TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ

Chia sẻ: Phan Thị Thanh Vân | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:31

Thêm vào BST

Báo xấu

508
lượt xem 221
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử phần lớn là những chất độc hại vì thế, luôn xem kỹ tên hóa chất trước khi sử dụng và cần ghi chú rõ ràng bên ngoài bao bì mỗi loại hóa chất.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ

Viện Nghiên Cứu Và Nuôi Trồng Thủy Sản II Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc, Cảnh Báo Môi Trường Và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ TÀI LIỆU TẬP HUẤN KỸ THUẬT PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH TRÊN TÔM CÁ Lưu hành nội bộ Tp. Hồ Chí Minh 2007 1
CHƯƠNG I: LÝ THUYẾT PHÒNG THÍ NGHIỆM I. AN TOÀN PHÒNG THÍ NGHIỆM Luôn mặc quần áo bảo hộ trong khi làm việc tại phòng thí nghiệm. 1. Hóa chất Hóa chất sử dụng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử phần lớn là những chất độc hại vì thế, luôn xem kỹ tên hóa chất trước khi sử dụng và cần ghi chú rõ ràng bên ngoài bao bì mỗi loại hóa chất. Trước khi sử dụng một loại hóa chất mới, cần phải tham khảo thông tin c ủa chúng t ừ các tài liệu của nhà sản xuất. Ví dụ: Phenol – rất dễ gây cháy Acrylamide – tác động độc lên hệ thần kinh Ethidium bromide – tác nhân gây ung thư Luôn đeo găng tay khi làm việc với các hóa chất và không bao giờ được hút chúng bằng miệng. Nếu tiếp xúc trực tiếp với những chất độc này phải nhanh chóng rửa vùng tiếp xúc dưới vòi nước và tuân theo chỉ dẫn của người hướng dẫn. Các hóa chất cần phải được bảo quản đúng nhiệt độ quy định: nhiệt độ phòng, trong tủ mát (40C) hoặc tủ lạnh âm (-200C) và được ghi nhãn cẩn thận. 2. Đèn tử ngoại (UV) Tiếp xúc trục tiếp với tia UV có thể gây hại mắt. Luôn luôn đeo kính bảo vệ khi s ử dụng đèn UV. 3. Nguồn điện Điện thế sử dụng trong quá trình điện di có thể gây giật điện. Đậy nắp bồn điện di trong suốt quá trình điện di để tránh bị điện giật. Luôn tắt nguồn điện trước khi lấy bản gel ra khỏi bồn điện di. 4. Các vật dụng Vật dụng thủy tinh và nhựa dùng trong sinh học phân tử phải sạch và vô trùng. Ống nghiệm bẩn như nhiễm khuẩn hoặc dính các chất tẩy đều có thể ức chế phản ứng hoặc làm hỏng vật liệu di truyền (nucleicacid). Vật dụng thủy tinh (ống nghiệm, bình tam giác…) tốt nhất cần được rửa bằng nước cất, hấp thanh trùng hoặc sấy 1500C trong vòng 1 giờ. Đối với thí nghiệm liên quan RNA, vật dụng thủy tinh cần được xử lý bằng diethyl-pyrocarbonate để ức chế enzyme RNases là một loại enzyme rất bền đối với việc hấp thanh trùng. Vật dụng nhựa (pipets và ống nuôi cấy, ống nghiệm nhỏ…) cần được thanh trùng trước khi sử dụng. 2
5. Rác thải và hóa chất thừa Ethidium bromide là một tác nhân gây ung thư vì thế khi thao tác với những vật dụng có dính chất này cần phải đeo găng tay bảo hộ. Gel agarose có chứa Ethidium bromide cần phải được vứt bỏ trong một túi riêng có đánh dấu. Quy định túi rác cho từng khu vực, từng công đoạn Hóa chất nguy hiểm cần có túi để riêng II. PHA CHẾ DUNG DỊCH Nồng độ mole, % và dung dịch mẹ "X". Nồng độ mole Dung dịch có nồng độ mole 1 M là một dung dịch có thể tích 1 lít và chứa số gram hóa chất tương đương với trong lượng phân tử của chất đó. Ví dụ: Chuẩn bị 100ml dung dịch NaCl 5M (trọng lượng phân tử: 58.456 đvc) Cân 29.29 g NaCl (cách tính: 58.456 g/mol x 5 moles/lít x 0.1 lít) Pha trong 100ml nước cất hoặc dung dung môi. Nồng độ phần trăm: Nồng độ phần trăm (trong lượng/thể tích) = trọng lượng chất tan (g) pha trong 100 ml nước cất hoặc dung dung môi. Ví dụ: Chuẩn bị dung dịch agarose 0.7% trong đệm điện di TBE Cân 0.7 g agarose Thêm dung dịch TBE 1X sao cho thể tích cuối cùng là 100ml. Dung dịch mẹ "X". Nhiều loại hóa chất, dung dịch cần được chuẩn bị ở nồng độ cao (dung dịch mẹ) 5 lần (5X) hoặc mười lần (10X) so với nồng độ cần thiết khi sử dụng. Trước khi sử dụng chúng sẽ được pha loãng thích hợp để đưa về nồng độ cần thiết (1X của dung dịch làm việc). Ví dụ: Chuẩn bị dung dịch điện di TBE 1X: 100ml dung dịch TBE 10X Thêm 900ml nước cất để thể tích cuối cùng là 1000 ml dung dịch TBE 1X. Chuẩn bị dung dịch làm việc từ dung dịch mẹ Nhiều dung dịch trong nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đòi hỏi sử dụng cùng một thành phần hóa chất nhưng lại khác nhau về nồng độ. Vì thế để tránh ph ải ph ức tạp khi pha chế riêng rẽ các hóa chất này chúng ta tốt nhất nên chuẩn bị s ẵn một vài dung dịch gốc để dễ dàng pha loãng chúng khi cần thiết. Ví dụ: có thể pha đệm TBE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) bằng cách phối hợp 1ml dung dịch Tris 1M và 2 ml dung dịch EDTA 0.5 M cộng với 98.8 ml nước cất vô trùng. Công thức chung dùng để tính toán nồng độ cần thiết như sau: 3
Ci x Vi = Cf x Vf C i = nồng độ ban đầu, hoặc nồng độ của dung dịch mẹ; V i = thể tích ban đầu, hoặc lượng dung dịch mẹ cần thiết, C f = nồng độ cuối, hoặc nồng độ mong muốn sau khi pha; V f = thể tích cuối, hoặc thể tích mong muốn sau khi pha III. SỬ DỤNG THIẾT BỊ Yêu cầu học viên giữ gìn các vật dụng trong phòng thí nghiệm cẩn thận. Không được tự ý sử dụng các thiết bị khi chưa được sự đồng ý hoặc chưa được hướng dẫn sử dụng của người hướng dẫn. Không di dời dụng cụ, thiết bị từ khu vực này đến khu vực khác mà chưa có ý kiến của người hướng dẫn Thông báo ngay bất kỳ hỏng hóc của thiết bị. Máy ly tâm Khi ly tâm, cần phải cân bằng rotor trước khi ly tâm. Lau chùi rotor của máy ly tâm sau khi sử dụng nếu bị vấy bẩn Đậy nắp máy ly tâm khi sử dụng xong. Micropipettors Mỗi pipette đều có giới hạn thể tích do vậy cần phải kiểm tra giới hạn thể của từng pipette trước khi sử dụng. Không được điều chỉnh pipette quá mức giới hạn. Không để rơi pipette xuống đất. IV. NGUYÊN TẮC PHẢN ỨNG PCR TRONG CHẨN ĐOÁN PCR là phản ứng nhân tạo tổng hợp và khuếch đại một đoạn DNA nằm giữa hai trình tự gọi là mồi (primer). Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn (oligonucleotides) có khả năng bắt cặp bổ sung chính xác với trình tự đích (trình tự DNA hoặc cDNA) của đối tương cần xác định (ví dụ như DNA của WSSV hoặc cDNA của YHV). Sau khi mồi (primer) bắt cặp vào trình tự đích, một enzyme có tên DNA polymerase sẽ tiến đến đầu 3’ của mỗi mồi (primer) để thực hiện tiến trình sinh tổng hợp đoạn DNA cần thiết. Thành phần cơ bản của Master Mix cho phản ứng PCR: 4
- Dịch trích DNA mẫu - Dung dịch đệm của phản ứng PCR (PCR buffer hoặc Taq buffer) - Ion Mg2+ (MgCl2 ) - Deoxy nucleotide triphosphate (dNTP’s: dATP, dCTP, dGTP, dTTP) - Các mồi (mồi xuôi: F và mồi ngược : R) - Enzym Taq polymerase Phản ứng PCR gồm có ba quá trình trong một chu kỳ khuếch đại: Biến tính, bắt cặp và kéo dài , chúng được lặp lại nhiều lần để khuyếch đại trình tự DNA mong muốn. Sau mỗi chu kỳ khuếch đại số lượng phân tử DNA đích được nhân lên gấp đôi: từ 1 phân tử lên 2, lên 4 lên 8, lên 16 phân tử… 2n. Chi tiết ba quá trình trên trong mỗi chu kỳ khuếch đại như sau: Biến tính: Phân tử DNA sợi đôi được hình thành bởi mối liên kết hydro giữa hai mạch đơn. Trong quá trình biến tính, nhiệt độ phản ứng gia tăng lên nhanh chóng đến 95oC và giữ ở nhiệt độ này trong khoảng 15-50 giây. Ở nhiệt độ này mối liên kết hydro giữa hai mạch đơn của phân tử DNA sợi đôi bị phá vỡ. Trong giai đoạn bắt cặp tiếp theo, nhiệt độ phản ứng giảm nhanh chóng làm cho mối liên kết hydro ban đầu không hình thành lại được kết quả làm tạo thành hai phân tử DNA mạch đơn. Bắt cặp: Trong giai đoạn bắt cặp, nhiệt độ lai thường duy trì khoảng 50- 60 0C, trong thời gian 15-60 giây. Quá trình này giúp cho các mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung đặc hiệu với trình tự đích (DNA hoặc cDNA) tại vị trí mong muốn. Nhiệt đ ộ bắt cặp phụ thuộc vào số lượng G,C có trong mồi (primer). Kéo dài: Sau khi mồi (primer) tìm kiếm và bắt cặp bổ sung với trình tự đích, nhiệt độ của phản ứng lại nhanh chóng chuyển về nhiệt độ thích hợp với hoạt động của enzyme DNA polymerase thường là 720C và giữ ở nhiệt độ này 30 giây đến 2 phút tùy theo chiều dài của đoạn DNA đích cần tổng hợp. Trong quá trình tổng hợp DNA polymerase 5
sẽ lấy nucleotide (A,T,G,C) từ môi trường phản ứng để gắn vào đầu 3’ của mồi (primer) theo nguyên tắc bổ sung với trình tự trên phân tử DNA hoặc cDNA đích. Năng lượng dùng trong quá trình gắn kết này là ATP cũng có trong môi trường phản ứng. Kết quả quá trình này phản ứng PCR đã tạo ra hai phân tử DNA mạch đôi mới từ một phân tử DNA mạch đôi ban đầu. Như vậy sau nhiều chu kỳ khếch đại (thường từ 30-40 chu kỳ) từ một phân tử đích ban đầu phản ứng PCR đã tạo ra vô số phân tử bản sao có kích thước xác định mong muốn. Cuối cùng sản phẩm PCR được nhuộm với Ehididum bromide và đem quan sát sự phát quang dưới tia UV sau khi phân tách sản phẩm PCR trên gel agarose theo kích thước. Các yếu tố ảnh hưởng đến kỹ thuật PCR Kỹ thuật PCR có độ nhạy rất cao, tuy nhiên, phương pháp này cũng có một số hạn chế sau: Sự ngoại nhiễm: người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp ống nghiệm sau mỗi lần khuếch đại trong khoảng không gian kín như phòng thí nghiệm sẽ làm cho 1 phần các phân tử DNA được khuếch đại vào không khí và nhiễm vào các phản ứng sau làm cho phản ứng PCR về sau có những sản phẩm khuếch đại không mong muốn. 6
Các sai sót gây ra do Taq polymerase: Sự sao chép bởi Taq DNA polymerase cho tỉ lệ sai khá cao trung bình 104 Nucleotide thì enzyme gắn sai một nucleotide. Tuy nhiên đặc tính này không nghiêm trọng nếu ta không cần xác định chính xác trình tự của DNA. VI. PHÂN TÍCH SẢN PHẨM PCR BẰNG ĐIỆN DI GEL AGAROSE Điện di agarose thường được sử dụng để xác định sản phẩm PCR dựa trên khả năng phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau khi sản phẩm PCR di chuyển qua mang lưới các vi lỗ có trong gel agarose. Do phân tử DNA tích điện âm cao. Khi phân tử DNA được đặt dưới một điện trường xác định, những phân tử DNA tích điện âm này sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường, trong trường hợp điện di agarose chúng sẽ di chuyển qua gel agarose được đặt trong dung dịch đệm điện di. Các phân tử càng nhỏ có khả năng di chuyển càng nhanh trong gel agarose về phía cực dương so với các phân tử DNA lớn hơn. Nguyên tác này cho phép kỹ thuật điện di phân tách các đoạn DNA có kích thước khác nhau. Sản phẩm PCR được trộn với dung dịch đặt mẫu (loading gel) vào chuyển vào các giếng trên gel agarose để thực hiện phân tách dưới tác động của điện trường. Gel agarose có chứa sẵn Ethidium bromide vì thế khi DNA di chuyển trong gel agarose sẽ tạo liên kết với Ethidium bromide Dung dịch đặt mẫu (loading gel) chứa chất có tỷ trọng nặng (như đường sucrose hoặc glycerol) để lôi cuốn DNA xuống đáy giếng trên bản gel agarose và ngăn cản không cho DNA khuếch tán vào dung dịch đệm điện di. Ngoài ra, trong dung dich đặt mẫu còn chứa chất chỉ thị tích điện âm. Chất chỉ thị di chuyển cùng với DNA giúp cho dễ dàng ước lượng sự di chuyển của DNA trong bản gel. Chất chỉ thị thường dùng là Xylene cyanol và Bromophenol blue, chúng di chuyển cùng với những phân tử DNA có chiều dài tương ứng lần lượt là 5000 bp and 300 bp Đệm diện di: Đệm điện di giúp ổn định các điều kiện môi trường cho phép quá trình di chuyển của DNA được ổn định trong suốt quá trình điện di. Có một vài loại đ ệm đi ện di thường dùng trong phân tích điện di agarose: Tris acetate EDTA (TAE), Tris/Borate/EDTA (TBE). Khả năng đệm của dung dịch đệm TAE thấp hơn so với TBE. Tuy nhiên, TAE lại cho phép phân tách tốt đối với những đoạn DNA lớn hơn. Điều này đồng nghĩa với việc phải dùng điện thế thấp hơn và mất thời gian điện di nhiều hơn. Kết thúc quá trình điện di bản gel sẽ được đặt dưới tác động của tia UV, các đoạn DNA sản phẩm PCR sau khi phân tách theo kích thước sẽ được hiển thị dưới dạng băng vạch màu vàng sáng tại những vị trí khác nhau tương ứng với kích thước chiều dài của chúng. 7
Ethidium bromide có sẵn trong bản gel sẽ chèn vào giữa các bazơ nitơ của phân tử DNA dẫn đến chúng bám vào phần trung tâm của phân tử DNA. Sự phát sáng là do phức hợp DNA-Ethidiun bromide phát ra khi chịu tác động của tia UV. Ghi chú: 1. Khu thao tác tách chiết vật liệu di truyền, khu pha chế hoá chất và khu điện di sản phẩm PCR phải tách biệt, tránh trường hợp DNA từ khu tách chiết và khu điện di ngoại nhiễm vào trong hoá chất trước khi đem phản ứng. 2. Tủ thao tác gắn đèn cực tím dùng cho pha chế hoá chất cho phản ứng PCR. 3. Gel agarose chạy điện di phải được chuẩn bị trong một tủ hút khí độc. 8
CHƯƠNG 2: THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT I. Thiết bị và Dụng cụ 1. Tinh sạch và tách chiết vật liệu di truyền 1. Tủ lạnh hai ngăn: 40C và –210C 2. Máy ly tâm 14.000 RPM (làm RT-PCR thì cần có thêm máy ly tâm l ạnh14.000 RPM) 3. Máy cách thủy (water bath) hay block nhiệt khô (dry heat block) 4. Máy trộn mẫu (Vortex) 5. Micropipette các loại: 0,5 - 10 µl; 10 -100 µl; 40 -200 µl; 200 -1000 µl; đầu tip micropipette các loại: 0,5-10µl, 20µl, 200µl, 1000µl 6. Eppendorf các loại: 0,2ml; 0,5 ml và 1,5 ml (chuyên dùng cho PCR) ; Giá ống nghiệm cho Eppendorf 7. Giá ống nghiệm cho loại tube PCR 0,2ml và 0,5ml 8. Hộp đựng nước đá 9. Dụng cụ bào đá bằng tay 10. Bình đựng cồn 11. Hộp đựng giấy thấm lau tay 12. Các bộ kéo, panh vô trùng 13. Hộp nhựa có nắp đựng vật liệu dơ 14. Box vô trùng 15. Máy cất nước 2 lần 16. Tủ sấy dụng cụ (hot box oven) 17. Vật liệu khác: Các lọ sạch để đựng mẫu, cồn 95% để cố định và bảo quản mẫu, găng tay, giấy lau, bút lông dầu, kim tiêm vô trùng 2. Khuếch đại nucleic acid Máy luân nhiệt (thermocycler) Bộ giữ điện UBS: loại online, công suất 2000 w 3. Phân tích kết qủa 1. Bộ điện di gồm nguồn và bồn điện di, bàn đọc kết quả với tia UV, máy ảnh dùng để chụp lại kết quả 2. Khay đổ gel (bản gel kích thước 7 x 10 cm hoặc 10 x 15cm), lược tạo giếng với dung tích chứa mẫu 10 - 20µl 3. Micropipette 5 - 50µl 4. Bếp điện hoặc lò vi ba dùng để đun agarose 5. Cân kỹ thuật độ chính xác 0,1gr hay 0,01gr 6. Ống đong 100ml và 500ml hay 1000ml 7. Chai thủy tinh chịu nhiệt có nắp, dung tích 250ml để đun Agarose 8. Tủ đổ gel (có hệ thống hút hơi Ethidium bromide) 9. Hộp nhựa có nắp đậy chứa rác thải 10. Vật liệu khác: Găng tay, giấy lau tay, Giấy paraffin, Hộp đầu tip 10 -200µl 9
II. Hoá chất tách chiết acid nucleic 1. Hoá chất tách chiết thô DNA Dung dịch 0,5 N NaOH: Cân 1 g NaOH cho vào ống định mức (ống falcon) 50ml thêm nước cất 2 lần vô trùng cho tới mức 50 ml của ống. Ta có được dung dịch 0,5N NaOH. Dung dịch 0,25% SDS: Cân 0,125 g SDS cho vào ống falcon 50 ml thêm nước cất 2 lần vô trùng cho tới mức 50 ml. Ta có được dung dịch 0,25 % (W/V) SDS. Dung dịch NaOH 0,25% - SDS 0,125%: 5ml NaOH 0,5N 5ml SDS 0,25% H2O đủ 100ml Bảo quản lạnh 4oC 2. Hoá chất tinh sạch DNA TE ( Tris-EDTA): pha100 ml (1 ml 1M Tris, 0.2ml 0.5M EDTA và cho nước đủ 100 ml) hấp khử trùng 121oC trong 15 phút (autoclave) sau đó bảo quản ở 40C. Dung dịch 0.5M EDTA (Ethylene Diamine TetraAcetic ): cân 18,61 g trong 70ml nước cất. Sau đó cho 15-20 hạt NaOH để chuẩn cho pH = 8. sau đó thêm nước cất đủ 100 ml và đem đi hấp autoclave. Bảo quản ở 40C Phenol pH 8: Cân khoảng 100 g phenol tinh thể, để tan ở 680C . Thêm vào một thể tích 100 ml dung dịch Tris HCl 0,5M (pH = 8). Khuấy từ trong 15 phút , để yên dung dịch cho đến khi thấy hai pha rõ rệt, hút bỏ pha bên trên. Tiếp tục cho thêm một thể tích Tris HCL 0,1M (pH = 8). Lặp lại thao tác như trên cho đến khi đo được dung dịch phenol pH = 8. Phenol pH 4: Cân khoảng 100 g phenoltinh thể, để tan ở 680C . Thêm vào một thể tích 100 ml nước cất hai lần hấp khử trùng. Khuấy từ trong 15 phút, để yên dung dịch cho đến khi thấy hai pha rõ rệt, hút bỏ pha bên trên. Tiếp tục cho thêm một thể tích n ước cất như trên. Lặp lại thao tác như trên cho đến khi đo được dung dịch phenol pH = 4 Phenol pH 8 : Chloroform : Isomyl alcolhol (25:24:1): Pha 100 ml dung dịch tách chiết bằng cách dùng đầu tip tinh sạch hút 2ml Isoamyl alcolhol vào 50ml phenol pH = 8, l ắc trộn đều; sau đó thêm 48ml dung dịch cholroform vào trộn đều. Sodium Acetate 3M (pH: 5.2): Cân 40,8g NaOAc*3H2O, hòa tan trong 80 ml H2O. Sau đó chuẩn pH 5.2 với acid acetic. Thêm nước cho đủ 100 ml. Cồn 70%: Đong 70 ml cồn tuyệt đối cho vào 30 ml H2O cất vô trùng. Ta được 100 ml cồn 70% Cồn tuyệt đối (100%) H2O – DEPC : Hút 1ml DEPC (diethylpyrocarbonate) cho vào 1lít nước cất loại Ion. Ủ qua đêm và đem hấp vô trùng. Dung dịch TN (20 mM Tris–HCl, 0.4 M NaCl, pH 7.4) 3. Hoá chất tách chiết RNA (Trizol) 10
Phenol pH = 4 19 ml Guanidine thiocyanate(0.8M) 5,9 g Amonium thiocyanate (0.4M) 3,8006 g Sodium acetate 3M pH = 5.2 1,67 ml Glycerol 2,5 ml Thêm H2O – DEPC đủ 50 ml 4. Phân tích sản phẩm PCR trên gel agarose TBE 10X (Tris-Boric acid-EDTA) 108g Tris base 55g Boric acid 9,8 g EDTA - Hòa tan 108g Tris và 55g Bocic acid trong khoảng 600ml H2O. - Thêm 9,8 g EDTA và chỉnh pH: 8, thêm thể tích H2O cho đủ 1 lít. Bảo quản ở nhiệt độ phòng (280C). Dung dịch nạp mẫu (loading gel) Bromophenol 6X: Bromophenol blue 0,25% (w/v) Glycerol 40% (v/v) Agarose tinh cho sinh học phân tử Ethidium bromide stock 10mg/ml 11
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP I. CHUẨN BỊ MẪU Mẫu tôm có thể được sử dụng trực tiếp (gọi là mẫu tươi) hoặc được bảo quản trong dung dịch cồn 950. Trong trường hợp mẫu được bảo quản trong cồn thì phải thay mới dung dịch cồn sau một tuần bảo quản đầu tiên để mẫu được bảo quản đ ược lâu hơn. Những mẫu được bảo quản trong cồn cần được loại cồn trước khi sử dụng. Có th ể dùng giấy thấm để loại cồn khỏi mẫu trước khi tinh sạch vật liệu di truyền. Mẫu tươi sử dụng cho phân tích PCR là tốt nhất. 1. Mẫu DNA virus: MBV, WSSV, HPV Mẫu tôm giống (PL): lấy khoảng 50-70 con. Mẫu tôm nuôi: lấy một phần nhỏ mang của 10 -15 con (tổng lượng mẫu không qúa 1 gram). Tôm bố mẹ: lấy mẫu cuốn mắt, chân bò, hoặc chân bơi hoặc một phần mang. Mẫu giáp xác hoang dã: lấy một phần mang các loại động vật này (tổng l ượng mẫu không qúa 500 microgram). 2. Mẫu RNA virus: TSV, YHV Mẫu tôm giống: lấy khoảng 30-50 PL Mẫu tôm nuôi: lấy một phần nhỏ mang của 10-15 con (tổng lượng mẫu không qúa 200 microgram). Tôm bố mẹ: lấy mẫu cuốn mắt, chân bò, hoặc chân bơi hoặc một phần mang. Mẫu giáp xác hoang dã: lấy một phần mang các loại động vật này (tổng l ượng mẫu không qúa 200 microgram). II. QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH VẬT LIỆU DI TRUYỀN 1. Tách chiết thô DNA Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên nguyên tắc phối hợp cơ học (nghiền), hóa học (NaOH-SDS) và sốc nhiệt để tách chiết DNA virus ra dịch chiết. 1. Mẫu tôm được nghiền kỹ trong eppendorf với 600-800ml dịch tách chiết DNA (NaOH 0.25N, SDS 0,125%) 2. Đem biến tính bằng cách đun sôi cách thuỷ 5-10 phút và làm l ạnh nhanh ở đi ều ki ện lạnh (nhúng vào nước đá). Mẫu được sốc nhiệt nhằm phá vở màng tế bào và phá huỷ hoạt tính sinh học của một số chất có trong dịch chiết gây ảnh hưởng đến phản ứng PCR) 3. Tiếp theo dịch nghiền được ly tâm 5 phút ở tốc độ 13.000 vòng/phút 4. Sau ly tâm, thu dịch nổi bên trên; dịch chiết này được đem phân tích PCR ngay hoặc bảo quản ở –200C để phân tích sau 12
2. Tách chiết tinh DNA bằng phenol-chloroform Nguyên tắc: Dung dịch Phenol : Chloroform : Isoamyl Alcohol(PCI) (25:24:1) sẽ làm biến tính và tủa các protein, chúng sẽ bị tập trung trong lớp phân cách giữa phase lỏng và phase PCI sau khi ly tâm. DNA trong phase lỏng sẽ bị kết tủa bởi ethanol ở nồng độ muối cao. 1. Trong eppendorf, cho vào 400µl dịch chiết thô DNA bệnh phẩm (xem phương pháp 1), thêm 400µl PCI. 2. Vortex mạnh trong 10 giây 3. Ly tâm 13,000RPM trong 2 phút 4. Hút chuyển khoảng 350µl phần phase lỏng ở trên chứa DNA vào một tube ly tâm nhỏ mới (lặp lại bước này một lần nữa nếu ở phần tiếp xúc giữa hai phase vẫn còn tủa trắng, và lần 2 này thì hút khoảng 300 µl phần phase lỏng ở trên chứa DNA vào một tube Eppendorf nhỏ mới). 5. Thêm 35µl hay 30µl (1/10 thể tích, tuỳ thuộc vào thể tích pha lỏng lấy đ ược ở bước trên là 350µl hay 300µl) Sodium acetate 3M, pH 5.2 vào dung dịch DNA để làm cho DNA dễ bị tủa khi cho Ethanol vào. 6. Trộn bằng vortex nhẹ hay bằng cách búng ngón tay nhẹ vào tube nhiều lần. Thêm 1ml (2,5V) ethanol 100% đã để lạnh trong đá rồi vortex. Giữ tube trong trong kem đá khô trong hơn 5 phút, hay giữ trong tủ - 70 °C trong 15 phút, hay trong tủ lạnh ngăn -20°C trong 30 phút. 7. Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút 8. Dùng miropipette hút bỏ phần nước nổi bằng cách vừa hút cạn dần vừa cho đầu tip vào dọc thành ống đối diện với chỗ đóng cặn lóng DNA. Rửa cặn lóng DNA với 1ml Ethanol 70%, không vortex mà chỉ úp ngửa vài lần. 9. Ly tâm 13.000 rpm trong 5 phút, hút bỏ Ethanol, và làm khô cặn lóng bằng cách đun cách thủy hay đun trong block nhiệt khô ở nhiệt độ 50-56 0 C cho đến khi khô hoàn toàn (không còn thấy các giọt nước đọng trên thành ống). 10. Hoà tan cặn lóng DNA trong 50 - 100µl đệm TE. 3. Tinh sạch RNA tổng số bằng Trizol Nguyên tắc: Phương pháp này dùng Guanidine Thiocyanate và Amoniumthiocyanate, phối hợp với phenol acid và các chất tẩy khác để làm chất gây biến tính các protein, nhờ đó tách chiết được RNA toàn phần ra khỏi DNA và protein. RNA tách chiết được sẽ dễ dàng bị kết tủa bởi isopropanol và ethanol. Nghiền 150 - 200 mg mô tôm trong 300 µl. Ly tâm 12000 vòng/ phút trong 10 phút. Hút 150 µl dung dịch nổi cho vào eppendorf 1,5 ml. 1. Thêm 1ml dung dịch Trizol 2. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút 3. Thêm vào 200 µl Chloroform 4. Vortex trong 20 giây 13
5. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút 6. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút 7. Thu dịch nổi có chứa RNA vào ống eppendorff 1,5ml khác (hút khoảng 600 µl cho mỗi ống) 8. Thêm vào 600 µl Isopropanol lạnh -200C ( Tuỳ theo dịch nổi thu được mà cho một thể tích Isopropanol tương ứng) 9. Ủ ở nhiệt độ phòng ít nhất 10 phút (qua đêm ở -200C hay để ở -700C trong 1 giờ) 10. Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút. Loại bỏ dịch nổi. 11. Hoàn tan cặn lóng RNA bằng 1ml Ethanol 70%. 12. Vortex, ly tâm 7500 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ dịch nổi. 13. Làm khô cặn RNA ở 550C bằng cách đun cách thuỷ hay block nhiệt. 14. Hòa cặn RNA trong 50-100 µl H2O-DEPC. Bảo quản ở -200C. III. QUI TRÌNH PCR CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY BỆNH TRÊN TÔM 1. Qui trình chẩn đoán virus WSSV (Kiapathomchai, 2001). Nguyên tăc: Sử dung 4 môi: môt môi xuôi (F), ba môi ngược (R1, R2, R3). Để khuêch ́ ̣ ̀ ̣ ̀ ̀ ́ đai ba trinh tự khac nhau cua môt đoan gene cua WSSV. Trong ba chu kì nhiêt khac nhau. ̣ ̀ ́ ̉ ̣ ̣ ̉ ̣ ́ Đôi với căp môi F, R1 khuêch đai đoan gene có kich thước 1100bp. Với căp môi F, R2 ́ ̣ ̀ ́ ̣ ̣ ́ ̣ ̀ khuêch đai đoan gene bên trong cua căp môi F, R1. kich thước san phâm khuêch đai là 526 ́ ̣ ̣ ̉ ̣ ̀ ́ ̉ ̉ ́ ̣ bp. Với căp môi F, R3 khuêch đai đoan gene bên trong cua san phâm cua hai căp môi trên ̣ ̀ ́ ̣ ̣ ̉ ̉ ̉ ̉ ̣ ̀ và có kich thước sau khi khuêch đai là 250 bp. Giới han cua qui trinh phat hiên DNA virus ́ ́ ̣ ̣ ̉ ̀ ́ ̣ trong mâu ở mức fetogram (10-7g). Ngoai ra, qui trinh con có thể đanh giá mức độ nhiêm ̃ ̀ ̀ ̀ ́ ̃ ̉ cua virus trên tôm. ̀ Qui trinh: a. Chuân bị phan ứng: ̉ ̉ Thanh phân 50 µl phan ứng PCR gôm: ̀ ̀ ̉ ̀ 25 µl PCR Master mix (Promega), 0.5µl môi F1 (100pmol/µl) ̀ 0.5µl môi R1 (20pmol/µl) ̀ 0.5µl môi R2 (30pmol/µl) ̀ 0.5µl môi R3 (50pmol/µl) ̀ 21 µl nước cât hai lân vô trung, ́ ̀ ̀ Hut 1,5 - 2 µl dich chiêt DNA từ mâu phân tich. ́ ̣ ́ ̃ ́ b. Thực hiên phan ứng ̣ ̉ Thực hiên phan ứng trên may luân nhiêt theo cac chu kỳ sau: ̣ ̉ ́ ̣ ́ ̣ ̀ Giai đoan 1 (1 chu ky): 0 93 C trong 5 phut ́ 14
̣ ̀ Giai đoan 2 (5 chu ky): 930C trong 20 giây 700C trong 20 giây 720C trong 20 giây ̣ ̀ Giai đoan 3 (20 chu ky): 930C trong 20 giây 550C trong 20 giây 720C trong 20 giây ̣ ̀ Giai đoan 4 (25 chu ky): 930C trong 20 giây 500C trong 20 giây 720C trong 20 giây ̣ ̀ Giai đoan 5 (1 chu ky) 720C trong 7 phut ́ ̀ 40C trong vô cung Xac đinh san phâm: Sử dung 10µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% thời ́ ̣ ̉ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ̣ ̣ gian 30-40 phut và ở 100V. ́ Kêt quả điên di: ́ ̣ 1 2 M 3 4 5 6 7 8 M : Thang DNA Giếng 1, 3 : Mẫu tôm nhiễm WSSV nặng Giếng 2, 8 : Mẫu tôm không nhiễm WSSV Giếng 4, 5, 6, 7 : Mẫu tôm nhiễm WSSV nhẹ 2. ̀ ̉ ́ Qui trinh PCR chân đoan YHV A. Qui trình chẩn đoán YHV (Wongteerasupaya và cộng sự, 1997) Nguyên tăc: Căp môi 10 F, 114 R được thiêt kế để khuêch đai đoan gene cua YHV có ́ ̣ ̀ ́ ́ ̣ ̣ ̉ kich thước 135 bp. ́ a. Chuân bị phan ứng ̉ ̉ Hút 25 µl AccessQuick TMMaster mix (Promega) 0,5 µl môi 10 F (70 pmol/µl) ̀ 0,5 µl môi 114 R (70 pmol/µl) ̀ 1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega) 15
20 µl nước DEPC ́ ́ ́ ̣ ́ ̀ ̣ 2-5µl RNA YHV (đã biên tinh trên may luân nhiêt 700C trong 10 phut, lam lanh nhanh băng may luân nhiêt ở 4 C). ̀ ́ ̣ 0 Tất cả cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó thực hiện phản ứng trên máy luân nhiệt b. Thực hiên phan ứng ̣ ̉ Thực hiên phan ứng trên may luân nhiêt theo cac chu kỳ sau: ̣ ̉ ́ ̣ ́ 01 chu kỳ 420C trong 45 phut ́ 01 chu kỳ 940C trong 5 phut ́ 35 chu kỳ 940C trong 30 giây 580C trong 30 giây 720C trong 30 giây 1 chu kỳ ́ 720C trong 7 phut Giữ ở nhiệt độ 40C Xac đinh san phâm: Sử dung 10µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% thời ́ ̣ ̉ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ̣ ̣ gian 30-40 phut và ở 100V. ́ Kêt quả điên di: ́ ̣ 1 2 3 4 5 6 M 7 M : Thang DNA Giếng 1, 2, 4, 7: Mẫu tôm nhiễm YHV Giếng 3, 5, 6 : Mẫu tôm không nhiễm YHV B. Qui trình chẩn đoán YHV (Tang K.F.J. & Lightner D.V. 1999) a. Chuân bị phan ứng ̉ ̉ Hút 25 µl AccessQuick TMMaster mix (Promega) 1 µl môi 273F (50 pmol/µl) ̀ 16
1 µl môi 273R (50 pmol/µl) ̀ 1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega) 19 µl nước DEPC ́ ́ ́ ̣ ́ ̀ ̣ 2-5µl RNA YHV (đã biên tinh trên may luân nhiêt 700C trong 10 phut, lam lanh nhanh băng may luân nhiêt ở 40C hoặc trong nước đá). ̀ ́ ̣ Tất cả cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, thực hiện phản ứng trên máy luân nhiệt b. Thực hiên phan ứng ̣ ̉ Thực hiên phan ứng trên may luân nhiêt theo cac chu kỳ sau: ̣ ̉ ́ ̣ ́ 01 chu kỳ 420C trong 45 phut ́ 01 chu kỳ 940C trong 5 phut ́ 35 chu kỳ 940C trong 45 giây 600C trong 45 giây 720C trong 30 giây 1 chu kỳ ́ 720C trong 7 phut Giữ ở nhiệt độ 40C Xac đinh san phâm: Sử dung 10µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% thời ́ ̣ ̉ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ̣ ̣ gian 30-40 phut và ở 100V. ́ 273b p ̀ ̉ ́ 3. Qui trinh PCR chân đoan TSV (OIE, 2006) Nguyên Tắc: Căp môi TSV F và TSV R sẽ khuêch đai môt đoan gene cua TSV có kich ̣ ̀ ́ ̣ ̣ ̣ ̉ ́ thước 231 bp. a. Chuân bị phan ứng ̉ ̉ 17
Hút 25 µl AccessQuick TMMaster mix (Promega) 1 µl môi TSV F (46 pmol/µl) ̀ 1 µl môi TSV R (46 pmol/µl) ̀ 1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega) 19 µl nước DEPC ́ ́ ́ ̣ ́ ̀ ̣ 2-5µl RNA YHV (đã biên tinh trên may luân nhiêt 700C trong 10 phut, lam lanh nhanh băng may luân nhiêt ở 4 C hoặc trong nước đá). ̀ ́ ̣ 0 Tất cả cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, thực hiện phản ứng trên máy luân nhiệt b. Thực hiên phan ứng ̣ ̉ Thực hiên phan ứng trên may luân nhiêt theo cac chu kỳ sau: ̣ ̉ ́ ̣ ́ 01 chu kỳ 420C trong 45 phut ́ 01 chu kỳ 940C trong 2 phut ́ 40 chu kỳ 940C trong 45 giây 600C trong 45 giây 600C trong 45 giây 1 chu kỳ ́ 720C trong 7 phut Giữ 40C cho đên khi phân tich ́ ́ Xac đinh san phâm: Sử dung 10µl san phâm khuêch đai điên di trên gel agrose 1,5% thời ́ ̣ ̉ ̉ ̣ ̉ ̉ ́ ̣ ̣ gian 30-40 phut và ở 100V. ́ Kêt quả điên di: ́ ̣ 1 M 2 3 4 5 6 7 1: Mẫu TSV M: Thang DNA 2, 3, 4, 5: Mẫu tôm không nhiễm TSV 6, 7: Mẫu tôm nhiễm TSV 4. Qui trình chẩn đoán MBV (Surachetpong W., 2005) 18
Qui trinh: Sử dụng một cặp mồi khuếch đại một đoạn gen (Genbank: AY819785) có ̀ kích thước 261 bp. a. Chuân bị phan ứng: ̉ ̉ Thanh phân 50 µl phan ứng PCR gôm: ̀ ̀ ̉ ̀ 25 µl PCR Master mix (Promega), ̀ 0.5µl môi 261F (50pmol/µl) ̀ 0.5µl môi 261R (50pmol/µl) 22 µl nước cât hai lân vô trung, ́ ̀ ̀ Hut 1,5 - 2 µl dich chiêt DNA từ mâu phân tich. ́ ̣ ́ ̃ ́ b. Thực hiên phan ứng ̣ ̉ Thực hiên phan ứng trên may luân nhiêt theo cac chu kỳ sau: ̣ ̉ ́ ̣ ́ ̣ ̀ Giai đoan 1 (1 chu ky): 950C trong 5 phut ́ ̣ ̀ Giai đoan 2 (30 chu ky): 940C trong 30 giây 600C trong 30 giây 720C trong 30 giây Giai đoạn 3 chu kỳ 720C trong 7 phut́ Giữ 40C cho đên khi phân tich ́ ́ 5. Qui trình chẩn đoán HPV (Sukhusirichart vaø coäng sö,ï 1999) a. Chuân bị phan ứng: ̉ ̉ Thanh phân 50 µl phan ứng PCR gôm: ̀ ̀ ̉ ̀ 25 µl PCR Master mix (Promega), 1 µl môi HPV F (40pmol/µl) ̀ 1 µl môi HPV R (40pmol/µl) ̀ 21 µl nước cât hai lân vô trung, ́ ̀ ̀ Hut 1,5 - 2 µl dich chiêt DNA từ mâu phân tich. ́ ̣ ́ ̃ ́ b. Thực hiên phan ứng ̣ ̉ Thực hiên phan ứng trên may luân nhiêt theo cac chu kỳ sau: ̣ ̉ ́ ̣ ́ ̣ ̀ Giai đoan 1 (1 chu ky): 950C trong 5 phut ́ ̣ ̀ Giai đoan 2 (35 chu ky): 940C trong 40 giây 550C trong 30 giây 720C trong 30 giây Giai đoạn 3 chu kỳ 720C trong 7 phut́ Giữ 40C cho đên khi phân tich ́ ́ Kết quả điện di 19
6. Qui trình RT-nested PCR chẩn đoán virus VNN gây bệnh trên cá Mú (Leobert D. De la Pena, 2002) Nguyên tắc: Cặp mồi VNF1 và VNR1 được thiết kế để khuếch đại vùng T4 gen vỏ protein của virus VNN. Cặp mồi VNF2 và VNR2 khuếch đại đoạn gen bên trong c ủa bước khuếch đại lần 1 a. Chuân bị phan ứng RT-PCR bước 1 ̉ ̉ Hút 25 µl AccessQuick TMMaster mix (Promega) 1 µl môi VNF1 (40 pmol/µl) ̀ 1 µl môi VNR1 (40 pmol/µl) ̀ 1 µl Enzyme reverse transcriptase M-MLV(Promega) 19 µl nước DEPC ́ ́ ́ ̣ ́ ̀ ̣ 2-5µl RNA VNN (đã biên tinh trên may luân nhiêt 700C trong 10 phut, lam lanh nhanh băng may luân nhiêt ở 40C hoặc trong nước đá). ̀ ́ ̣ Tất cả cho vào micro tube PCR 0.2 ml. Sau đó, thực hiện phản ứng trên máy luân nhiệt b. Thanh phân 50 µl phan ứng Nested PCR bước 2 gôm: ̀ ̀ ̉ ̀ 25 µl PCR Master mix (Promega), ̀ 0.5µl môi VNF2 (40pmol/µl) ̀ 0.5µl môi VNR2 (40pmol/µl) 22 µl nước cât hai lân vô trung ́ ̀ ̀ 2 µl sản phẩm khuếch đại bước 1 c. Thực hiên phan ứng ̣ ̉ Phản ứng RT-PCR 20