THỬ VÔ KHUẨN

Chia sẻ: Nguyen Uyen | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:17

Thêm vào BST

Báo xấu

708
lượt xem 33
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Qui định chung Kỹ thuật này áp dụng để thử vô khuẩn nhằm phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, nấm mốc và nấm men trong các nguyên liệu, chế phẩm và dụng cụ mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô khuẩn. Thử vô khuẩn phải được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn như trong buồng thổi khí vô khuẩn hoặc trong buồng sạch để mẫu thử không bị ô nhiễm. Trong quá trình thử, mẫu không được tiếp xúc với các tác nhân có ảnh hưởng đến vi khuẩn, nấm mốc, nấm men (như: tia...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: THỬ VÔ KHUẨN

THỬ VÔ KHUẨN Qui định chung Kỹ thuật này áp dụng để thử vô khuẩn nhằm phát hiện sự có mặt của vi khuẩn, nấm mốc và nấm men trong các nguyên liệu, chế phẩm và dụng cụ mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô khuẩn. Thử vô khuẩn phải được tiến hành trong điều kiện vô khuẩn như trong buồng thổi khí vô khuẩn hoặc trong buồng sạch để mẫu thử không bị ô nhiễm. Trong quá trình thử, mẫu không được tiếp xúc với các tác nhân có ảnh h ưởng đến vi khuẩn, nấm mốc, nấm men (nh ư: tia tử ngoại, chất sát khuẩn, nhiệt độ cao ...). Các dụng cụ, dung môi, môi trường nuôi cấy phải được diệt khuẩn trước khi dùng. Phương pháp thử Nguyên tắc Nếu vi khuẩn, nấm mốc, nấm men được cấy vào môi trường có chất dinh dưỡng và nước, được giữ ở điều kiện nhiệt độ thích hợp thì chúng sẽ phát triển. Sự có mặt của vi
sinh vật làm cho môi trường biến đổi trạng thái từ trong sang đục, hoặc có cặn lắng ở đáy môi trường, hoặc thay đổi màu sắc môi trường. Chọn một trong hai phương pháp thử thường dùng là phương pháp màng lọc hoặc phương pháp cấy trực tiếp. Khi tiến hành thử phải làm sạch bề ngoài của ống (hoặc chai, lọ, bình ...) đựng chế phẩm bằng một chất sát khuẩn thích hợp. Sau đó lấy một lượng chế phẩm đủ dùng theo qui định, cấy trực tiếp vào môi trường (nếu theo phương pháp cấy trực tiếp) hoặc theo phương pháp màng lọc: Đem chế phẩm sau khi đã được hoà loãng với dung môi thích hợp lọc qua màng lọc, rồi cắt các màng lọc thành miếng nhỏ đem nhúng vào môi trường, ủ môi trường đã cấy chế phẩm hoặc cấy màng lọc trong thời gian qui định. Chuẩn bị môi trường và dung môi Môi trường để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí Môi trường thioglycolat có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và trong). Môi trường thioglycolat không có thạch (dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đặc hoặc đặc sền sệt dạng cao). Môi trường Soybean - casein (để phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm mốc)
Cả hai loại môi trường trên phải được pha chế và kiểm tra chất lượng theo đúng qui định ở mục "Cách pha chế và kiểm tra chất lượng các môi trường" trước khi dùng. Dung môi dùng để hoà loãng Khi những mẫu thử không ở dạng dung dịch lỏng, cần hoà loãng để thử nghiệm. Chỉ được dùng làm dung môi hoà loãng là một chất lỏng bất kỳ không có tính kháng khuẩn và không tác động đến độ xốp của màng lọc. Thường dùng các dung môi sau đây: Dung môi A: Hoà tan 1 g pepton vào nước cho vừa đủ 1 lít. Lọc (hoặc ly tâm) cho trong. Điều chỉnh pH bằng 7,1  0,2. Đựng vào nhiều bình, mỗi bình khoảng 100 ml. Hấp ở 1210 C trong 18 - 20 phút. Dung môi B: Như dung môi A, nhưng thêm 1 ml polysorbat 80 cho 1 lít dung môi, dùng để hoà loãng những chế phẩm thử có lecithin. Dung môi C: isopropyl myristat Dùng để pha loãng những chế phẩm dạng dầu hay dung dịch dầu. Tiến hành thử theo phương pháp màng lọc Dụng cụ Các dụng cụ dùng trong thử nghiệm phải đảm bảo vô khuẩn gồm: - Các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trường.
- Bộ lọc gồm có: Phễu lọc, giá đỡ màng lọc, bình hứng, và các phụ kiện để ghép nối; hệ thống hút chân không. - Màng lọc: Thường dùng loại có dường kính lỗ lọc khoảng 0,2 - 0,45 m. Loại màng Cellulose nitrat được dùng cho các chế phẩm dạng nước, dạng dầu và các dung dịch có lượng cồn thấp độ. Loại màng lọc dạng cellulose acetat đ ược dùng cho các chế phẩm dạng có nồng độ cồn cao. Đặc biết đối với các chế phẩm kháng sinh cần phải chọn loại màng lọc thích hợp đảm bảo không còn dư lượng kháng sinh trên màng sau khi lọc. - Kéo cắt màng lọc. Lượng mẫu thử cần dùng cho một lần thử nghiệm Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy số lượng thích hợp theo qui định ở bảng 1. Bảng 1. Loại mẫu thử Lượng tối thiểu chế phẩm cần lấy STT Dung dịch thuốc tiêm có chứa 1 trong Toàn bộ một đơn vị đóng gói một đơn vị đóng gói:
- Dưới 1 ml 1/2 đơn vị đóng gói - Có từ 1 đến ít hơn 4 ml 2 ml - Có từ 4 đến ít hơn 20 ml 2 2 - 10 ml - Có từ 20 đến 100 ml 1/2 đơn vị đóng gói - Lớn hơn 100 ml 5 - 10 ml của dung dịch đã hoà 3 loãng đến 10 lần (tt/tt) bằng dung Dung dịch thuốc nhỏ mắt và các môi thích hợp nêu ở (mục c) chế phẩm lỏng không tiêm 0,5 - 1 g mẫu thử đã được hoà loãng thành dung dịch với tỉ lệ 1% (kl/tt) Những mẫu thử là chất rắn, dịch bằng dung môi thích hợp (nêu ở treo, nhũ dịch, kem, hoặc thuốc mục dung môi dùng để hoà loãng) mỡ. Kỹ thuật thử Dùng dung môi A vừa đủ để thấm ướt màng lọc. Rót lên màng lọc một lượng mẫu cần thử như qui định ở bảng 1. Dùng máy hút chân không để rút ngắn thời gian lọc. Rửa màng lọc ít nhất 3 lần, mỗi lần dùng 100 ml dung môi thích hợp, vô khuẩn. Lấy màng lọc ra khỏi giá
đỡ trong phễu lọc. Cấy màng lọc vào môi trường bằng nhúng chìm vào loại môi trường để phát hiện nấm hoặc vi khuẩn (mục chuẩn bị môi trường và dung môi ). Khi mẫu thử có tính kháng khuẩn, rửa màng lọc ít nhất ba lần bằng cách lọc qua màng dung môi tiệt trùng đã chọn dùng cho thử nghiệm.Làm thí nghiệm kiểm tra để biết chắc chắn không còn tác dụng kháng khuẩn của mẫu thử hấp thụ trên màng. Chuyển toàn bộ màng lọc vào môi trường nuôi cấy thích hợp để phát hiện vi khuẩn, nấm mốc. Nếu không có chỉ dẫn trong chuyên luận riêng, ủ môi trường thyoglycolat ở 300C đến 350C và ủ môi trường soybean - casein ở 200C đến 250C ít nhất 14 ngày. Nếu mẫu thử là dụng cụ (bộ dây truyền, túi lọc máu...) thì dùng 100 ml dung môi B cho chảy qua dụng cụ. Hứng lấy dung môi, rót lên màng lọc đã được thấm ướt bằng dung môi A, rồi làm tiếp theo kỹ thuật ghi ở mục kỹ thuật thử. Tiến hành thử theo phương pháp cấy trực tiếp Dụng cụ: Các dụng cụ dùng cho thử nghiệm đều phải đảm bảo vô khuẩn mới được sử dụng vào thử nghiệm. Dụng cụ dùng cho phương pháp cấy trực tiếp gồm: Bơm tiêm, pipet, các ống nghiệm hoặc các bình đựng môi trường. Lượng chế phẩm cần dùng để thử nghiệm Tuỳ theo từng loại mẫu thử, lấy lượng chế phẩm thích hợp theo qui định ở bảng 2.
Kỹ thuật thử Dùng bơm tiêm hoặc pipet lấy mẫu thử cấy vào hai loại môi trường theo số liệu ở bảng 2. Nếu mẫu thử là chất rắn thì cấy trực tiếp vào môi trường và chú ý lắc để mẫu thử phân tán đều trong môi trường. Nếu không có chỉ dẫn ở chuyên luận riêng thì ủ môi trường phát hiện vi khuẩn ở 300C - 350C ; ủ môi trường phát hiện nấm mốc ở 200C - 250C, thời gian ít nhất 14 ngày; thường xuyên theo dõi các môi trường đã cấy. Nếu chế phẩm làm đục môi trường, để có thể dễ dàng quan sát sự mọc của vi khuẩn, sau khi ủ môi trường 3 - 7 ngày nên chuyển một phần nhỏ môi trường này sang một loạt môi trường mới cùng loại. Tiếp tục ủ các ống môi trường đã cấy lại ít nhất 7 ngày. Trường hợp mẫu thử là băng, gạc, chỉ khâu phẫu thuật: Nếu kích thước và hình dạng cho phép, nhúng toàn bộ mẫu thử vào 100 ml môi trường tương ứng. Khi mẫu thử là dụng cụ (dây truyền, ống lọc máu, ...) thì dùng dung môi A ho ặc B (mục chuẩn bị môi trường và dung môi) cho chảy qua để thu được ít nhất 15 ml dịch rửa, cấy vào ít nhất 100 ml mỗi loại môi trường nuôi cấy. Ủ và đọc kết quả như đã ghi ở trên. Bảng 2 Lượng tối thiểu Thể tích tối ST thiểu môi T Loại mẫu thử chế phẩm cần lấy Ghi chú trường cần lấy
Mẫu thử là chất lỏng Nếu mẫu thử là 1 chứa trong một đơn vị dầu hay dung đóng gói loại: dịch dầu phải Toàn bộ đơn vị 15 ml thêm vào môi Dưới 1 ml đóng gói trường 1% 15 ml Từ 1 ml đến ít hơn 5 polyethoxy- 1/2 đơn vị đóng 20 ml ml ethanol hoặc 1% gói polysorbat để 40 ml Từ 5 ml đến ít hơn 20 2 ml nhũ hoá. ml 80 ml 5 ml Từ 20 ml đến ít hơn 10 ml 50 ml Từ 50 ml đến 100 ml Mẫu thử là chất rắn, Nếu mẫu thử là 2 thuốc mỡ hay kem, thuốc mỡ hay Toàn bộ 1 đơn vị 40 ml chứa trong một đơn vị kem thì cần hoà đóng gói 80 ml đóng gói loại: loãng với dung 1/2 khối lượng của môi B theo tỷ lệ
Dưới 50 mg 1 đơn vị đóng gói 1/10 (kt/tt) trước 80 ml khi cấy vào môi Từ 50 mg đến 200 100 mg trường. mg Lớn hơn 200 mg Theo dõi và đánh giá kết quả Trong suốt thời gian ủ, hàng ngày phải quan sát các môi tr ường đã cấy màng lọc hoặc mẫu thử . Nếu không thấy có vi khuẩn, nấm mốc mọc trong suốt thời gian qui định, mẫu thử được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn. Nếu có từ 1 trở lên trong số các môi trường nuôi cấy, có vi khuẩn hoặc nấm mốc mọc, cần phải: Rà soát lại qui trình thử. Thử lại các mẫu thử nghi ngờ. Giữ lại các môi trường có vi khuẩn, nấm mốc mọc. Tiến hành phân lập, so sánh vi khuẩn hoặc nấm trên môi trường, cấy lại với vi khuẩn hoặc nấm đã mọc ở môi trường cũ.
Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) giống với tiêu bản làm lần đầu, mẫu thử được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn. Nếu trên tiêu bản phân lập, vi khuẩn (hoặc nấm mốc) khác biệt so với lần thí nghiệm đầu tiên, cần thực hiện phép thử lặp lại với số l ượng mẫu gấp đôi. Nếu không phát hiện thấy vi khuẩn (hoặc nấm mốc), mẫu thử được coi là đạt tiêu chuẩn vô khuẩn. Nếu vẫn thấy vi khuẩn (hoặc nấm) mọc ở lần lặp lại này, mẫu thử được coi là không đạt tiêu chuẩn vô khuẩn. Cách pha chế và kiểm tra chất lượng các môi trường Môi trường để phát hiện các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí Môi trường thioglycolat: Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm lỏng và trong L - Cystin 0,50 g Natri clorid 2,50 g Dextrose (C6H12O6.H2O) 5,50 g Thạch bột (có độ ẩm nhỏ hơn 15%) 0,75 g Cao men bia (có khả năng tan trong
nước) 5,00 g Casein pancreatic 15,00 g Natri thioglycolat 0,50 g (hoặc acid thioglycolic 0,3 g 1,0 ml ) 1000 ml Resazurin (dung dịch 0,1% mới pha) Nước cất pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1  0,2 Trộn tất cả các thành phần theo thứ tự đã ghi ở trên (trừ resazurin và thioglycolat) trong cối nghiền, thêm vào một ít nước nóng, trộn kỹ, chuyển sang dụng cụ thích hợp. Thêm số nước còn lại, đun hỗn hợp cách thuỷ sôi đến khi tạo thành dung dịch trong. Thêm natri thioglycolat, dùng dung dịch natri hydroxyd 1 N điều chỉnh sao cho môi trường sau khi tiệt khuẩn có pH7,1  0,2. Đun nóng lại dung dịch (tránh đun sôi). Lọc (nếu cần) qua giấy lọc đã thấm ướt, rồi thêm dung dịch resazurin trộn đều. Đóng vào các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp, hấp vô khuẩn ở 1210C trong 18 - 20 phút. Lấy ra làm nguội nhanh tới 250C, tiếp tục bảo quản ở nhiệt độ 20 - 300C, tránh ánh sáng. Nếu 1/3 thể tích phía trên của ống (hoặc bình) môi trường có màu hồng, môi trường không thích hợp để thử nghiệm. Có thể phục hồi lại môi tr ường bằng cách đun cách
thuỷ cho mất màu rồi làm lạnh đột ngột. Nhưng chỉ sử dụng môi trường đã phục hồi này một lần, không dùng môi trường phục hồi lần 2. Các môi trường thioglycolat lỏng chỉ dùng trong khoảng 3 tuần. Môi trường thioglycolat không có thạch Dùng cho thử nghiệm những chế phẩm đục hoặc đặc sền sệt dạng cao. L. Cystin 0,50 g Natri clorid 2,50 g Dextrose (C6H12O6.H2O) 5,50 g Cao men bia (có khả năng tan trong 5,00 g nước) 15,0 g Casein pancreatic 0,50 g Natri thioglycolat 10 ml (hoặc acid thioglycolic 0,3 g ) 1000 Resazurin (dung dịch 1% mới pha) ml Nước cất
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,1 0,2 Cho tất cả các thành phần trên vào một dụng cụ thích hợp, đun cách thuỷ, khuấy đều đến khi thành dung dịch, dùng dung dịch natri hydroxyd 1N điều chỉnh để cho pH sau khi tiệt khuẩn đạt 7,1  0,2. Có thể lọc (nếu cần). Phân chia vào các ống nghiệm (hoặc bình) thích hợp. Hấp tiệt khuẩn 1210C trong khoảng 18 - 20 phút. Sau khi tiệt khuẩn đem làm nguội nhanh tới 250C, môi trường không được đun nóng trở lại. Môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí và nấm Môi trường Soybean - casein Casein pancreatic 17,0 g Bột papaic soybean 3,0 g Natri clorid 5,0 g Dikali hydrophosphat 2,5 g (K2HPO4) 2,5 g Dextrose (C6H12O6.H2O) 1000 ml Nước cất
pH sau khi tiệt khuẩn: 7,3  0,2 Hoà tan tất cả các chất rắn trong nước, đun nóng nhẹ để cho tan hoàn toàn. Để nguội ở nhiệt độ phòng. Dùng dung dịch natri hydroxyd 0,1N để điều chỉnh (nếu cần) cho pH sau khi tiệt khuẩn khoảng 7,1 đến 7,5. Lọc (nếu cần) để cho môi tr ường trong. Phân chia vào những dụng cụ thích hợp, hấp tiệt khuẩn ở 1210C trong khoảng 20 phút. Kiểm tra chất lượng môi trường a) Độ vô khuẩn: Lấy ngẫu nhiên một vài ống (hoặc bình) môi trường mới sản xuất, đem ủ ở nhiệt độ 30 - 350C trong 4 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí; ủ ở nhiệt độ 20 - 250C trong ít nhất 7 ngày đối với những loại môi trường dùng nuôi cấy vi khuẩn, nấm mốc. Các loại môi tr ường phải không được có vi khuẩn, nấm mốc mọc. b) Khả năng dinh dưỡng: Cấy vào môi trường dùng để thí nghiệm khoảng 100 tế bào sống của những loại vi khuẩn sau: Loại hiếu khí dùng Staphylococcus aureus ATCC 6538. Loại vi khuẩn hiếu khí có nha bào dùng Bacillus subtilis ATCC 6633.
Loại vi khuẩn kỵ khí dùng Clostridium sporogenes ATCC 9404. Loại nấm dùng Candida albicans ATCC 10231. Aspergillus niger ATCC 16404 Mỗi loại chủng chỉ thị được cấy vào loại môi trường tương ứng, rồi mang ủ ở nhiệt độ thích hợp cho từng loại ít nhất 3 ngày đối với vi khuẩn và ít nhất 5 ngày đối với nấm mốc. Trên mỗi loại môi trường, sau thời gian ủ đều phải thấy vi khuẩn mọc tốt. c) Kiểm tra tác dụng ức chế ở mẫu mang thử: Một số chế phẩm do yêu cầu của sản xuất hoặc ở những chế phẩm mới người ta đã cho thêm chất bảo quản. Loại chế phẩm này có ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn, nấm mốc, nên cần phải kiểm tra tác dụng ức chế của chúng đối với vi khuẩn nấm mốc. Đối với vi khuẩn kỵ khí Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn kỵ khí. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy vào mỗi ống chứng này 100 nha bào vi khuẩn kỵ khí Clostridium sporogenes ATCC 9404 (khoảng 0,1 ml nhũ dịch nha bào đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn lại cấy vào mỗi ống một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, rồi cũng cấy vào mỗi ống 100 nha bào Clostridium sporogenes ATCC 9404. Đem ủ tất cả các ống ở 30 - 350C ít nhất 7 ngày. Đối với vi khuẩn hiếu khí
Dùng 4 ống môi trường phát hiện vi khuẩn hiếu khí. Hai ống dùng làm chứng chỉ cấy vào mỗi ống chứng này 100 tế bào vi khuẩn hiếu khí Staphylococcus aureus ATCC 6538 (khoảng 0,1 ml nhũ dịch tế bào đã pha loãng thích hợp). Hai ống còn lại cấy vào mỗi ống một lượng bằng nhau chế phẩm cần kiểm tra, và cũng cấy vào mỗi ống 100 tế bào Staphylococcus aureus ATCC 6538. Đem ủ tất cả các ống ở 30 - 350C ít nhất 7 ngày. Đối với nấm mốc Dùng 4 ống môi trường phát hiện nấm, mốc. Hai ống d ùng làm chứng chỉ cấy vào mỗi ống chứng này 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231. Hai ống dùng kiểm tra, cấy vào mỗi ống 100 tế bào nấm Candida albicans ATCC 10231 và một lượng chế phẩm bằng nhau. Đem ủ tất cả các ống ở 20 - 250C ít nhất 7 ngày. Đánh giá kết quả: Nếu trong thời gian ủ, vi khuẩn, nấm mốc mọc tốt, (dễ dàng và phong phú), đối với từng loại, mọc giống nhau giữa ống kiểm tra và ống chứng: Mẫu thử không có tác dụng ức chế. Nếu trên các ống môi trường có cấy mẫu thử, vi khuẩn, nấm, mốc mọc yếu, chậm phát triển hoặc không phát triển so với ống chứng vẫn mọc tốt: Mẫu thử có tác dụng ức chế. Phải loại bỏ tác dụng ức chế.
Tác dụng ức chế của mẫu thử có thể loại bỏ được một cách có kết quả bằng cách cấy truyền nhắc lại trên một loạt môi trường mới hoặc lọc qua màng lọc vi khuẩn.