1/512). The viremia was detected at a high frequency (10 out of 18 tested sera) and was uncorrelated with the level of antibody titers against PPV1. The genetic analysis based on the partial NS1- protein-coding gene showed that 10 PPV1 field strains were within genogroup 1. In combination with the other studies, the current result supported that PPV1 is circulating in pigs in Vietnam. Keywords: Porcine Parvovirus 1, virus detection, molecular characterization. Alborali, 2012). PPV1 là mût trong nhąng mæm 1. ĐẶT VẤN ĐỀ bệnh gây røi loän sinh sân đã đāợc biết đến tĂ Røi loän sinh sân Ċ lợn do nhiều nguyên rçt sĉm (Mayr & cs., 1968). Ngày nay, PPV1 còn nhån gåy ra, trong đò nhòm virus gåy bệnh đāợc biết đến nhā là mût yếu tø kích hoät trong thāĈng gặp g÷m: Porcine reproductive and sinh bệnh hõc cþa hûi chăng còi cõc Ċ lợn sau cai respiratory syndrome virus (PRRSV), Classical sąa do PCV2 gây ra (Ellis & cs., 2000). swine fever virus (CSFV), Porcine parvovirus 1 Về phân loäi, PPV1 thuûc hõ Parvoviridae, (PPV1), Porcine circovirus type 2 (PCV2), là mût ADN virus sợi đćn dài khoâng 5kb (Ranz Porcine pseudorabies virus (PRV),... (Pozzi & & cs., 1989). Đến nay, ngāĈi ta đã phát hiện 495
Sự hiện diện của Porcine Parvovirus 1 (PPV1) ở lợn nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận thêm mût sø loäi parvovirus mĉi Ċ lợn, ký hiệu tĂ nuôi vĉi quy mô >100 và ≤100 lợn thðt. Trong PPV2 đến PPV7. Khác vĉi PPV1 (thuûc giøng nëm 2017, đã cò 68 méu huyết thanh đāợc lçy Ċ Protoparvovirus), 6 loäi parvovirus phát hiện 21 trang träi thuûc 6 đða phāćng là Hà Nûi, trong vñng 10 nëm trĊ läi đåy thuûc giøng Hāng Yên, Hâi Dāćng, Bíc Ninh, Hòa Bình và Tetraparvovirus (PPV2- PPV3), Copiparvovirus Vïnh Phýc. (PPV4- PPV6) và Chapparvovirus (PPV7) (Cadar - Chþng PPV1 thuæn khiết, vô hoät đāợc & cs., 2012; Xing & cs., 2018). Về cçu trúc, bû gen cung cçp bĊi Bû môn Vi sinh vêt - Truyền nhiễm, PPV1 cò 2 khung đõc mĊ (ORF) chính mã hóa Khoa Thú y, Hõc viện Nông nghiệp Việt Nam. cho protein phi cçu trúc NS1 và protein cçu trúc - H÷ng cæu chuût lang 10% và 1% pha trong (VP1 và VP2) (Ranz & cs., 1989; Bergeron & cs., dung dðch PBS1x 1993). Gen mã hòa NS1 thāĈng bâo thþ hćn do cò - Đïa nhĆa 96 giếng đáy chą V tøc đû đût biến thçp hćn khoâng 10 læn so vĉi gen mã hóa protein cçu trúc (Ren & cs., 2013). Trong - M÷i phát hiện PPV1 và giâi mã gen đāợc các nghiên cău về đặc điểm sinh hõc phân tĄ và chõn theo nghiên cău trāĉc đåy (Xu & cs., 2012). xây dĆng cây phát sinh chþng loäi, các tác giâ Trình tĆ 5’-3’ nhā sau: PPVF-AGTTAGAAT trên thế giĉi có thể dùng toàn bû genome (Oh & AGGATGCGAGGAA và PPVR-AGAGTCTGT T cs., 2017), vùng gen mã hóa protein (Ren & cs., GGTGTATTTATTGG. 2013) hoặc gen mã hóa VP2 và/hoặc NS1 (Hao & - Hóa chçt dùng tách chiết ADN tùng sø cs., 2011). Theo đò, PPV1 đāợc phân chia thành 3 g÷m: dung dðch ly giâi méu có chăa 27% (Ren & cs., 2013) hoặc 4 nhóm di truyền (Hao & sucrose, 15mM trisodium citrate, 0,15M sodium cs., 2011). chloride, 1mM ethylene diaminetetraacetic acid, Ở Việt Nam, vai trò gây bệnh cþa PPV1 đã 1% sodium dodecyl sulphate, 200 µg/ml đāợc biết đến khá sĉm, tĂ nhąng nëm 1990 (H÷ proteinase K; phenol-chloroform-isoamyl Đình Chýc & cs., 1995). Trong mût thĈi gian dài, alcohol (25:24:1); isopropyl; c÷n 70% và đệm TE các vçn đề liên quan tĉi PPV1 ít đāợc quan tâm (pH = 8). nghiên cău. Gæn đåy, kết quâ khâo sát sĆ lāu - Kít PCR (Maxime PCR PreMix i-Taq, hành cþa các genotype parvovirus Ċ khu vĆc 25025, iNtRON, Hàn Quøc). miền Trung tiếp tĀc khîng đðnh sĆ hiện diện cþa - Hóa chçt dùng phân tích sân phèm PCR genotype 1 (PPV1) Ċ lợn vĉi tỷ lệ phát hiện virus g÷m: agarose (Agarose EP Master, Biosesang, là 52,7% (Nguyen Tran Trung & cs., 2019). Hàn Quøc); RedSafe Nucleic Acid Staining Nhìm làm rô hćn về sĆ lāu hành cþa PPV1 Ċ lợn Solution (21141, iNtRON, Hàn Quøc) và 100bp nuôi täi Việt Nam, nghiên cău này đã đāợc thĆc DNA ladder (DM001-R500, GeneDireX hiện nhìm xác đðnh sĆ có mặt cþa PPV1 Ċ đàn Inc., Anh). lợn nuôi täi Hà Nûi và vùng phĀ cên. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phát hiện kháng thể kháng PPV1 2.1. Nội dung nghiên cứu SĆ có mặt cþa kháng thể kháng PPV1 trong huyết thanh lợn đāợc phát hiện bìng phân ăng - Xác đðnh sĆ có mặt cþa kháng thể kháng ngën trĊ ngāng kết h÷ng cæu (HI), thĆc hiện PPV1 và PPV1 trong méu huyết thanh lợn thðt. theo mô tâ trāĉc đåy (Joo & cs., 1976), sĄ dĀng - Tìm hiểu đặc điểm sinh hõc phân tĄ gen h÷ng cæu chuût lang 1% và vĉi mût sø hiệu mã hóa protein NS1 cþa các chþng PPV1. chînh. CĀ thể, để loäi bó yếu tø gåy ngāng kết h÷ng cæu, tiến hành þ huyết thanh xét nghiệm 2.2. Vật liệu vĉi h÷ng cæu chuût lang 10% theo tỷ lệ 1:1, để - Huyết thanh cþa lợn thðt trong giai đoän qua đêm Ċ 4C. Méu đāợc coi là chuyển dāćng 40 đến 80 ngày tuùi. Méu đāợc lçy Ċ các hû chën tính huyết thanh hõc (dāćng tính) nếu Ċ đû pha 496
Nguyễn Văn Giáp, Mai Thị Ngân, Lê Văn Trường, Vũ Thị Ngọc, Võ Văn Hiểu, Tạ Thị Kim Chung, Vũ Đức Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ loãng >1/8 ngën trĊ hoàn toàn hiện tāợng ngāng (i) phāćng pháp xây dĆng cây phát sinh chþng kết h÷ng cæu (Oravainen & cs., 2005). Cÿng loäi là maximum likelihood; (ii) mô hình mô theo nghiên cău trāĉc đåy, hiệu giá HI 1/512 phóng sĆ thay đùi nucleotide giąa các trình tĆ đāợc chõn làm møc để xác đðnh méu có hiệu giá gen đāợc lĆa chõn tĆ đûng bìng câu lệnh “-m kháng thể Ċ măc cao (HI >1/512) và Ċ măc thçp TEST”; (iii) măc tin cêy Ċ các nhánh cþa cây (1/16≤ HI ≤1/512) (Oravainen & cs., 2005). phát sinh chþng loäi đāợc āĉc tính theo phāćng pháp transfer bootstrap expectation (Lemoine & 2.3.2. Tách chiết ADN cs., 2018), vĉi phép thĄ bootstrap lặp 1.000 læn. (i) Ly giâi méu: 250µl huyễn dðch méu bệnh Các trình tĆ tham chiếu đāợc chõn theo công bø phèm đāợc trûn đều trong 500µl dung dðch trāĉc đåy (Hao & cs., 2011; Chung & cs., 2020). sucrose/proteinase K; þ Ċ 56C/90 phút. (ii) Tách Chāćng trình iTOL (Letunic & Bork, 2019) đāợc pha ADN bìng phenol-chloroform-isoamyl düng để chú thích cây phát sinh chþng loäi. (25:24:1) bìng cách bù sung 200µl dung dðch PCI vào øng méu sau khi ly giâi, vortex hún hợp 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN và ly tâm 12.000 vòng/phút/15 phút, Ċ nhiệt đû 3.1. Phát hiện kháng thể kháng PPV1 4C. (iii) Tþa ADN: dùng øng Eppendorf mĉi, trûn 450μl isopropyl và 450μl dðch nùi phía trên, Trong 68 méu huyết thanh lợn thðt xét trûn đều; sau đò tþa ADN Ċ -20C/15 phút; thu nghiệm, có 60/68 méu (88,2%) dāćng tính vĉi tþa bìng ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 phút, Ċ kháng thể kháng PPV1 (hiệu giá HI ≥ 1/16). Kết nhiệt đû 4C. (iv) RĄa tþa ADN bìng 1ml c÷n quâ biểu diễn Ċ hình 1 cho thçy biên đû dao 70%; thu tþa bìng ly tâm, 12.000 vòng/phút/15 đûng hiệu giá kháng thể rûng, tĂ 1/16-1/4096. phút, Ċ nhiệt đû 4C; sau đò loäi bó hết c÷n và CĀ thể, 60 méu dāćng tính đāợc xếp vào nhóm hong khô Ċ nhiệt đû phòng trong 15 phút. (v) có măc hiệu giá cao (18/60 méu, 30%) và nhóm Hòa tan tþa ADN trong 30µl đệm TE (pH = 8,0). có măc hiệu giá thçp (42/60 méu, 70%). Mût kết quâ nghiên cău công bø nëm 2012 2.3.3. Phương pháp PCR phát hiện PPV1 cho biết kháng thể thĀ đûng kháng PPV1 Phân ăng PCR đāợc phøi trûn theo hāĉng truyền qua sąa đæu chî t÷n täi trong vòng 1 dén cþa nhà sân xuçt, m÷i đặc hiệu đāợc dùng Ċ tháng và hiện tāợng chuyển dāćng tính huyết n÷ng đû cuøi cùng là 0,5pM cho múi m÷i xuôi- thanh hõc Ċ lợn giai đoän nuôi thðt là kết quâ m÷i ngāợc. Chu trình nhiệt g÷m: tiền biến tính đáp ăng miễn dðch chþ đûng chøng läi sĆ phći 94C/5 phút; lặp läi 35 læn chu trình nhiệt sau: nhiễm PPV1 tĆ nhiên (Stojanac & cs., 2012). biến tính 94C/30 giây, gín m÷i 57,1C/20 giây, DĆa vào kết quâ dāćng tính huyết thanh hõc kéo dài 72C/30 giây. Phân tích sân phèm PCR (Hình 1), có thể suy luên hiện tāợng phći nhiễm bìng phāćng pháp điện di trong thäch agarose PPV1 là khá phù biến Ċ khu vĆc lçy méu. PPV1 2%, có bù sung RedSafeNucleic Acid Staining là virus có mặt phù biến Ċ lợn, tuy nhiên tỷ lệ Solution 1x. dāćng tính là khác nhau giąa các nāĉc (Saekhow & Ikeda, 2015; Chung & cs., 2020). Ở 2.3.4. Phân tích trình tự nucleotide của PPV1 Việt Nam, kết quâ khâo sát Ċ mût sø tînh miền Phân tích biến đûng măc tāćng đ÷ng dõc Trung bìng phāćng pháp PCR đã phát hiện theo chiều dài gen mã hóa protein NS1 cþa 52,7% huyết thanh lợn thðt có PPV1 (Nguyen PPV1 đāợc thĆc hiện bìng phân phæn mềm Tran Trung & cs., 2019). Do vêy, tỷ lệ dāćng SimPlot (Lole & cs., 1999) vĉi các tham sø mặc tính huyết thanh hõc cao cþa nhóm lợn thðt đðnh. Møi quan hệ di truyền cþa PPV1 đāợc xây trong nghiên cău này là có thể giâi thích. dĆng dĆa trên mût phæn trình tĆ gen mã hóa 3.2. PCR phát hiện PPV1 trong mẫu protein NS1 (tĂ nucleotide 1470-1733). Phæn huyết thanh mềm IQTREE phiên bân 1.6.2 (Nguyen & cs., 2015) đāợc düng để xây dĆng cây phát sinh Mût sø nghiên cău cho thçy sĆ có mặt cþa chþng loäi vĉi các tham sø đæu vào nhā sau: PPV1 trong máu không phĀ thuûc vào hàm 497
Sự hiện diện của Porcine Parvovirus 1 (PPV1) ở lợn nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận lāợng kháng thể đặc hiệu kháng PPV1 (Streck phát hiện hiện tāợng virus huyết bìng phāćng & cs., 2011; Dias & cs., 2013). Trong khuôn khù pháp PCR. Kết quâ PCR xác đðnh PPV1 trong cþa nghiên cău, chúng tôi chõn Ċ múi tînh 3 méu huyết thanh đāợc minh hõa Ċ hình 2 và méu huyết thanh có hiệu giá HI khác nhau để tùng hợp Ċ bâng 1. 16 14 12 10 Số mẫu 8 6 4 2 0 4096 2048 1024 512 256 128 64 32 16 Mức cao Mức thấp Hiệu giá HI (1/x) Hình 1. Hiệu giá kháng thể kháng PPV1 ở mẫu huyết thanh lợn thịt 5 6 M 7 8 (-) (+) ** * > > > > Ghi chú: M là thang ADN chuẩn với khoảng cách giữa các vạch là 100bp. Các mẫu huyết thanh xét nghiệm được bố trí ở giếng số 5 đến số 8. Các vạch sản phẩm PCR không đặc hiệu được đánh dấu “*”, “**”.Vạch sản phẩm đặc hiệu (265 bp) được đánh dấu bởi ký hiệu “>”. Hình 2. Minh họa kết quâ phân ứng PCR phát hiện PPV1 498
Nguyễn Văn Giáp, Mai Thị Ngân, Lê Văn Trường, Vũ Thị Ngọc, Võ Văn Hiểu, Tạ Thị Kim Chung, Vũ Đức Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ Kết quâ Ċ hình 2 cho biết, Ċ các méu Ċ giếng chën nuöi khác nhau và khöng phĀ thuûc vào sø 5, 6 và 7 xuçt hiện väch đặc hiệu vĉi kích hàm lāợng kháng thể dðch thể đặc hiệu (Streck thāĉc 265bp. Méu Ċ giếng sø 8 xuçt hiện mût sø & cs., 2011). Nhên xét này cho thçy sĆ cæn thiết väch PCR cò kích thāĉc khöng đặc hiệu và đāợc kết hợp phāćng pháp huyết thanh hõc và đánh giá là âm tính. Tùng hợp kết quâ PCR phāćng pháp PCR trong nghiên cău sĆ lāu phát hiện PPV1 đāợc trình bày Ċ bâng 1. hành virus. Mặc dù vêy, hän chế cþa nghiên cău hiện thĈi là chāa xét nghiệm đāợc toàn bû sø Có 10/18 méu huyết thanh xét nghiệm méu huyết thanh lợn thðt bìng phân ăng PCR, dāćng tính và 8/18 méu âm tính vĉi PPV1. Các nên không thể kết luên đæy đþ về hiện tāợng méu dāćng tính thu thêp Ċ 5 trang träi täi 4 nhiễm virus huyết. tînh là Vïnh Phýc, Bíc Ninh, Hāng Yên và Hâi Dāćng (Bâng 1). Nhā vêy, câ phân ăng huyết 3.3. Phân tích trình tự gen mã hóa thanh hõc và PCR đều phát hiện sĆ lāu hành protein NS1 PPV1 Ċ lợn giai đoän nuôi thðt (nhóm lợn không bao giĈ đāợc vacxin phòng bệnh do PPV1). Kết Đặc điểm cþa các chþng PPV1 phát hiện quâ phån tích phāćng sai (ANOVA) cho thçy trong nhóm méu xét nghiệm đāợc nghiên cău hiệu giá HI giąa nhóm có virus huyết (PCR såu hćn dĆa vào phân tích trình tĆ gen. Trên cć dāćng tính) và nhóm không có virus huyết (PCR sĊ phân tích măc tāćng đ÷ng nucleotide dõc âm tính) không có sĆ khác biệt (giá trð F lý chiều dài gen mã hóa protein NS1 cþa các chþng thuyết = 1,59< FthĆc nghiệm Ċ măc P = 0,22>0,05). PPV1 trên thế giĉi, đã xác đðnh đæu 3’ cþa gen Kết quâ trên phù hợp vĉi kết luên: PPV1 lāu NS1 (tĂ nucleotide 1400 trĊ đi) cò măc tāćng hành Ċ lợn đāợc nuöi dāĉi nhiều phāćng thăc đ÷ng thçp hćn so vĉi vùng còn läi (Hình 3). Bâng 1. Kết quâ PCR phát hiện PPV1 trong huyết thanh Ký hiệu thực địa Địa điểm lấy mẫu Mã sốtrang trại Hiệu giá HI(1/x) Kết quả PCR VP2-12 Vĩnh Phúc A /512 + VP2-13 Vĩnh Phúc A /64 + VP2-15 Vĩnh Phúc A /8 + BN2-17 Bắc Ninh B /64 + BN2-18 Bắc Ninh B /4 + BN11-45 Bắc Ninh C /128 + HY12-41 Hưng Yên D /16 + HY12-42 Hưng Yên D /32 - HY12-45 Hưng Yên D /256 + HB14-0403 Hòa Bình E /128 - HB15-0401 Hòa Bình F /16 - HB15-0405 Hòa Bình F /8 - HN15-42 Hà Nội G /16 - HN18-0401 Hà Nội H /32 - HN18-0406 Hà Nội H /512 - HD18-45 Hải Dương I /32 - HD2-15 Hải Dương J /16 + HD2-195 Hải Dương J /8 + Ghi chú: 10 mẫu dương tính PPV1 được giải trình tự gen NS1 có thứ tự như sau: 1-7, 9, 17 và 18. 499
AY583318_China_C 0.94 JN968975_JT_China M38367_NADL-2_UK 0.92 NC_001718_NADL-2 0.9 KF913349_NADL-2-M KF913347_NADL-2-M 0.88 KF913350_NADL-2-M KF913351_NADL-2-M 0.86 KF913348_NADL-2-M Sự hiện0.84diện của Porcine Parvovirus 1 (PPV1) ở lợn nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận KF913346_NADL-2-M KF913345_NADL-2-M 0.82 KF742500_J-PPV_Ch KF429252_HN-G_Ch 0.8 SimPlot - Query: AY684872_vaccine-virus-IDT_Germany_1964 DQ675456_SR-1_Ch 0.78 FileName: D:\Cao-hoc-K24\paper-\phan-tich-sau-phan-bien\seq-PPV1-genome-NS1-nu-for-PPV-for-DAMBE.fas KF429253_HN-H_Ch 1.0 JX992846_HN-2011_ Similarity 0.76 MF447833_HNLY201 KF429254_HN-I_Chin 0.98 U44978_Kresse_US KX242359_GD2013_ 0.74 AY684866_Challeng 0.96 KF429255_HN-K_Ch 0.72 KY994646_T142_Ko AY583318_China_C 0.94 Mức tương đồng cao > 96% (vùng 1) EU790641_BQ_China JN968975_JT_China 0.7 AY390557_VRI-1_K Mức tương đồng M38367_NADL-2_UK 0.92 Mức tương đồng thấp so với vùng 1 JN400516_7a_Germ NC_001718_NADL-2 0.68 JN400517_8a_Germ 0.9 KF913349_NADL-2-M 0.66 AY684869_Tornau/1 KF913347_NADL-2-M 0.88 JN400518_14a_Germ KF913350_NADL-2-M 0.64 JN400519_693a_Ge KF913351_NADL-2-M 0.86 Vị trí sản phẩm KJ201927_HNAY_Ch KF913348_NADL-2-M 0.62 KJ201928_HNZK-1_ 0.84 PCR nhân lên bởi KF913346_NADL-2-M FJ822038_Nanjing20 0.6 KF913345_NADL-2-M 0.82 mồi PPVF/PPVR KX233726_TJ_China KF742500_J-PPV_Ch 0.58 MH566237_N108_Ko KF429252_HN-G_Ch 0.8 MH817778_N91_Kor DQ675456_SR-1_Ch 0.56 MH817779_N2_Kore 0.78 KF429253_HN-H_Ch 0.54 EU790642_ZJ_China JX992846_HN-2011_ Similarity 0.76 AY789533_HN-Z1_C MF447833_HNLY201 0.52 AY789534_HN-Z3_C U44978_Kresse_US 0.74 AY789532_NJ-2_Ch AY684866_Challeng 0.5 0.72 0 KY994646_T142_Ko 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700 1,800 1,900 EU790641_BQ_China Position 0.7 AY390557_VRI-1_K Vị trí nucleotide trung tâm Window : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Kimura (2-parameter), T/t: 2.0 JN400516_7a_Germ 0.68 JN400517_8a_Germ Hình 3. Kết quâ phân tích tương đồng trình tự nucleotide của gen NS1 0.66 AY684869_Tornau/1 JN400518_14a_Germ 0.64 JN400519_693a_Ge KJ201927_HNAY_Ch 0.62 KJ201928_HNZK-1_ 0.6 FJ822038_Nanjing20 A 0.58 1470 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 1550 1560 1570 |....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... KX233726_TJ_China MH566237_N108_Ko MH817778_N91_Kor D00623_NADL-2_USA_1976 GTTAGAATAGGATGCGAGGAAAGACCAGAACATACACAACCAATAAGAGACAGAATGTTAAACATAAACCTAACCAGAAAACTGCCAGGTGATTTTGGACTTTTAGAAGA 0.56 MH817779_N2_Kore U44978_Kresse_USA_1985 .............................................................................................................. AY684866_Challenge_Germany_198 0.54 ................................C............................................................................. EU790642_ZJ_China AY684871_27a_Germany .............................................................................................................. AY789533_HN-Z1_C 0.52 VP2-12_VinhPhuc_A .............................................................................................................. AY789534_HN-Z3_C VP2-13_VinhPhuc_A .............................................................................................................. AY789532_NJ-2_Ch 0.5 VP2-15_VinhPhuc_A .............................................................................................................. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1,000 1,100 1,200 1,300 1,400 1,500 1,600 1,700 1,800 1,900 BN2-17_BacNinh_B .............................................................................................................. Position BN2-18_BacNinh_B .............................................................................................................. BN11-45_BacNinh_C .............................................................................................................. Window : 200 bp, Step: 20 bp, GapStrip: On, Kimura (2-parameter), T/t: 2.0 HY12-41_HungYen_D .............................................................................................................. HY12-45_HungYen_D .............................................................................................................. HD2-15_HaiDuong_J .............................................................................................................. HD2-195_HaiDuong_J .............................................................................................................. 1580 1590 1600 1610 1620 1630 1640 1650 1660 1670 1680 |....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... D00623_NADL-2_USA_1976 AACTGAATGGCCACTAATATGTGCTTGGTTGGTAAAGAAAGGTTACCAAGCAACAATGGCTAGCTATATGCATCATTGGGGAAATGTACCTGATTGGTCAGAAAAATGGG U44978_Kresse_USA_1985 ...................................................................................................C.......... AY684866_Challenge_Germany_198 .............................................................................................................. AY684871_27a_Germany ........................................................................................................G..... VP2-12_VinhPhuc_A .............................................................................................................. VP2-13_VinhPhuc_A .............................................................................................................. VP2-15_VinhPhuc_A .............................................................................................................. BN2-17_BacNinh_B .............................................................................................................. BN2-18_BacNinh_B .............................................................................................................. BN11-45_BacNinh_C .............................................................................................................. HY12-41_HungYen_D .............................................................................................................. HY12-45_HungYen_D .............................................................................................................. HD2-15_HaiDuong_J .............................................................................................................. HD2-195_HaiDuong_J .............................................................................................................. 1690 1700 1710 1720 1730 |....|....|....|....|....|....|....|....|... B D00623_NADL-2_USA_1976 AGGAGCCAAAAATGCAAACCCCAATAAATACACCAACAGACTCT U44978_Kresse_USA_1985 ............................................ AY684866_Challenge_Germany_198 ............................................ AY684871_27a_Germany ...........................................A VP2-12_VinhPhuc_A ....T....................................... VP2-13_VinhPhuc_A ....T....................................... VP2-15_VinhPhuc_A ....T....................................... BN2-17_BacNinh_B ............................................ BN2-18_BacNinh_B ....T....................................... BN11-45_BacNinh_C ....T....................................... HY12-41_HungYen_D ....T....................................... HY12-45_HungYen_D ....T....................................... HD2-15_HaiDuong_J ....T....................................... BN2-17 BN2-18 HD2-195_HaiDuong_J ....T....................................... Trang trại B, tỉnh Bắc Ninh Ghi chú: (A) Kết quả so sánh trình tự nucleotide PPV1 của Việt Nam (đánh dấu) với các chủng đại diện. Dấu “.” biểu thị các vị trí có nucleotide giống với chủng tham chiếu NADL-2; (B) Giản đồ giải trình tự tại vị trí đa hình nucleotide 1694 G- T của 2 chủng PPV1 thu được ở cùng trang trại B. Hình 4. Trình tự nucleotide của phân đoạn gen mã hóa protein NS1 Trong khi đò đoän gen đāợc nhân lên trong PPV1 (Bâng 1). Hình 4 trình bày kết quâ giâi phân ăng PCR phát hiện virus nìm trong vùng mã gen cþa 10 chþng PPV1. có măc tāćng đ÷ng thçp kể trên. Do vêy, sân Kết quâ Ċ hình 4 cho thçy 10 chþng PPV1 phèm PCR phát hiện PPV1 đāợc dùng giâi mã thĆc đða Ċ Việt Nam có trình tĆ phån đoän gen phån đoän gen NS1 cþa 10 méu dāćng tính NS1 ít thay đùi, vĉi măc tāćng đ÷ng rçt cao tĂ 500
Nguyễn Văn Giáp, Mai Thị Ngân, Lê Văn Trường, Vũ Thị Ngọc, Võ Văn Hiểu, Tạ Thị Kim Chung, Vũ Đức Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ 99,7% đến 100%. Ở phån đoän gen NS1 dài 263 hành trên thð trāĈng Việt Nam. Do vêy, kết quâ nucleotide (nghiên cău này), chî có 1 vð trí đa PCR và giâi trình tĆ gen khîng đðnh sĆ lāu hình nucleotide là 1694 G-T (Hình 4B). So vĉi 4 hành cþa virus chþng thĆc đða Ċ lợn täi mût sø chþng tham chiếu (Kresse, 27a, Challenge và tînh miền Bíc. Cùng vĉi kết quâ công bø gæn NADL-2), 10 chþng cþa Việt Nam có măc tāćng đåy về sĆ lāu hành các genotype parvovirus Ċ đ÷ng trình tĆ nucleotide tøi thiểu là 98,8%. Đặc lợn nuôi täi miền Trung (Nguyen Tran Trung & tính tāćng đ÷ng cao về trình tĆ nucleotide là do cs., 2019) cho thçy PPV1 có mặt Ċ nhiều gen mã hóa NS1 có tính bâo thþ cao hćn, tøc đû tînh/thành phø trong câ nāĉc. biến đùi thçp hćn so vĉi gen mã hóa capsid protein (Ren & cs., 2013; Meszaros & cs., 2017). Nghiên cău này tiếp tĀc xác đðnh møi quan Theo danh mĀc thuøc thý y đã đāợc cçp phép hệ di truyền giąa các chþng PPV1 thĆc đða bìng lāu hành täi Việt Nam (CĀc Thú y, 2019), chî phāćng pháp phån tích cåy phát sinh chþng loäi có vacxin vô hoät phòng bệnh do PPV1 gåy ra lāu (Hình 5). Nhóm Tên chủng di truyền Amino acid NS1 553 564 577 3- 4 0,83 2 0,83 1 Ghi chú: giá trị bootstrap được biểu diễn theo thang đo 0-1 tương ứng với mức 0-100%. Ký hiệu 10 chủng PPV1 của Việt Nam theo quy tắc: tên chủng, địa điểm lấy mấu (tînh) và trang trại lấy mẫu (chữ cái A-J). Trình tự amino acid đính kèm tương ứng cho mỗi chủng PPV1 nhằm làm rõ khác biệt đột biến D/E ở amino acid 564 protein NS1. Hình 5. Cây phát sinh chủng loại của PPV1 dựa vào phân đoạn gen mã hóa protein NS1 501
Sự hiện diện của Porcine Parvovirus 1 (PPV1) ở lợn nuôi tại Hà Nội và vùng phụ cận parvoviruses in South Korea in 2018. BMC Kết quâ xây dĆng cây phát sinh chþng loäi Veterinary Research. 16(1): 113. bao g÷m các trình tĆ tham chiếu đã biết nhóm Cục Thú y (2019). Danh mục thuốc thú y đã được cấp di truyền (Hình 5) cho thçy có 4 nhóm di truyền phép lưu hành tại Việt Nam (phụ lục 1A, 1B). Truy (nhóm 1-4) cþa PPV1 giøng nhā cöng bø trāĉc cập từ http://cucthuy.gov.vn/Pages/danh-muc- đåy (Hao & cs., 2011). DĆa vào đặc điểm phân thuoc-thu-y-da-duoc-cap-giay-chung-nhan-luu- nhòm, đã xác đðnh 10/10 chþng PPV1 đāợc giâi hanh-tai-viet-nam-.aspx, ngày 31/12/2019. trình tĆ trong nghiên cău này thuûc về nhóm 1. Dias A.S., Gerber P.F., Araujo A.S., Auler P.A., Gallinari G.C. & Lobato Z.I.P. (2013). Lack of Nhóm 1 này g÷m các chþng phát hiện đāợc Ċ antibody protection against Porcine circovirus 2 nhiều nāĉc thuûc châu Mỹ (NADL-2, Kresse), and Porcine parvovirus in naturally infected dams châu Âu (Challenge) và châu Á (SR-1, N2). Có and their offspring. Research in Veterinary 9/10 chþng cþa Việt Nam (trĂ chþng BN2-17) Science. 94(2): 341-345. nìm cùng nhánh vĉi chþng N2 cþa Hàn Quøc Ellis J.A., Bratanich A., Clark E.G., Allan G., Meehan (đòng khung, hình 5). Nhòm này mã hòa B., Haines D.M., Harding J., West K.H., Krakowka S., Konoby C., Hassard L., Martin K. & aspartic (D) Ċ amino acid 564 và khác biệt so vĉi Mcneilly F. (2000). Coinfection by porcine 47 chþng PPV1 mã hòa glutamic (E) (đánh dçu circoviruses and porcine parvovirus in pigs with màu xám, hình 5). Cho đến nay, các đût biến naturally acquired postweaning multisystemic ânh hāĊng tĉi đặc tính sinh hõc cþa parvovirus wasting syndrome. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12(1): 21-27. chþ yếu têp trung Ċ capsid protein (Meszaros & cs., 2017; Oh & cs., 2017). Do đò, cæn nghiên cău Hao X., Lu Z., Sun P., Fu Y., Cao Y., Li P., Bai X., Bao H., Xie B., Chen Y., Li D. & Liu Z. (2011). thêm đặc điểm di truyền gen mã hóa capsid Phylogenetic analysis of porcine parvoviruses from protein cþa các chþng PPV1 phát hiện đāợc Ċ swine samples in China. Virology Journal. 8: 320. Việt Nam. Hồ Đình Chúc, Nguyễn Thị Phương Đông & Trần Duy Khanh (1995). Tình hình hội chứng rồi loạn sinh sản của lợn nái ở Thái Bình. Tạp chí Thú y. 1: 1-4. 4. KẾT LUẬN Joo H.S., Donaldson-Wood C.R. & Johnson R.H. Có mût tỷ lệ cao (88,2%) méu huyết thanh (1976). A standardised haemagglutination lợn thðt dāćng tính vĉi kháng thể kháng PPV1. inhibition test for porcine parvovirus antibody. Australian Veterinary Journal. 52(9): 422-424. Hiện tāợng virus huyết đã phát hiện Ċ 10/18 méu vĉi đặc điểm không phĀ thuûc vào hàm Lemoine F., Domelevo Entfellner J. B., Wilkinson E., Correia D., Davila Felipe M., De Oliveira T. & lāợng kháng thể kháng PPV1. Kết quâ giâi mã Gascuel O. (2018). Renewing Felsenstein's mût phæn gen NS1 cho biết 10 chþng PPV1 cþa phylogenetic bootstrap in the era of big data. Việt Nam thuûc nhóm di truyền 1, g÷m các Nature. 556(7702): 452-456. chþng phát hiện đāợc Ċ nhiều nāĉc thuûc châu Letunic I. & Bork P. (2019). Interactive Tree of Life Mỹ, châu Âu và châu Á. (iTOL) v4: recent updates and new developments. Nucleic Acids Research. 47(W1): W256-W259. Lole K.S., Bollinger R.C., Paranjape R.S., Gadkari D., TÀI LIỆU THAM KHẢO Kulkarni, S.S., Novak N.G., Ingersoll R., Sheppard Bergeron J., Menezes J. & Tijssen P. (1993). Genomic H.W. & Ray S.C. (1999). Full-length human organization and mapping of transcription and immunodeficiency virus type 1 genomes from translation products of the NADL-2 strain of subtype C-infected seroconverters in India, with porcine parvovirus. Virology. 197(1): 86-98. evidence of intersubtype recombination. Journal of Cadar D., Dan A., Tombacz K., Lorincz M., Kiss T., Virology. 73(1): 152-160. Becskei Z., Spinu M., Tuboly T. & Csagola A. Mayr A., Bachmann P.A., Siegl G., Mahnel H. & (2012). Phylogeny and evolutionary genetics of Sheffy B.E. (1968). Characterization of a small porcine parvovirus in wild boars. Infection, porcine DNA virus. Arch Gesamte Virusforsch. Genetics and Evolution. 12(6): 1163-1171. 25(1): 38-51. Chung H.C., Nguyen V.G., Huynh T.M., Park Y.H., Meszaros I., Olasz F., Csagola A., Tijssen P. & Zadori Park K.T. & Park B.K. (2020). PCR-based Z. (2017). Biology of Porcine Parvovirus detection and genetic characterization of porcine (Ungulate parvovirus 1). Viruses. 9(12): 393. 502
Nguyễn Văn Giáp, Mai Thị Ngân, Lê Văn Trường, Vũ Thị Ngọc, Võ Văn Hiểu, Tạ Thị Kim Chung, Vũ Đức Hạnh, Huỳnh Thị Mỹ Lệ Nguyen L.T., Schmidt H.A., Von Haeseler A. & Minh Ren X., Tao Y., Cui J., Suo S., Cong Y. & Tijssen P. B.Q. (2015). IQ-TREE: a fast and effective (2013). Phylogeny and evolution of porcine stochastic algorithm for estimating maximum- parvovirus. Virus Research. 178(2): 392-397. likelihood phylogenies. Molecular Biology and Saekhow P. & Ikeda H. (2015). Prevalence and Evolution. 32(1): 268-274. genomic characterization of porcine parvoviruses Nguyen Tran Trung, Tran Quoc Dung, Dinh Thi Ngoc detected in Chiangmai area of Thailand in 2011. Thuy, Vu Thi Tien, Do Vo Anh Khoa & Nguyen Microbiology and Immunology. 59(2): 82-88. Thi Dieu Thuy (2019). Detection of porcine Stojanac N., Gagrčin M., Stevančević O., Stančić I. & parvovirus (PPV) in pigs in central provinces of Potkonjak A. (2012). Passive and active immunity Viet Nam. Journal of Animal Husbandry Sciences against parvovirus infection in piglets. African and Technics. 249: 110-115. Journal of Biotechnology. 11(30): 7771-7774. Oh W.T., Kim R.Y., Nguyen V.G., Chung H.C. & Park Streck A., Gava D., Souza C., Gonçalves K., B.K. (2017). Perspectives on the evolution of Bortolozzo F., Wentz I. & Canal C. (2011). porcine parvovirus. Viruses. 9(8): 196. Presence of porcine parvovirus in sera from pigs is Oravainen J., Heinonen M., Tast A., Virolainen J. & independent of antibody titers. Berl Munch Peltoniemi O. (2005). High porcine parvovirus Tierarztl Wochenschr. 124: 242-246. antibodies in sow herds: prevalence and associated Xing X., Zhou H., Tong L., Chen Y., Sun Y., Wang H. factors. Reproduction in Domestic Animals. & Zhang G. (2018). First identification of porcine 40(1): 57-61. parvovirus 7 in China. Archives of Virology. Pozzi P.S. & Alborali G.L. (2012). Reproductive 163(1): 209-213. diseases in sows (Sus scrofa domestica): a review. Xu X.G., Chen G.D., Huang Y., Ding L., Li Z.C., Israel Journal of Veterinary Medicine. 67(1): 24-33. Chang C.D., Wang C.Y., Tong D.W. & Liu H.J. Ranz A.I., Manclus J.J., Diaz-Aroca E. & Casal J.I. (2012). Development of multiplex PCR for (1989). Porcine parvovirus: DNA sequence and simultaneous detection of six swine DNA and genome organization. Journal of General Virology. RNA viruses. Journal of Virological Methods. 70(Pt 10): 2541-2553. 183(1): 69-74. 503