THỬ VÔ KHUẨN
Qui định chung
Kỹ thuật này áp dụng để thử vô khuẩn nhằm phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, nấm
mốc và nấm men trong các nguyên liệu, chế phẩm và dụng cụ mà theo tiêu chuẩn riêng
cần phải vô khuẩn. Thử vô khuẩn phải được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn như
trong buồng thổi khí vô khuẩn hoặc trong buồng sạch để mẫu thử không bị ô nhiễm.
Trong quá trình thử, mẫu không được tiếp xúc với các tác nhân có ảnh hưởng đến vi
khuẩn, nấm mốc, nấm men (như: tia tử ngoại, chất sát khuẩn, nhiệt độ cao ...). Các
dụng cụ, dung môi, môi trường nuôi cấy phải được diệt khuẩn trước khi dùng.
Phương pháp thử
Nguyên tắc
Nếu vi khuẩn, nấm mốc, nấm men được cấy vào môi trường có chất dinh dưỡng và
nước, được giữ ở điều kiện nhiệt độ thích hợp thì chúng sẽ phát triển. Sự có mặt của vi
sinh vật làm cho môi trường biến đổi trạng thái từ trong sang đục, hoặc có cặn lắng ở
đáy môi trường, hoặc thay đổi màu sắc môi trường.
Chọn một trong hai phương pháp thử thường dùng là phương pháp màng lọc hoặc
phương pháp cấy trực tiếp. Khi tiến hành thử phải làm sạch bề ngoài của ống (hoặc
chai, lọ, bình ...) đựng chế phẩm bằng một chất sát khuẩn thích hợp. Sau đó lấy một
lượng chế phẩm đủ dùng theo qui định, cấy trực tiếp vào môi trường (nếu theo phương
pháp cấy trực tiếp) hoặc theo phương pháp màng lọc: Đem chế phẩm sau khi đã được
hoà loãng với dung môi thích hợp lọc qua màng lọc, rồi cắt các màng lọc thành miếng
nhỏ đem nhúng vào môi trường, ủ môi trường đã cấy chế phẩm hoặc cấy màng lọc
trong thời gian qui định.
Chuẩn bị môi trường và dung môi
Môi trường để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí
Môi trường thioglycolat có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và
trong).
Môi trường thioglycolat không có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đặc
hoặc đặc sền sệt dạng cao).
Môi trường Soybean - casein (để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm mốc)
Cả hai loại môi trường trên phải được pha chế và kiểm tra chất lượng theo đúng qui định ở
mục "Cách pha chế và kiểm tra chất lượng các môi trường" trước khi dùng.
Dung môi dùng để hoà loãng
Khi những mẫu thử không ở dạng dung dịch lỏng, cần hoà loãng để thử nghiệm. Chỉ
được dùng làm dung môi hoà loãng là một chất lỏng bất kỳ không có tính kháng khuẩn
và không tác động đến độ xốp của màng lọc. Thường dùng các dung môi sau đây:
Dung môi A: Hoà tan 1 g pepton vào nước cho vừa đủ 1 lít. Lọc (hoặc ly tâm) cho
trong. Điều chỉnh pH bằng 7,1 0,2. Đựng vào nhiều bình, mỗi bình khoảng 100 ml.
Hấp ở 1210 C trong 18 - 20 phút.
Dung môi B: Như dung môi A, nhưng thêm 1 ml polysorbat 80 cho 1 lít dung môi,
dùng để hoà loãng những chế phẩm thử có lecithin.
Dung môi C: isopropyl myristat
Dùng để pha loãng những chế phẩm dạng dầu hay dung dịch dầu.
Tiến hành thử theo phương pháp màng lọc
Dụng cụ
Các dụng cụ dùng trong thử nghiệm phải đảm bảo vô khuẩn gồm:
- Các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trường.
- Bộ lọc gồm có: Phễu lọc, giá đỡ màng lọc, bình hứng, và các phụ kiện để ghép nối;
hệ thống hút chân không.
- Màng lọc: Thường dùng loại có dường kính lỗ lọc khoảng 0,2 - 0,45 m. Loại màng
Cellulose nitrat được dùng cho các chế phẩm dạng nước, dạng dầu và các dung dịch có
lượng cồn thấp độ. Loại màng lọc dạng cellulose acetat được dùng cho các chế phẩm
dạng có nồng độ cồn cao. Đặc biết đối với các chế phẩm kháng sinh cần phải chọn loại
màng lọc thích hợp đảm bảo không còn dư lượng kháng sinh trên màng sau khi lọc.
- Kéo cắt màng lọc.
Lượng mẫu thử cần dùng cho một lần thử nghiệm
Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy số lượng thích hợp theo qui định ở bảng 1.
Bảng 1.
STT Loại mẫu thử Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy
1
Dung dịch thuốc tiêm có chứa
trong
một đơn vị đóng gói:
Toàn bộ một đơn vị đóng gói
2
3
- Dưới 1 ml
- Có từ 1 đến ít hơn 4 ml
- Có từ 4 đến ít hơn 20 ml
- Có từ 20 đến 100 ml
- Lớn hơn 100 ml
Dung dịch thuốc nhỏ mắt và các
chế phẩm lỏng không tiêm
Những mẫu thử là chất rắn, dịch
treo, nhũ dịch, kem, hoặc thuốc
mỡ.
1/2 đơn vị đóng gói
2 ml
2 - 10 ml
1/2 đơn vị đóng gói
5 - 10 ml của dung dịch đã hoà
loãng đến 10 lần (tt/tt) bằng dung
môi thích hợp nêu ở (mục c)
0,5 - 1 g mẫu thử đã được hoà loãng
thành dung dịch với tỉ lệ 1% (kl/tt)
bằng dung môi thích hợp (nêu ở
mục dung môi dùng để hoà loãng)
Kỹ thuật thử
Dùng dung môi A vừa đủ để thấm ướt màng lọc. Rót lên màng lọc một lượng mẫu cần thử
như qui định ở bảng 1. Dùng máy hút chân không để rút ngắn thời gian lọc. Rửa màng lọc
ít nhất 3 lần, mỗi lần dùng 100 ml dung môi thích hợp, vô khuẩn. Lấy màng lọc ra khỏi giá