intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm: Tập 4 - Số 1/2021

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:86

Thêm vào BST
Báo xấu
27
lượt xem 7
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm: Tập 4 - Số 1/2021 trình bày các nội dung chính sau: Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex kháng kháng sinh carbapenem phân lập trong rau ăn sống và thịt chế biến sẵn trên địa bàn thành phố Hà Nội; Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol trong huyết tương thỏ bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS); Xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z trong sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS);... Mời các bạn cùng tham khảo để nắm nội dung chi tiết của tạp chí.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm: Tập 4 - Số 1/2021

  1. Tập 4 - Số 1 2021 Địa chỉ: 65 Phạm Thận Duật, Mai Dịch, Cầu Giấy, Hà Nội * Tel: 024.39335735 * Fax: 024.39335738 Email: tapchikntp.nifc@gmail.com * Website: nifc.gov.vn
  2. Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - tập 4, số 1, 2021 Vietnamese Journal of Food Control - vol. 4, no. 1, 2021 MỤC LỤC Trang 1. Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex kháng 1 kháng sinh carbapenem phân lập trong rau ăn sống và thịt chế biến sẵn trên địa bàn thành phố Hà Nội Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex in ready-to-eat vegetables and meats in Hanoi 2. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol trong huyết tương thỏ bằng sắc 10 ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Determination of esomeprazole in rabbit plasma by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 3. Lactobacillus sp. và thử nghiệm ứng dụng 22 trong bảo quản nông sản Collection of phenyllactic acid from a strain of Lactobacillus sp. and application in agricultural products preservation 4. Đánh giá mức độ ô nhiễm vi sinh vật trong sản phẩm thịt đã chế biến tại một số chợ khu vực 34 nam sông Hương thành phố Huế Assessment of microbiological contamination levels in processed meat products from markets in southern Hue city 5. Xác định đồng thời Nisin A và Nisin Z trong sản phẩm dinh dưỡng bằng sắc ký lỏng khối 43 phổ hai lần (LC-MS/MS) Simultaneous determination of Nisin A and Nisin Z in nutritional food by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 6. Đánh giá mức độ nhiễm và đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella spp. phân lập từ thủy 52 hải sản tươi sống tại các chợ truyền thống trên địa bàn thành phố Hồ Chí Minh Investigation into infectability and antimicrobial susceptibility of Salmonella spp. isolated from fresh seafood at traditional markets in Ho Chi Minh city Trương Huỳnh Anh Vũ, Nguyễn Hoàng Khuê Tú, Huỳnh Yên Hà, Chu Vân Hải 7. Chế tạo và khảo sát khả năng tăng cường tín hiệu Raman của đế Silic cấu trúc kim tự tháp/ 62 nano bạc Fabrication and study of Raman signal enhancement of pyramid/nano-Ag structured Silic substrate 8. Xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích hàm lượng một số oligosaccharide từ sữa mẹ 73 trong thực phẩm bổ sung bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS/MS) dietary supplements by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS)
  3. Nghiên cứu khoa học Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex kháng kháng sinh carbapenem phân lập trong rau ăn sống và thịt chế biến sẵn trên địa bàn thành phố Hà Nội Tạ Thị Yến*, Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh, Vũ Thị Hải Hà Phạm Văn Quân, Nguyễn Thành Trung Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia, Hà Nội, Việt Nam (Ngày đến tòa soạn: 26/12/2020; Ngày chấp nhận đăng: 18/03/2021) Tóm tắt Acinetobacter spp. là vi khuẩn gây bệnh phổ biến ở người. Chi Acinetobacter bao gồm khoảng 65 loài, trong đó nhóm Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex được xác định là nguyên nhân gây ra hơn 80% trường hợp nhiễm trùng tại bệnh viện ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch. Các phân tích kiểu hình hiện có không đủ để xác định chính xác và phân biệt các loài Acinetobacter spp. quan trọng về mặt lâm sàng. Trong tổng số 480 mẫu rau ăn sống và thịt chế biến sẵn được thu thập tại 06 quận nội thành Hà Nội gồm Đống Đa, Hoàng Mai, Hai Bà Trưng, Long Biên, Hà Đông, Cầu Giấy, có 288 mẫu (chiếm 60%) nhiễm Acinetobacter spp. Kết quả định danh bằng kỹ thuật MALDI-TOF MS ghi nhận 208 mẫu (43%, n = 480) nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex, trong đó 156 mẫu rau ăn sống (65%, n = 240) và 52 mẫu thịt (22%, n = 240) nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex. Thử nghiệm kháng sinh đồ bằng các khoanh giấy kháng sinh cho thấy 82% số chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex kháng với kháng sinh imipenem và 30% số chủng kháng với meropenem. Từ khóa: Acinetobacter spp., Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex, MALDI-TOF MS, carbapenem. 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn Acinetobacter spp. là vi khuẩn gây bệnh phổ biến gây ra các triệu chứng nhiễm trùng máu, nhiễm khuẩn bệnh viện và tiêu chảy. Ngoài môi trường bệnh viện, vi khuẩn Acinetobacter spp. cũng đã được tìm thấy trong thực phẩm như rau, táo, dưa, cải bắp, súp lơ, rau diếp, dưa chuột, ớt, phòng bệnh, củ cải, cà rốt cũng như các loại củ như khoai tây và ngũ cốc như ngô ngọt. Acinetobacter spp. cũng được xem là nguyên nhân gây hỏng thịt xông khói, thịt gà, thịt lợn, cá và trứng ngay cả khi chúng được bảo quản trong tủ lạnh hoặc sau khi chiếu xạ gamma [1]. Trong các loài vi khuẩn thuộc chi Acinetobacter thì Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii complex là tập hợp gồm 04 loài vi khuẩn có khả năng gây bệnh đã được phân lập từ đất, nước và thực phẩm bao gồm thịt, cá, trái cây và rau, làm dấy lên lo ngại Điện thoại: 0904959050 * Email: yenta84@gmail.com Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 1
  4. Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii ... thực phẩm có thể là nguồn lây nhiễm tiềm ẩn cho con người, đặc biệt là trong các cơ sở y tế [1]. Bên cạnh đó, hiện tượng vi khuẩn kháng đa kháng sinh (MDR) là vấn đề quan ngại trong điều trị đối với các bệnh nhiễm trùng mắc phải tại bệnh viện và cộng đồng. Tổ chức Y tế Thế giới gần đây đã xác định tình trạng kháng thuốc kháng sinh là một trong ba vấn đề quan trọng mà con người đang phải đối mặt. Các vi khuẩn kháng đa kháng sinh nghiêm trọng và phổ biến nhất được xác định là các loài Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa và Enterobacter spp. [2]. Tại Việt Nam, Bộ Y tế đã ban hành các thông tư và tài liệu hướng dẫn về kháng sinh sử dụng trong điều trị. Dựa trên Hướng dẫn sử dụng kháng kháng sinh (Ban hành kèm theo Quyết định số 708/QĐ-BYT ngày 02/3/2015) tác dụng trên Acinetobacter baumannii và Thông tư 19/2018/TT-BYT về Ban hành danh mục thuốc thiết yếu điều trị nhiễm khuẩn, các kháng sinh carbapenem đang được khuyến cáo sử dụng điều trị nhiễm khuẩn Acinetobacter baumannii, đặc biệt là imipenem và meropenem. Rau và thịt là nguồn thực phẩm phổ biến trong cuộc sống hằng ngày của người Việt Nam. Theo báo cáo của Ngân hàng thế giới vào năm 2017, tỉ lệ tiêu thụ rau tại Việt Nam là 0,4 kg rau mỗi ngày trên người và tỉ lệ tiêu thụ rau tại Hà Nội là 2.800 tấn mỗi ngày [3]. Theo Niên giám thống kê năm 2019, sản lượng giết mổ và bán ra của gia cầm, thịt lợn tại Hà Nội là 1302,5 và 3328,8 nghìn tấn [4]. Từ đó cho thấy rau và thịt là nguồn tiêu thụ chính cho nhu cầu ăn uống hằng ngày của người dân Hà Nội. Cũng như các loại thực phẩm khác, thịt và rau ăn sống là nguồn chứa vi sinh vật gây bệnh, và có thể lây truyền chủng vi khuẩn kháng kháng sinh lên người. Vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex đã được phát hiện trong một số loại thực phẩm. Tuy nhiên cho đến nay chưa có báo cáo nào về thực trạng nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex trong rau ăn sống và sản phẩm thịt kháng kháng sinh được tiêu thụ tại Hà Nội được bán tại các quán bán đồ ăn sẵn để cung cấp dữ liệu về thực trạng thực phẩm nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh carbapenem tại Hà Nội cũng như Việt Nam. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định sự lưu hành và tỉ lệ kháng kháng sinh carbapenem của Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex trong mẫu rau ăn sống và thịt chế biến sẵn bán tại các cửa hàng bán đồ ăn sẵn. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu Các vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu này gồm: - Sử dụng phương pháp nghiên cứu mô tả điều tra cắt ngang, thu thập mẫu ngẫu nhiên và dựa trên công thức cỡ mẫu để xác định lượng mẫu tiến hành nghiên cứu: + 240 mẫu thịt chế biến sẵn (sản phẩm từ thịt lợn, vịt, gà: thịt lợn quay, giò, chả, vịt nướng, gà luộc). + 240 mẫu rau ăn sống bán kèm các sản phẩm thịt (rau diếp, xà lách, húng láng, húng quế, mùi ta, mùi tàu, ngổ, hành,...). - Địa điểm thu thập mẫu: tại các cửa hàng bán đồ ăn có kèm rau ăn sống trên địa bàn 06 quận nội thành Hà Nội, bao gồm: Đống Đa, Hoàng Mai, Hai Bà Trưng, Long Biên, Hà Đông, Cầu Giấy. 2 Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021
  5. Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh,... Nguyễn Thành Trung - Thời gian thu thập mẫu: Năm 2019 - 2020. - Các mẫu sau đó được bảo quản tại phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 4oC - 8oC và được phân tích trong ngày hoặc vào ngày hôm sau. 2.2. Hóa chất, chất chuẩn 2.2.1. Hóa chất và dụng cụ Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: Buffer Peptone water (Merck, Đức), TSA agar (Merck, Đức), chromagar Acinetobacter (Chromagar), Mueller Hinton agar (Merck, Đức), VITEK MS-CHCA (Biomerieux, Mỹ), khoanh giấy kháng sinh carbapenem (Liofilchem, Ý), mipenem (IMP, 10 µg), meropenem (MRP, 10 µg). Các dụng cụ được sử dụng bao gồm: Đĩa petri vô trùng (Corning, Mỹ), que cấy vô trùng (Biologix, Mỹ), khay Vitek (Biomerieux, Mỹ). 2.2.2. Chủng chuẩn Phát hiện Acinetobacter baumannii trên rau, tính kháng kháng sinh: sử dụng chủng E. coli ATCC 25922, chủng Acinetobacter baumannii được phân lập trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân tại Bệnh viện Thanh Nhàn [5]. Chủng thu nhận từ Bệnh viện đã được giải trình tự, so sánh với dữ liệu ngân hàng Gen Hoa Kỳ (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), xác định độ tương đồng 100% với chủng Acinetobacter baumannii 2008S11-069. Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật khối phổ thời gian bay sử dụng nguồn tia laser với sự trợ giúp của chất nền (MALDI TOF), sử dụng chủng E. coli ATCC 8739. 2.3. Thiết bị Nồi hấp (Hymaraya, Nhật), tủ sấy (Sanyo, Nhật), cân kỹ thuật D = 0,1 ML802 (Metter Toledor, Thụy Sĩ), tủ ấm (Memert, Đức), tủ an toàn sinh học cấp 2 (Bio II, Anh), máy đồng nhất mẫu (Anh), hệ thống VITEK MS (Biomerieux, Mỹ). 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phát hiện Acinetobacter spp. bằng phương pháp nuôi cấy truyền thống Việc phát hiện Acinetobacter spp. theo phương pháp truyền thống được thực hiện theo các bước như sau: - Cân mẫu: Cân 25 g (từ 0,1 kg rau hoặc thịt đã được đồng nhất). - Tăng sinh 25g mẫu trong 225 mL đệm peptone kép. Tiến hành nuôi qua đêm 37oC/18 ± 2h. - Ria lên môi trường Chromagar Acinetobacter có bổ sung chất bổ sung [6]. - Thu nhận các khuẩn lạc màu đỏ là Acinetobacter spp. 2.4.2. Định danh Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex bằng kỹ thuật MALDI TOF Các bước tiến hành định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật MALDI TOF trên thiết bị VITEK MS theo hướng dẫn của nhà sản xuất thiết bị, cụ thể như sau: - Bước 1: Chủng vi khuẩn được nuôi trên môi trường TSA ở 37oC/24h. Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 3
  6. Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii ... - Bước 2: Vi khuẩn được phết lên từng giếng của khay. - Bước 3: Nhỏ 0,1 μL dung dịch CHCA. - Bước 4: Quét mã khay, nhập mã mẫu vào phần mềm Malditof preparation. - Bước 5: Phân tích trên thiết bị. - Bước 6: Đọc kết quả trên phần mềm Myla. 2.4.3. Xác định tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex bằng kỹ thuật kháng sinh đồ Tính kháng kháng sinh của Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex được thử nghiệm bằng các khoanh giấy kháng sinh theo qui trình hướng dẫn của tổ chức sức khỏe động vật thế giới [7], cụ thể như sau: - Bước 1: Tạo dung dịch chủng Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex: 106 - 108 CFU/mL. - Bước 2: Sử dụng bông tăm vô trùng dàn dịch chủng Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii complex lên đĩa thạch Muller Hinton agar. - Bước 3: Hong khô ở nhiệt độ phòng và đặt khoanh giấy kháng sinh có chứa kháng sinh (nồng độ và các kháng sinh được thể hiện trong (Bảng 1). - Bước 4: Đo kích thước vòng kháng, đối chiếu với kích thước của chủng đối chiếu (E. coli ATCC 25922, A. baumannii đối chứng) theo hướng dẫn của tổ chức Phòng Thí nghiệm và lâm sàng Hoa Kỳ về chuẩn kháng sinh theo Bảng 1 [8]. - Bước 5: Đọc kết quả: kháng, nhạy cảm, không kháng. Bảng 1. Kháng sinh, nồng độ kháng sinh và điểm đọc kháng sinh đồ (kháng, trung gian, không kháng) Điểm đọc tiêu chuẩn Kháng sinh Nồng độ Tên viết tắt Carbapenem kháng sinh (µg) S I R Imipenem IMI 10 ≥ 22 19 - 21 ≤ 18 Meropenem MRP 10 ≥ 18 13 - 17 ≤ 14 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Sự lưu hành vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex 3.1.1. Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn Acinetobacter spp. trong thịt và rau sống Nghiên cứu tiến hành phân tích phát hiện và định lượng vi khuẩn Acinetobacter spp. trong 480 mẫu thịt chế biến sẵn và rau ăn sống tại các quán bán đồ ăn có kèm rau ăn sống thuộc 06 Quận nội thành Hà Nội từ năm 2019 - 2020. Các chủng vi khuẩn màu đỏ xuất hiện trên môi trường Chromagar Acinetobacter có bổ sung kháng sinh được xác định là Acinetobacter spp. (Hình 1). 4 Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021
  7. Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh,... Nguyễn Thành Trung A B Hình 1. Vi khuẩn Acinetobacter spp. trên thạch Chromagar Acinetobacter Chủng vi khuẩn Acinetobacter phân lập từ mẫu Chủng vi khuẩn A. baumannii đối chứng Kết quả phân tích 480 mẫu cho thấy có tới 288 mẫu (chiếm 60%) nhiễm Acinetobacter spp., trong đó có 178/240 mẫu rau (chiếm 74%) và 110/240 mẫu thịt (chiếm 46%) nhiễm Acinetobacter spp. Xét theo thời gian, năm 2019, trong tổng số 240 mẫu được lấy có 165/240 mẫu rau và thịt (65%) nhiễm Acinetobacter spp. Năm 2020, tỉ lệ nhiễm Acinetobacter spp. trong 240 mẫu thu thập cho tỉ lệ thấp hơn với 123/240 mẫu nhiễm, chiếm 51%. (Bảng 2). Bảng 2. Tỉ lệ nhiễm Acinetobacter spp. trong thịt chế biến sẵn và rau ăn sống 2019 (n = 240) 2020 (n = 240) 2019 - 2020 (n = 480) Thực phẩm Mẫu Tỉ lệ Tỉ lệ nhiễm Mẫu nhiễm Mẫu nhiễm Tỉ lệ nhiễm nhiễm nhiễm Thịt chế biến sẵn 63 53% 47 39% 110 46% (n = 240) Rau ăn sống 102 85% 76 63% 178 74% (n = 240) Tổng 165 65% 123 51% 288 60% Kết quả phân tích của nghiên cứu này tương đồng với các kết quả ở nhiều nước trên thế giới về sự hiện diện của vi khuẩn Acinetobacter spp. trên đối tượng rau ăn sống nhưng có tỉ lệ nhiễm cao hơn. Trong một nghiên cứu của Berlau và cộng sự [9] được thực hiện năm 1999 ghi nhận tỉ lệ nhiêm Acinetobacter spp. trong mẫu rau và quả tươi là 17%. Nghiên cứu của Hamiton- Miler và Shah (2001) cho thấy sự xuất hiện của 02 chủng Acinetobacter spp. trên mẫu rau salad ăn sống [10]. Tại Hồng Kông (2001), 51% mẫu rau (n = 21) nhiễm Acinetobacter spp [11]. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy tỉ lệ nhiễm Acinetobacter spp. trong rau ăn sống (74%) thấp hơn nghiên cứu của Carvalheira và cộng sự (2017), thực hiện tại Bồ Đào Nha, đã ghi nhận 86,7% rau diếp nhiễm Acinetobacter spp. [12]. Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 5
  8. Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii ... Sự nhiễm các vi khuẩn Acinetobacter spp. có tỉ lệ cao trên rau ăn sống được xác định có thể do lây nhiễm trong quá trình trồng trọt bắt nguồn từ nguồn nước tưới và đất, hoặc một nguyên nhân thường thấy tại các nước đang phát triển là rau có thể được rửa tại nguồn nước ô nhiễm trước khi phân phối ra thị trường. Trong sản xuất nông nghiệp, rau nhiễm các vi sinh vật gây bệnh có thể liên quan tới quá trình sử dụng nước ao và nước sông để rửa rau, cách thức xử lý rau của người trồng rau và lưu trữ rau ở những nơi bị ô nhiễm. Các nghiên cứu trên thế giới và trong nước đều cho thấy sự hiện diện của vi khuẩn trong nước rửa rau, rau ăn sống và sự ô nhiễm vi sinh lên sản phẩm thực vật bởi nguồn chất thải của con người là một thực tế tại các nước đang phát triển, nông nghiệp canh tác theo mô hình vườn ao chuồng. Sự lây truyền vi khuẩn từ nguồn nước lên rau sống xảy ra trong quá trình trồng trọt đã được biết đến như là một con đường lây nhiễm trong chuỗi cung ứng thực phẩm và là một hiện tượng tất yếu. Điều này lý giải cho sự nhiễm khuẩn Acinetobacter spp. trong rau ăn sống thu thập trên địa bàn Hà Nội với tỉ lệ cao chiếm 74%, khi tại Việt Nam vẫn còn các vùng thâm canh, sử dụng nguồn nước tưới chưa qua kiểm soát chất lượng để trồng rau, và dễ dàng bắt gặp hình ảnh những người nông dân, người bán hàng rửa rau tại các ao hồ, kênh mương trước khi đưa đi tiêu thụ. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi có sự tương đồng về sự có mặt của vi khuẩn Acinetobacter spp. với các nghiên cứu của các tác giả khác trên thế giới trong thịt chế biến sẵn, tuy khác nhau về tỉ lệ nhiễm. Nghiên cứu của Chalchisa và Kenasa tại Nigeria (2019) trên thịt chế biến sẵn trong cửa hàng ăn của Trường đại học Wollega, cho thấy 10.3 % mẫu nhiễm Acinetobacter spp. [13]. Một nghiên cứu khác của Oranusl và Bralde [14] cho thấy sự hiện diện của Acinetobacter spp. trong bánh thịt. Trong đó, chủng vi khuẩn này được xác định là 01 trong 03 chủng vi sinh vật là nguyên nhân gây hỏng thịt trong nghiên cứu của Lulietto và cộng sự [15]. Sự ô nhiễm Acinetobacter spp. trong sản phẩm thịt chế biến sẵn có thể là do quá trình xử lý, cắt lát, đóng gói, và làm lạnh. Nguồn gốc của sự lây nhiễm có thể đến từ các nguyên liệu thô được sử dụng đã dẫn đến sự lây nhiễm Acinetobacter spp. trong sản phẩm thịt và môi trường nhà bếp nơi chế biến sản phẩm thịt [15]. 3.1.2. Định danh vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex 288 chủng vi khuẩn Acinetobacter spp. thu thập được từ các mẫu nghiên cứu và tiến hành định danh xác định nhóm vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex bằng kỹ thuật MALDI-TOF trên thiết bị VITEK MS. Kết quả cho thấy 208/288 (72%) chủng Acinetobacter spp. là Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex được xác định với độ tương đồng 99,9%, tương đương với 43% (208/480) mẫu rau và thịt nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex. Trong đó 156/178 chủng phân lập từ mẫu rau và 52/110 chủng phân lập từ mẫu thịt là Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex, lần lượt là 88% và 47% trong nhóm Acinetobacter spp. đã được phân lập; tương đương 65% (n = 240) mẫu rau ăn sống và 22% (n = 240) mẫu thịt nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex. 3.2. Vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex kháng kháng sinh carbapenem Kết quả kiểm tra khoanh giấy kháng sinh thu được tỉ lệ kháng carbapenem cao trên các chủng Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex được thu thập (Bảng 3). Tỉ lệ kháng kháng sinh được phát hiện với 82% và 30% của chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii complex tương ứng với kháng với kháng sinh imipenem và meropenmem. 6 Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021
  9. Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh,... Nguyễn Thành Trung Bảng 3. Tính kháng kháng sinh carbapenem của vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii complex Kháng sinh Nồng độ kháng Tên viết tắt Số chủng kháng Tỉ lệ kháng (%) carbapenem sinh (µg) Imipenem IMI 10 171 82 Meropenem MRP 10 62 30 Tỉ lệ kháng kháng sinh thuộc nhóm carbapenem (imipenem và meropenem) trên sản phẩm thịt và rau ăn sống cao với các chủng Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex phân lập được trên mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân. Trong nghiên cứu của Tran và cộng sự thực hiện từ năm 2010 - 2014 tại 03 bệnh viện lớn tại Hà Nội (Việt Đức, Thanh Nhàn và Xanh Pôn), cho thấy 23/528 chủng kháng carbapenem [16]. Điều này cho thấy thực phẩm có thể là vật chủ trung gian lây truyền vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex lên người. Tỷ lệ kháng kháng sinh thuộc nhóm carbapenem cao (82% với immipenem và 30% với meropenem) có thể xuất phát từ việc sử dụng kháng sinh carbapenem cho điều trị bệnh nhiễm khuẩn do Acinetobacter baumannii tại các bệnh viện. Nguồn nước thải từ bệnh viện có chứa mầm bệnh, phát tán ra môi trường khi chưa xử lý, sẽ phát tán mầm bệnh chứa gen kháng kháng sinh lên các thực phẩm (rau sống, thịt tươi, …) trong quá trình chăn nuôi, trồng trọt và giết mổ. 4. KẾT LUẬN Kết quả nghiên cứu trên 480 mẫu rau và thịt sống thu thập tại các cửa hàng bán đồ ăn sẵn ở 06 quận nội thành Hà Nội cho thấy vi khuẩn Acinetobacter spp. được phát hành trên 288 mẫu (60%), trong đó, 208 mẫu (43%, n = 480) nhiễm Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex với 156 mẫu rau ăn sống (65%, n = 240) và 52 mẫu thịt (22%, n = 240). Trong đó, 82% và 30% chủng vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex đã được phân lập (n = 208) kháng với kháng sinh imipenem và meropenem. TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. H. J. Doughari, P. A. Ndakidemi, I. S. Human, & S. Benade, “The Ecology, Biology and Pathogenesis of Acinetobacter spp.: An Overview,” Microbes Environments, vol. 26, no. 2, pp. 101-112, 2011. [2]. A. Howard, M. O’Donoghue, A Feeney, & R. D. Sleator, “Acinetobacter baumannii: An emerging opportunistic pathogen,” Virulence, vol. 3, no. 3, pp. 243-250, 2012. [3]. World Bank, Vietnam food safety risks management : challenges and opportunities: Quản lý nguy cơ an toàn thực phẩm ở Việt Nam : những thách thức và cơ hội (Vietnamese). Washington, D.C.: World Bank Group, 2017. [4]. Tổng cục thống kê, Niên giám thống kê. Nhà xuất bản thống kê. Hà Nội: Nhà xuất bản Thống Kê, 2019. [5]. Bệnh viện Thanh Nhàn, “Đề tài: Nghiên cứu qui trình chế tạo bộ kit Multiplex Realtime Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 7
  10. Xác định vi khuẩn Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii ... PCR phát hiện một số tác nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện tại các bệnh viện Hà Nội,” mã số 01C-08/02-2016, 2016 – 2018. [6]. A. Y. Ciftci, E. Karakece, A. R. Atasoy, G. Asik, and I. H. Ciftci, “Culture media for detection of Acinetobacter baumannii selective media for detection of A. baumannii,” Journal of Microbioly and Experimentation, vol. 2, no. 3, pp. 87-90, 2015. [7]. World Organisation for Animal Health, “Chapter 2.1.1 Laboratory Methodologies for Bacterial Antimicrobial Susceptibility Testing,” OIE Manual of diagnostic tests and vaccines for Terrestrial Animals, 2019. [8]. Clinical and Laboratory Standard Institute, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, 2019. [9]. J. Berlau, H. M. Aucken, E. Houang, T. L. Pitt, “Isolation of Acinetobacter spp. including A. baumannii from vegetables: implications for hospital-acquired infections”, Journal of Hospital Infection, vol. 42, 201-204, 1999. [10]. J. M. T. Hamilton-MillerSarojShah, “Identity and antibiotic susceptibility of enterobacterial flora of salad vegetables,” International Journal of Antimicrobial Agents, vol. 18, no. 1, pp. 81-83, 2001. [11]. E. T. Houang, Y. W. Chu, C. M. Leung, K. Y. Chu, J. Berlan, K. C. Ng, and A. F. B. Chong, “Epidemiology and infection control implications of Acinetobacter spp. in Hong Kong,” Journal Clinical Microbiology, vol. 39, no.1, pp. 228-234, 2001. [12]. A. Carvalheira, Joana Silva, Paula Teixeira, “Acinetobacter spp. in food and drinking water – A review,” Food Microbiology, 2020. [13]. W.  Chalchisa & G. Kenasa, “Microbial Quality and Safety of Ready-to-Eat Foods in Cafeterias around Wollega University, Nekemte Campus (Ethiopia),” Research & Reviews: Journal of Food and Dairy Technology, 2019. [14]. U. S. Oranusi & W. Braide, “A study of microbial safety of ready-to-eat foods vended on highways: Onitsha-Owerri, south east Nigeria,” International Research Journal of Microbiology, vol. 3, no. 2, pp. 066-071, 2012. [15]. M. F. Lulietto, P. Sechi, E. Borgogni, and B. T. Cenci-Goga, “Meat Spoilage: A Critical Review of a Neglected Alteration Due to Ropy Slime Producing Bacteria,” Italian Journal of Animal Science, vol. 14, no. 3, pp. 4011, 2015. [16]. D. N. Tran, H. H. Tran, M. Matsui, M. Suzuki, K. Shibayama, T. D. Pham, T. T. Van Phuong, D. A. Dang, H. S. Trinh, C. T. Loan, L. T. V. Nga, H. R. Van. Doom, and H. F. L. Wertheim, “Emergence of New Delhi metallo-beta-lactamase 1 and other carbapenemase-producing Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex among patients in hospitals in Ha Noi, Viet Nam,” European Journal of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, vol. 36, pp. 219-225, 2017. 8 Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021
  11. Tạ Thị Yến , Phạm Thị Loan, Ninh Thị Hạnh,... Nguyễn Thành Trung Identification of carbapenem - resistant Acinetobacter calcoaceticus - Acinetobacter baumannii complex in ready-to-eat vegetables and meats in Hanoi Ta Thi Yen, Pham Thi Loan, Ninh Thi Hanh, Vu Thi Hai Ha Pham Van Quan, Nguyen Thanh Trung National Institute for Food Control, Hanoi, Vietnam Abstract Acinetobacter spp. are common pathogenic bacteria. The Acinetobacter genus includes 65 species, of which the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex group has been identified as the cause of more than 80% of hospital infections in immunocompromised patients. Existing phenotypic techniques are not sufficient to accurately identify and distinguish clinically important Acinetobacter spp. In total of 480 samples including raw vegetables and processed meat which collected in six districts of Hanoi (Dong Da, Hoang Mai, Hai Ba Trung, Long Bien, Ha Dong, Cau Giay) in which 288 samples (60%) were contaminated with Acinetobacter spp. The results of identification by MALDI-TOF MS technique recorded 208 (43%, n = 480) of samples contaminated with Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex, of which 156 (65%, n = 240) of vegetables and 52 (22%, n = 240) of meat samples. Antibiotic susceptibility tests using antibiotic paper strips showed that 82% of Acinetobacter calcoaceticus- Acinetobacter baumannii complex strains were resistant to imipenem and 30% of the complex was resistant to meropenem. Keywords: Acinetobacter spp., Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex, MALDI-TOF MS, carbapenem. Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 9
  12. Nghiên cứu khoa học Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol trong huyết tương thỏ bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) Lê Minh Anh1, Nguyễn Thạch Tùng1*, Nguyễn Như Nam1 Bùi Quang Đông2, Phạm Thành Đạt1, Nguyễn Thị Hồng Ngọc2, Trần Cao Sơn2* 1 Trường Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam 2 Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia, Hà Nội, Việt Nam (Ngày đến tòa soạn: 28/12/2020; Ngày chấp nhận đăng: 15/03/2021) Tóm tắt Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) đã được phát triển để định lượng nồng độ esomeprazol trong huyết tương thỏ. Kỹ thuật QuEChERS được sử dụng để chiết và làm sạch esomeprazol trong huyết tương. Sau đó, chất phân tích được tách bằng sắc ký lỏng pha đảo với cột C18 và định lượng bằng khối phổ ba tứ cực. Nguồn ion hóa ESI dương, chế độ theo dõi ion MRM đã được sử dụng trong nghiên cứu. Pantoprazol được sử dụng làm chất chuẩn nội cho esomeprazol. Giá trị sử dụng của phương pháp được xác nhận theo hướng dẫn của ICH về thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học. Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp có độ đặc hiệu tốt, đường chuẩn được xây dựng trong khoảng nồng độ 0,1 - 20 ng/mL, giới hạn định lượng dưới là 0,1 ng/mL; độ đúng và độ chính xác trong khoảng nồng độ từ 0,1 đến 20 ng/mL đều đáp ứng theo yêu cầu của ICH và AOAC. Hàm lượng chất phân tích trong mẫu huyết tương ổn định trong 3 chu kỳ đông - rã đông trong vòng 03 tháng và nồng độ chất phân tích trong dịch chiết ổn định trong 24 giờ lưu giữ trong bộ tiêm mẫu. Phương pháp được áp dụng để định lượng nồng độ esomeprazol trong huyết tương thỏ và ứng dụng để so sánh sinh khả dụng của hai chế phẩm có chứa esomeprazol. Từ khóa: Esomeprazol, pantoprazol, LC-MS/MS, huyết tương thỏ, QuEChERS.  1. ĐẶT VẤN ĐỀ Esomeprazol (5-methoxy-2-{[(4-methoxy-3,5-dimethylpyridin-2-yl) methyl] sulfinyl}- 1H-benzimidazol) là hoạt chất thuộc nhóm ức chế bơm proton, được chỉ định điều trị loét dạ dày - tá tràng, trào ngược dạ dày - thực quản, hội chứng tăng tiết acid dịch vị, dự phòng loét dạ dày - tá tràng khi sử dụng thuốc chống viêm không steroid, do stress [1-2]. Do đặc tính kém bền trong môi trường acid dịch vị nên các chế phẩm chứa esomeprazol đều được bào chế dưới dạng thuốc giải phóng tại ruột [3]. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu để xác định nồng độ esomeprazol trong dịch sinh học bằng HPLC-UV hoặc LC-MS/MS. Với HPLC-UV, Talaat và cộng sự (2017) đã xây dựng phương pháp định lượng nồng độ esomeprazol trong huyết tương và đạt được giới hạn định lượng dưới (LLOQ) rất thấp 0,092 ng/mL [4]. Tuy nhiên, phương pháp HPLC-UV thường có độ đặc hiệu thấp và phần lớn các nghiên cứu sử dụng LC-MS/MS để định lượng esomeprazol trong nền mẫu dịch sinh học. Chunduri và cộng sự (2016) đã nghiên cứu xây dựng phương Điện thoại: 0969748898 * Email: nguyenthachtung@hup.edu.vn Điện thoại: 0988683282 * Email: sontc@nifc.gov.vn 10 Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021
  13. Lê Minh Anh, Nguyễn Thạch Tùng , Nguyễn Như Nam... Trần Cao Sơn pháp định lượng esomeprazol trong huyết tương bằng UPLC-MS/MS với LLOQ là 0,1 ng/mL [5]. Elkady và cộng sự (2018) cũng đã nghiên cứu định lượng nồng độ esomeprazol trong huyết tương bằng LC-MS/MS với LLOQ là 20 ng/mL, độ thu hồi từ 88,7 -104% [6]. QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged, safe) là kỹ thuật xử lý mẫu để xác định dư lượng hóa chất bảo vệ thực vật trong mẫu thực phẩm do Anastassiades và cộng sự phát triển [7]. Cơ chế chung của kỹ thuật QuEChERS là làm tăng tính phân cực của pha nước khi thêm muối chiết từ đó tách pha dung môi hữu cơ khỏi pha nước, chất phân tích được chiết vào pha hữu cơ và tiến hành phân tích ở các bước tiếp theo. Gần đây, nhiều nghiên cứu đã ứng dụng kỹ thuật QuEChERS để phân tích hoạt chất trong dịch sinh học với nhiều ưu điểm vượt trội như độ nhạy tốt, tính đặc hiệu cao, thời gian phân tích nhanh, quá trình xử lý mẫu đơn giản. Nghiên cứu này thực hiện xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng esomeprazol trong huyết tương thỏ bằng LC-MS/MS kết hợp xử lý mẫu bằng kỹ thuật QuEChERS hạn chế ảnh hưởng của nền mẫu so với nhiều phương pháp định lượng trước đây, nghiên cứu này cũng đề cập đến độ ổn định của mẫu mà ít nghiên cứu đã công bố. Phương pháp được ứng dụng để phân tích esomeprazol trong huyết tương, phục vụ đánh giá sinh khả dụng của chế phẩm có chứa esomeprazol. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng và mẫu nghiên cứu Đối tượng nghiên cứu là esomeprazol trong huyết tương thỏ. Mẫu nghiên cứu gồm: mẫu trắng là mẫu huyết tương thỏ không có chất phân tích, mẫu chuẩn là mẫu chứa esomeprazol trong dung môi acetonitril, mẫu trắng thêm chuẩn là mẫu huyết tương có chứa chuẩn esomeprazol, mẫu thực là mẫu huyết tương có chứa esomeprazol được lấy và xử lý sau khi cho thỏ uống chế phẩm có chứa esomeprazol. 2.2. Hóa chất, chất chuẩn và động vật nghiên cứu Chất chuẩn esomeprazol natri (SKS:0114302.01) hàm lượng 96,31% được đóng gói trong lọ thủy tinh tối màu (200 mg/lọ), bảo quản ở điều kiện 2oC - 8oC, tránh ánh sáng; và chuẩn nội pantoprazol (SKS: 0114306.01) có nguồn gốc từ Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung Ương, muối magnesi sulfat khan có nguồn gốc từ Đức (TCNSX), muối natri clorid có nguồn gốc từ Trung Quốc (TCNSX), các dung môi gồm acetonitril (ACN), methanol (MeOH) và acid formic có nguồn gốc từ Merck (Đức) đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết dùng cho HPLC và LC-MS. Động vật nghiên cứu là thỏ trắng giống đực trưởng thành (4 - 6 tháng tuổi), khối lượng khoảng 2 kg, được nhập về trước khi tiến hành thí nghiệm 02 tuần và nuôi trong Phòng thí nghiệm dược lý Trường Đại học Dược Hà Nội. 2.3. Thiết bị và dụng cụ Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ hai lần gồm thiết bị khối phổ SCIEX ExionLCTM AD Triplequad 6500+ (Mỹ) kết nối với sắc ký lỏng LC 20AD XR của SCIEX (Mỹ). Một số thiết bị phụ trợ khác bao gồm máy ly tâm Mikro 220 (Mỹ); máy ly tâm Hermle Z200A (Mỹ); cân phân tích (có độ chính xác 0,1 mg) XS105 (Metter Toledo) và các thiết bị, dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm. Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 11
  14. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol... 2.4. Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS để phân tích esomeprazol Để tối ưu hóa điều kiện phân tích, tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn esomeprazol 1 µg/mL và pantoprazol 1 µg/mL vào detector MS/MS với nguồn ion hóa phun điện tử ESI dương. Chọn chế độ khảo sát tự động để bắn phá ion phân tử thành các ion con, lựa chọn ion con có cường độ tín hiệu cao nhất để định lượng và ion con có cường độ thấp hơn để định tính. Tối ưu hóa năng lượng bắn phá (CE) tự động theo phần mềm Analyst 1.7 của thiết bị. Đối với điều kiện LC sử dụng cột sắc ký Agilent Eclipse Plus C18 (150 mm x 2,1 mm), kích thước hạt nhồi 3,5 µm, tốc độ dòng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL, thành phần pha động gồm ACN và dung dịch acid formic 0,1%, tốc độ dòng là 0,5 mL/phút và tiến hành khảo sát điều kiện chương trình gradient rửa giải chất phân tích. 2.4.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu Điều kiện xử lý mẫu được tối ưu thông qua việc khảo sát một số quy trình sau: Quy trình 1: Sử dụng kỹ thuật chiết lỏng - lỏng [5]. Hút chính xác 475 µL huyết tương cho vào ống ly tâm 2 mL. Thêm chính xác 25 µL dung dịch chuẩn nội 100 ng/mL và 500 µL dung môi chiết. Lắc xoáy trong 1 phút. Ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Hút 250 µL lớp dung môi phía trên, thổi khô bằng khí N2, hòa tan lại cắn bằng 250 µL acetonitril. Khảo sát một số môi trường chiết với quy trình 1: ethyl acetat (EtOAc), diethyl ether (DE), hỗn hợp methyl tert buthyl ether (MTBE) : ethyl acetat (8 : 2), hỗn hợp methyl tert buthyl ether: ethyl acetat (5 : 5). Quy trình 2: Sử dụng kỹ thuật chiết QuEChERS [7]. Hút chính xác 475 µL huyết tương cho vào ống ly tâm 2 mL. Thêm chính xác 25 µL dung dịch chuẩn nội pantoprazol 100 ng/mL và 500 µL acetonitril. Lắc xoáy trong vòng 1 phút. Thêm muối chiết vào mỗi ống ly tâm. Tiếp tục lắc xoáy trong 1 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút 200 µL lớp dịch lỏng trên cùng vào lọ mẫu, tiến hành định lượng nồng độ dược chất bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS. Khảo sát các loại muối chiết với quy trình 2: MgSO4, MgSO4 + NaCl, MgSO4 + PSA, CH3COONH4, MgSO4 + C18 và NH4Cl. 2.4.3. Thẩm định phương pháp Tiến hành thẩm định phương pháp đã tối ưu thông qua các thông số cơ bản gồm: độ đặc hiệu; giới hạn định lượng dưới (LLOQ); đường chuẩn; độ đúng và độ chính xác; độ thu hồi; độ ổn định của huyết tương trong thời gian dài, sau 3 chu kì đông - rã đông và sau xử lý - bảo quản trong bộ phận tiêm mẫu tự động. Các kết quả được đánh giá so sánh với các quy định theo Dược điển Việt Nam V, ICH, FDA và AOAC [8-11]. 2.4.4. Nghiên cứu dược động học Hai chế phẩm gồm chế phẩm đối chiếu bột pha hỗn dịch Nexium 10 mg hàm lượng 99,7% so với nhãn (LOT RCWB/EXP 31-03-20) và chế phẩm bào chế micropellet chứa esomeprazol dạng bào chế giải phóng tại ruột hàm lượng 12,4% được cho uống trên thỏ để xây dựng mô hình dược động học không ngăn. Thỏ được chia làm 02 nhóm, mỗi nhóm 03 con, không cho ăn vào ngày trước ngày tiến hành nghiên cứu, mức liều tham khảo hướng dẫn của FDA [12]. Nhóm 1 cho uống chế phẩm đối chiếu với liều 2,5 mg/kg. Nhóm 2 cho uống micropellet với liều 2,5 mg/kg. Sau khi cho thỏ uống thuốc, tiến hành lấy 3 mL máu ở tĩnh mạch tai thỏ cho vào ống có chứa EDTA tại các thời điểm xác định 0 giờ; 0,25 giờ; 0,5 giờ; 1 giờ; 1,5 giờ; 2 giờ; 12 Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021
  15. Lê Minh Anh, Nguyễn Thạch Tùng , Nguyễn Như Nam... Trần Cao Sơn 2,5 giờ; 3 giờ; 3,5 giờ; 4 giờ; 6 giờ; 8 giờ; 24 giờ. Ly tâm mẫu máu với tốc độ 6.000 vòng/phút trong 15 phút. Thu huyết tương, bảo quản ở -10oC trước khi phân tích. 2.4.5. Phương pháp xử lý số liệu Xử lý các số liệu thống kê bằng phần mềm Microsoft Excel 2010. Nồng độ esomeprazol trong huyết tương được tính toán bằng phần mềm Analyst 1.7 trên thiết bị sắc ký lỏng khối phổ. 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Tối ưu hóa phương pháp phân tích esomeprazol bằng LC-MS/MS 3.1.1 Khảo sát điều kiện về khối phổ Thiết bị khối phổ ba tứ cực với nguồn ion hóa phun điện tử, chế độ ion dương được sử dụng để khảo sát điều kiện ion mẹ và ion con tối ưu. Kết quả được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Các ion phân tử và ion con trong phân tích khối phổ Mảnh mẹ Mảnh con Chất phân tích CE (eV) Ghi chú (m/z) (m/z) 198,0 25 Định tính (26,6%*) Esomeprazol 346,1 168,0 21 Định lượng 151,0 29 Định tính (44,8%*) 138,0 43 Định tính (82,9%*) Pantoprazol 384,0 200,0 19 Định lượng (chuẩn nội) 153,0 23 Định tính (4,7%*) * Tỷ lệ ion định tính so với ion định lượng Các thông số phân tích khối phổ khác được tối ưu bao gồm: Điện thế đầu phun 5.500V; nhiệt độ đầu phun 450oC; áp suất khí bổ trợ 30 psi; áp suất khí mang 8 psi. 3.1.2. Khảo sát điều kiện sắc ký Sau khi lựa chọn được ion phân tử, ion con và các điều kiện tối ưu, tiến hành phân tích dung dịch chuẩn esomeprazol có nồng độ 50 ng/mL và nội chuẩn pantoprazole có nồng độ 50 ng/mL. Gradient pha động gồm 2 kênh acetonitril và acid formic 0,1% được khảo sát để tối ưu, tốc độ dòng 0,5 mL/phút, thể tích tiêm 10 µL, cột sắc ký Agilent Eclipse Plus C18 (150 mm x 2,1 mm), kích thước hạt nhồi 3,5 µm. Kết quả điều kiện gradient tối ưu được thể hiện trong Bảng 2. Bảng 2. Chương trình dung môi của phương pháp sắc ký lỏng khối phổ Pha động Thời gian (phút) Acid formic 0,1 %/H2O (%) ACN (%) 0,00 10 90 2,50 10 90 5,00 90 10 7,00 90 10 7,50 10 90 10,00 10 90 Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 13
  16. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol... Hình 1 thể hiện sắc ký đồ của esomeprazol và pantoprazol trong dung môi ACN sau khi đã xác định được các điều kiện LC-MS/MS. Pic thu được cân đối, nhọn, không có hiện tượng dính pic, điều kiện phân tích là phù hợp để tiến hành định lượng esomeprazol trong huyết tương. Hình 1. Sắc ký đồ của chất chuẩn esomeprazol 5 ng/mL (A) và chuẩn nội pantoprazole 5 ng/mL (B) pha trong dung môi acetonitril 3.2. Khảo sát quy trình xử lý mẫu 3.2.1. Lựa chọn quy trình Quy trình 1 sử dụng một số loại dung môi để khảo sát được tham khảo [5]: ethyl acetat (EtOAc) QT 1.1, diethyl ether (DE) QT 1.2, hỗn hợp methyl tert buthyl ether (MTBE): ethyl acetat (8 : 2) QT 1.3, hỗn hợp methyl tert buthyl ether : ethyl acetat (5 : 5) QT 1.4. Quy trình 2 là phương pháp QuEChERS, sử dụng muối chiết là MgSO4 QT 2. Với quy trình chuẩn bị mẫu như đã trình bày ở mục 2.4.2. Các kết quả được trình bày ở Hình 2 và Bảng 3. Esomeprazol Pantoprazol Hiệu suất thu hồi % QT 1.1 QT 1.2 QT 1.3 QT 1.4 QT 2 Hình 2. Kết quả khảo sát quy trình chiết 14 Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021
  17. Lê Minh Anh, Nguyễn Thạch Tùng , Nguyễn Như Nam... Trần Cao Sơn Bảng 3. Hiệu suất thu hồi và ảnh hưởng của nền mẫu với các loại dung môi trong phương pháp chiết lỏng - lỏng Hiệu suất thu hồi (%) Ảnh hưởng của nền Loại dung môi Chuẩn Nội chuẩn mẫu (% N) EtOAc 69,91 96,20 24,68 DE 47,29 60,53 52,71 MTBE:EtOAc (8 : 2) 69,53 92,83 16,65 MTBE:EtOAc (5 : 5) 68,66 87,51 19,25 Chú thích: Ảnh hưởng của nền mẫu: N = (Sc – Sspk)/Sc x 100% Trong đó: Sc là diện tích pic chất phân tích pha trong dung môi. Sspk là diện tích pic chất phân tích được thêm vào trước quy trình chiết. Hiệu suất thu hồi với tất cả các loại dung môi ở cả chất chuẩn (47,3 - 69,9%), chất chuẩn nội (60,5 - 96,2%) và giữa chất chuẩn so với chất chuẩn nội trong quy trình 1 đều thấp, ảnh hưởng của nền mẫu trong quy trình 1 lên kết quả lớn (16,7 - 52,7%). Ngược lại, quy trình 2 cho hiệu suất thu hồi ở cả chất chuẩn (90,7%) và chất chuẩn nội (83,8%) đều cao, đặc biệt là hiệu suất thu hồi chất chuẩn tăng đáng kể so với quy trình 1. Việc không sử dụng bước làm sạch cho hiệu suất cao trong thu hồi pantoprazol với dung môi ethyl acetat (96,2%) hay MTBE: EtOAc (8 : 2) (92,8%) nhưng ảnh hưởng của nền mẫu cũng cao do dịch chiết vẫn còn nhiều tạp. Kỹ thuật QuEChERS cho hiệu suất thu hồi cao, hạn chế ảnh hưởng của nền mẫu, do đó quy trình xử lý mẫu 2 (kỹ thuật QuEChERS) được lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo. 3.2.2. Khảo sát muối chiết Loại muối chiết và lượng muối chiết có ảnh hưởng lớn đến độ thu hồi. Cố định nồng độ thêm chuẩn là 50 ng/mL để thực hiện các bước khảo sát. Một số muối chiết thông thường sử dụng cho phương pháp QuEChERS được tiến hành khảo sát: MgSO4, MgSO4 + NaCl, MgSO4 + PSA, MgSO4 + C18, CH3COONH4, NH4Cl [7]. Sau khi hút 450 µL huyết tương trắng đã được xác định là không có esomeprazol, thêm 25 µL dung dịch chuẩn nội 1 µg/mL và 25 µL dung dịch chất chuẩn 1 µg/mL, thêm 500 µL acetonitril và tiến hành chiết mẫu với 06 loại hỗn hợp muối chiết khác nhau: 0,2 g MgSO4 (QT 2.1); 0,2 g MgSO4 + 0,05 g NaCl (QT 2.2); 0,2 g MgSO4 + 0,05 g PSA (QT 2.3); 0,2 g MgSO4 + 0,05 g C18 (QT 2.4); 0,2 g CH3COONH4 (QT 2.5); 0,2 g NH4Cl (QT 2.6), tiến hành các bước như quy trình. Kết quả thu được thể hiện trong Hình 3. Hình 3. Hiệu suất thu hồi của esomeprazol theo các quy trình xử lý mẫu khác nhau Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 15
  18. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol... Sử dụng muối chiết NH4Cl, CH3COONH4 làm cho thể tích lớp acetonitril tách ra ít, dẫn tới không chiết được hoàn toàn chất phân tích ra khỏi pha nước. Với các muối chiết còn lại MgSO4, MgSO4 + NaCl, MgSO4 + PSA, MgSO4 + C18 cho thể tích lớp acetonitril tương đương nhau, với cách sử dụng hỗn hợp muối MgSO4 + NaCl cho hiệu suất thu hồi mẫu chuẩn cao nhất. Do đó, hỗn hợp muối MgSO4 + NaCl được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Như vậy, quy trình xử lý mẫu huyết tương được tối ưu như sau: Hút chính xác 475 µL huyết tương cho vào ống ly tâm 2 mL. Thêm chính xác 25 µL dung dịch chuẩn nội pantoprazol 100 ng/mL và 500 µL acetonitril. Thực hiện lắc xoáy trong vòng 1 phút. Thêm vào mỗi ống ly tâm hỗn hợp muối chiết 0,2 g MgSO4 + 0,05 g NaCl. Tiếp tục lắc xoáy trong 1 phút. Sau đó ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút 200 µL lớp dịch lỏng trên cùng vào lọ mẫu, tiến hành định lượng nồng độ esomeprazol bằng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS. 3.3. Thẩm định phương pháp phân tích 3.3.1. Độ đặc hiệu Đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp qua các tiêu chí sau: + Tính số điểm IP (IP - Identification point): Theo cách tính điểm IP đối với mỗi ion mẹ là 1 điểm, mỗi ion con là 1,5 điểm. Kết quả thu được trên mẫu chuẩn và trên mẫu trắng thêm chuẩn cho thấy esomeprazol và pantoprazol đều có số điểm IP = 5,5 ≥ 4; thỏa mãn yêu cầu phân tích khối phổ LC-MS/MS của AOAC [10]. A B C Hình 4. Sắc ký đồ thẩm định tính đặc hiệu của phương pháp phân tích xác định nồng độ esomeprazol trong huyết tương bằng thiết bị LC-MS/MS (A: Sắc ký đồ của mẫu trắng, B: Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm esomeprazol chuẩn, C: Sắc ký đồ của mẫu trắng thêm chuẩn nội pantoprazol chuẩn) + Phân tích mẫu trắng (n = 6), mẫu trắng thêm chuẩn esomeprazol 5 ng/mL và pantoprazol 5 ng/mL theo phương pháp đã được xây dựng. Trên sắc ký đồ của mẫu huyết tương trắng (Hình 4A), tại thời điểm 4,39 phút và 4,55 phút trùng với thời gian lưu của esomeprazol và pantoprazol (Hình 4B và 4C) không xuất hiện các pic có mảnh phổ khối m/z = 346,1/168 (đặc trưng của esomeprazol), mảnh phổ khối m/z = 384/200 (đặc trưng cho pantoprazol). Do vậy, phương pháp phân tích có độ đặc hiệu với esomeprazol và pantoprazol theo các quy định của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [9, 11]. 3.3.2. Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Tiến hành thêm chuẩn vào huyết tương trắng ở các mức nồng độ từ 0,1 đến 20,0 ng/mL có thêm 5 ng/mL chuẩn nội pantoprazol và phân tích trên LC-MS/MS. Xây dựng đường phụ 16 Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021
  19. Lê Minh Anh, Nguyễn Thạch Tùng , Nguyễn Như Nam... Trần Cao Sơn thuộc giữa nồng độ esomeprazol thu được với tỷ lệ giữa diện tích pic chất chuẩn và diện tích pic chuẩn nội. Đường chuẩn được lập theo phần mềm của thiết bị, theo phương pháp hồi quy tuyến tính, sử dụng hệ số tỷ trọng 1/x2. Các kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ đã khảo sát có sự tương quan tuyến tính nồng độ với tỷ lệ tín hiệu của esomeprazol và chuẩn nội, phương trình hồi quy tuyến tính thu được là y = 0,0345x + 0,0016, với hệ số tương quan tuyến tính r2 > 0,99 và độ chệch < 15% ở tất cả các giá trị nồng độ đạt yêu cầu cho phép theo quy định của phương pháp pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học [9, 11]. 3.3.3. Đánh giá ảnh hưởng nền Ảnh hưởng nền của phương pháp được đánh giá thông qua so sánh đường chuẩn pha trên nền mẫu và trên nền dung môi, trong khoảng nồng độ 0,1 đến 20,0 ng/mL. Kết quả thu được dựa trên phương pháp hồi quy tuyến tính và được lập trên phần mềm của thiết bị phân tích. Phương trình hồi quy của mẫu chuẩn là y = 0,0287x + 0,0013, r2 > 0,99; phương trình hồi quy của mẫu trắng thêm chuẩn là y = 0,0345x + 0,0016, r2 > 0,99. Hệ số góc của 2 đường chuẩn thu được lệch nhau 16,8% đạt yêu cầu cho phép theo quy định của phương pháp pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học (dưới 20%) [8]. 3.3.4. Giới hạn định lượng dưới (LLOQ) Phân tích mẫu huyết tương trắng và mẫu huyết tương chứa esomeprazol với nồng độ 0,1 ng/mL. Xác định diện tích pic esomeprazol và chuẩn nội pantoprazol của mẫu LLOQ và xác định nồng độ esomeprazol có trong các mẫu từ đường chuẩn. Kết quả thẩm định cho thấy tỷ lệ đáp ứng của pic esomeprazol trong mẫu LLOQ (0,1 ng/mL) so với đáp ứng tại thời gian lưu trong mẫu huyết tương trắng là 9,0 (lớn hơn 5). 3.3.5. Độ đúng và độ chính xác Độ đúng và độ chính xác được xác định đồng thời bằng cách sử dụng tối thiểu 3 nồng độ của mẫu chuẩn kiểm tra, 1 nồng độ gần với giá trị nhỏ nhất của đường chuẩn, 1 nồng độ gần với giới hạn trên của đường chuẩn và 1 nồng độ gần điểm giữa. Tiến hành thực hiện đánh giá bằng cách thêm chuẩn vào mẫu huyết tương trắng ở 3 mức nồng độ khác nhau là 0,1 ng/mL; 5 ng/mL và 20 ng/mL (n = 6), nồng độ chuẩn nội pantoprazol là 5 ng/mL, phân tích theo quy trình đã xây dựng. Các kết quả phân tích được thể hiện ở Bảng 4. Bảng 4. Độ đúng và độ chính xác của phương pháp LC-MS/MS Nồng độ 0,1 ng/mL 5 ng/mL 20 ng/mL Độ đúng (%) 61,3 99,2 91,9 Độ chính xác (%) 4,69 2,41 3,22 Các kết quả này cho thấy phương pháp có độ chính xác đáp ứng yêu cầu theo quy định của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học (RSD% không vượt quá 15%) [9, 11]. Độ đúng thể hiện qua độ thu hồi tại 0,1 ng/mL vượt quá giới hạn theo quy định của ICH (80 - 120%), nhưng đáp ứng yêu cầu theo quy định của AOAC (độ thu hồi 60 - 115% ) [10]. Hàm lượng khảo sát thấp (0,1 ng/mL) có thể gây ảnh hưởng đến kết quả xác định độ thu hồi; đây là một điểm hạn chế của phương pháp và cần được khắc phục trong các nghiên cứu tiếp theo. Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021 17
  20. Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng esomeprazol... 3.3.6. Độ ổn định Khảo sát 02 lô mẫu tại LQC (mẫu kiểm tra nồng độ thấp 0,1 ng/mL) và HQC (mẫu kiểm tra nồng độ cao 20 ng/mL) cho các phép thẩm định trong thời gian dài, sau 3 chu kì đông – rã đông, sau xử lí - bảo quản trong lọ mẫu đặt trong bộ tiêm mẫu tự động 24 giờ. Tiến hành phân tích theo quy trình đã xây dựng, kết quả độ ổn định của mẫu huyết tương (n = 3) được thể hiện trong Hình 5 và Hình 6. Hình 5. Kết quả độ ổn định dài hạn và 3 chu kì đông - rã đông của mẫu (rã lần 1, lần 2 và lần 3 tương ứng với thời gian 1 tuần, 1 tháng và 3 tháng) Hình 6. Kết quả độ ổn định của mẫu sau chiết – bảo quản trong bộ tiêm mẫu tự động Các giá trị RSD và độ lệch so với thời điểm ban đầu đều nhỏ hơn 15% cho thấy phương pháp đảm bảo được yêu cầu về độ ổn định của dược chất trong huyết tương động vật thí nghiệm [9 - 11]. Tại nồng độ LQC, mức độ dao động về hàm lượng khá lớn, cho thấy sai số của phương pháp tại mức nồng độ này có dao động lớn; tuy nhiên sai số này vẫn nằm trong giới hạn cho phép (± 15%). 3.3.7. Ứng dụng phương pháp phân tích esomeprazol trong huyết tương thỏ Áp dụng quy trình xử lý mẫu và phân tích bằng LC-MS/MS đã được khảo sát và thẩm định để phân tích định lượng esomeprazol trong huyết tương đối với chế phẩm chứa esomeprazol. Nhóm nghiên cứu đã áp dụng phương pháp trên để phân tích các mẫu huyết tương thu được 18 Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm - Tập 4, Số 1, 2021
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.15: Bộ Đồ Án Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Cơ Khí
65 tài liệu
2431 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
4=>1