intTypePromotion=1
zunia.vn Tuyển sinh 2024 dành cho Gen-Z zunia.vn zunia.vn
ADSENSE
 » 
 » 

TIỂU LUẬN:KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO

Chia sẻ: Bluesky_12 Bluesky_12 | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:22

Thêm vào BST
Báo xấu
150
lượt xem 26
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chăn nuôi gà là nghề sản xuất truyền thống lâu đời và chiếm vị trí quan trọng thứ hai (sau chăn nuôi lợn) trong toàn ngành chăn nuôi của Việt Nam. Hằng năm, cung cấp khoảng 350-450 ngàn tấn thịt và hơn 2,5-3,5 tỷ quả trứng. Tuy nhiên, chăn nuôi gà của nuớc ta vẫn còn trong tình trạng sản xuất nhỏ, phân tán, lạc hậu, năng suất thấp, dịch bệnh nhiều, sản phẩm hàng

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: TIỂU LUẬN:KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO

  1. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TPHCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỚP: DH06SH SEMINAR KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Hải. Nguyễn Trần Lâm Thanh. MSSV: 06126131 Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 10/2009 NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 1
  2. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ. Chăn nuôi gà là nghề sản xuất truyền thống lâu đời và chiếm vị trí quan trọng thứ hai (sau chăn nuôi lợn) trong toàn ngành chăn nuôi của Việt Nam. Hằng năm, cung cấp khoảng 350-450 ngàn tấn thịt và hơn 2,5-3,5 tỷ quả trứng. Tuy nhiên, chăn nuôi gà của nuớc ta vẫn còn trong tình trạng sản xuất nhỏ, phân tán, lạc hậu, năng suất thấp, dịch bệnh nhiều, sản phẩm hàng hoá còn nhỏ bé. Bình quân sản lượng thịt xẻ, trứng/nguời chỉ đạt 4,5 - 5,4kg/nguời/năm và 35 trứng/nguời/năm. Trong vài thập kỷ qua, mặc dù công tác chọn giống đã cải thiện một cách đáng kể thành tích sản xuất, chăn nuôi gà như: tăng trưởng nhanh hơn, hiệu quả sử dụng thức ăn cao hơn, khả năng sản xuất thịt tốt hơn, tỷ lệ thịt ngực cao hơn nhưng sự tăng nhanh về năng suất sản xuất đã không đi cùng với việc tăng khả năng miễn dịch, dẫn đến gà bị mắc nhiều bệnh về rối loạn chuyển hóa và nhiều bệnh truyền nhiễm, tỷ lệ chết tăng cao. Trong đó, có thể kể đến Infectious bursal disease virus (IBDV), một lọai virus thuộc họ Birnaviridae, serotype 1, chúng có khả năng phá huỷ túi Fabracius, do đó làm giảm khả năng miễn dịch của gà. Nhiều báo cáo khoa học đã cho biết: gà ở giai đọan từ 1-12 tuần tuổi, rõ nhất là ở giai đọan 3-6 tuần tuổi đều có khả năng mắc bệnh. Gà nhỏ hơn 3 tuần tuổi mắc bệnh không biểu hiện triệu chứng nhưng sẽ làm gà suy giảm miễn dịch. Tỷ lệ mắc bệnh là 100%, tỷ lệ chết từ 10-50% hoặc cao hơn nếu kết hợp với các bệnh khác. Do tính chất gây bệnh đặc trưng của virus là lây lan rất nhanh và không thể kiểm soát bằng hóa chất hay bất kỳ phương thuốc nào mà chỉ có thể khắc phục bằng biện pháp phòng trừ. Vì vậy thiệt hại do IBDV gây ra là rất đáng kể đối với chăn nuôi gà của các nước lớn trên thế giới nói chung và của Việt Nam nói riêng. Cùng với sự phát triền vượt bậc của công nghệ sinh học, các kỹ thuật phân tử trong chẩn đóan bệnh ngày nay có thể giúp ta chẩn đóan nhanh, sớm một cách chính xác nhiều bệnh do virus. Khởi phát từ các vấn đề nêu trên, trong giới hạn của bài seminar này em xin thực hiện nội dung “ Kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán virus Gumboro” TP HCM, Tháng 10/2009 Nguyễn Trần Lâm Thanh NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 2
  3. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Chương 2 TỔNG QUAN II.1 Giới thiệu tổng quát về bệnh Gumboro: II.1.1 Bệnh Gumboro là gì? Infectious bursal disease (IBD) là một căn bệnh rất dễ lây lan trong đàn gà con do một loại virus gây bệnh truyền nhiễm Infectious bursal disease virus(IBDV). Đặc trưng của bệnh là làm suy giảm hệ thống miễn dịch của gà và tỷ lệ tử vong thường từ 3-6 tuần tuổi. Bệnh do Cosgrove phát hiện lần đầu tiên vào năm 1962 tại Gumboro, vùng Delaware Hoa Kỳ. Đó là một trung tâm kinh tế quan trọng đối với ngành công nghiệp gia cầm trên toàn thế giới. Đến năm 1970 thì Hitchner đề nghị lấy tên chính thức cho căn bệnh này là Infectious bursal disease (IBD) hay còn gọi là bệnh Gumboro và virus gây ra bệnh là Infectious bursal disease virus (IBDV). Trong những năm gần đây, nhiều chủng rất độc của IBDV (vvIBDV) đã được phát hiện, chúng là nguyên nhân gây chết đồng loạt ở gà, bệnh đã xuất hiện ở châu Âu, châu Mỹ Latinh, Đông Nam Á, Châu Phi và Trung Đông. II.1.2 Hệ thống miễn dịch ở gia cầm: Đây là một hệ thống phức tạp, hoàn thiện cả về chức năng và cấu trúc, phân bố khắp cơ thể, bao gồm cơ quan, những yếu tố tế bào và những yếu tố dịch thể. Cũng như ở động vật có vú, năng lực miễn dịch của gia cầm phát triển thông qua hệ thống lympho. Cơ quan của hệ miễn dịch được chia thành cơ quan lympho sơ cấp và thứ cấp. + Túi Fabricius (viết tắt là túi F) và tuyến ức là cơ quan lympho sơ cấp trong đó các tiền lympho bào phát triển thành các lympho bào miễn dịch. + Những tổ chức lympho thứ cấp là lách, tủy xương, tuyến Harderian, tuyến quả thông (pineal gland) và các mô lympho gắn với bề mặt niêm mạc như niêm mạc khí quản, niêm mạc ruột và những cụm biệt hóa của những tế bào lympho thuộc các cơ quan khác nhau. Các tổ chức lympho này được đặt ở những vị trí quan trọng để khi những kháng nguyên như vi khuẩn bệnh đi vào cơ thể qua da hay qua các bề mặt niêm mạc có thể bị tóm gọn rồi bị tiêu diệt. NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 3
  4. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Sự phát triển của hệ thống miễn dịch xảy ra chủ yếu trong quá trình phát triển của phôi. Các cơ quan miễn dịch và các globulin miễn dịch thành thục trong các cơ quan miễn dịch bị chi phối bởi nhiều yếu tố, ngoài yếu tố di truyền, thức ăn cũng là một yếu tố quan trọng. II.1.3 Vai trò của túi Fabricius trong hệ thống miễn dịch gia cầm: II.1.3.1 Cấu tạo: Túi Fabricius là tổ chức lympho dạng túi, nằm liền sát lổ huyệt của gia cầm. Túi được cấu tạo từ biểu mô có nếp gấp, bao gồm khoảng 12.000 nang lympho. Trọng lượng của túi thay đổi tùy theo tuổi. Về mặt cấu tạo vi thể, mỗi nang lympho gồm 2 phần riêng biệt nhau: phần vỏ và phần tủy. + Phần vỏ: chứa một số lượng lớn lymphocytes, lymphoblaste đang trong thời kỳ gián phân, các đại thực bào, hệ thống mạch máu bao gồm các động - tĩnh mạch nhỏ, các mao mạch. + Phần tủy: chứa các lymphocyte, các đại thực bào, bạch cầu và các tế bào mầm. II.1.3.2 Sự phát triển: Sau giai đoạn phát triển phôi, khi gà nở, túi Fabricius tiếp tục phát triển cho đến tận tuần tuổi thứ 6 hay tuần tuổi thứ 12 tùy theo giống, giới tính và điều kiện chăn nuôi, sau đó túi bắt đầu thoái hóa. Quan sát vi thể sự thoái hóa của túi Fabricius từ tuần tuổi thứ 24, người ta ghi nhận được một số dấu hiệu đặc trưng như sau: + Lớp biểu mô teo lại và tróc ra. + Các nếp gấp mất dần. + Phần tủy thoái hóa và sự xuất hiện các nang. + Sự phát triển của các mô liên kết của bộ khung. + Sự xâm nhập của các heterophile, macrophage trong các vùng hoại tử. Sự tiến hóa của túi Fabricius được kiểm soát bởi các hormone của các cơ quan khác nhau với hiệu ứng kích thích hoặc kềm hãm. Bệnh tật và một số yếu tố khác từ bên ngoài cũng ảnh hưởng đến sự tiến hóa của túi. II.1.3.3 Vai trò của túi Fabricius trong sự miễn nhiễm: Từ những tế bào nguồn có bên trong túi Fabricius, trong giai đọan phát triển phôi (khoảng từ ngày thứ 8 đến 15) những tế bào này sẽ tự dị biệt dưới tác động của quá trình tiếp xúc với các tế bào lưới biểu mô và sự hiện diện của các chất chiết xuất polypeptide trong túi Fabricius, hình thành nên NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 4
  5. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO các tế bào có mang kháng thể ( IgM - ngày thứ 12, IgG - ngày thứ 14, IgA - ngày thứ 16) Những tế bào miễn dịch này sẽ di chuyển ra khỏi túi Fabricius trong suốt thời kỳ phát triển sau phôi và cuối thời gian này để đi đến các cơ quan ngoại vi ( lách, ruột….) II.1.4 Infectious bursal disease virus (IBDV). IBDV có cấu trúc mạch đôi RNA dạng cuộn tròn, thuộc loài Avibirnavirus của họ Birnaviridae. IBDV có dạng khối, nhiều góc cạnh, kích thước 55-65nm, là virus dạng trần, không có vỏ bọc ngoài. IBDV có 2 dạng serotypes khác biệt , nhưng chỉ có serotype 1 là nguyên nhân gây ra bệnh cho gia cầm. Có ít nhất là 6 lọai kháng nguyên phụ của IBDV serotype 1 đã được phát hiện trong phản ứng trung hòa trong ống nghiệm. Những virus thuộc một trong những loại kháng nguyên phụ này thường được gọi là các biến thể, chúng là nguyên nhân gây ra tỷ lệ tử vong cao ở gà khỏang 60-100%. Với sự phát triển vượt bậc của sinh học phân tử như là phản ứng phiên mã ngược chuỗi polypedtide (RT-PCR) và kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình đa hình (RFLP), nó đã trở thành một khả năng để phát hiện các vvIBDV, để phân biệt chủng IBDV, và sử dụng thông tin như vậy trong nghiên cứu các dịch tễ học phân tử của virus. Bộ gen IBDV chứa 2 mạch: mạch A và mạch B, được bao bọc trong một vỏ capsid. Lớp capsid này được hợp thành bởi 32 capsomer. Mỗi capsomer được tạo bởi 5 loại protein cấu trúc khác nhau: VP1, VP2, VP3, VP4 và VP5 (Viral Protein-VP). + Mạch B (2.9kb) mã hóa cho VP1. VP1 là protein có hoạt tính enzym RNA- polymerase. Enzym xúc tác quá trình tổng họp RNA của virus. + Mạch A lớn hơn (3.2kb) bao gồm 2 cấu trúc gen tổng hợp protein. Cấu trúc thứ nhất là một khung đọc mở đa gen ( poly-cistronic open reading frame) mã hóa cho một “tiền protein” có phân tử lượng 110 kDa mà trong quá trình kế tiếp sẽ được phân cắt thành các protein cấu trúc có tên gọi VP2, VP3, VP4. Ngoài ra, mạch A còn mã hóa cho một protein khác có tên là VP5. Đây là 1 protein có trọng lượng phân tử khá bé (17kDa) mới được phát hiện gần đây, có chức năng trong quá trình điều hòa sao chép và tổng hợp protein. Bằng các phương pháp miễn dịch học và phương pháp gây bệnh trên động vật thí nghiệm, VP2 đã được chứng minh là protein kháng nguyên bảo vệ vật chủ vì kích thích tạo kháng thể, đồng thời cũng là yếu tố độc lực của IBDV. Sự biến đổi bất kỳ một acid amin nào trong VP2 về nguyên tắc đều có thể dẫn đến sự thay đổi nhất định của tính kháng nguyên và khả năng gây NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 5
  6. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO bệnh của virus. Tuy nhiên có 1 một vùng hẹp trong cấu trúc của VP2 được gọi là ”vùng siêu biến đổi”, chịu trách nhiệm đặc biệt về tính kháng nguyên và kích thích cơ thể tạo kháng thể tham gia phản ứng trung hòa virus. Sự khác nhau ở trình tự nu của gen quy định sự tổng hợp VP2, hay cụ thể hơn là khác nhau ở vùng siêu biến đổi nên vùng này được chọn làm đích để so sánh, chẩn đoán, phân tích đặc tính kháng nguyên gây miễn dịch của các chủng IBDV. VP3 kích thích cơ thể sản sinh kháng thể kết tủa mà IBDV ở các nhóm thuộc các serotypes 1 và 2 đều kích thích sản sinh được. Vì vậy, VP3 dễ cho phản ứng kết tủa chéo, chỉ có tác dụng nhận biết IBDV đơn thuần và phân biệt sơ bộ với các virus khác. Do đó VP3 được sử dụng làm kháng nguyên kết tủa để phân biệt IBDV với các virus khác. Trong khi VP2 dùng để phân biệt các chủng và tính độc lực của các chủng IBDV. VP4 có chức năng protease cắt rời tiền protein tạo nên các protein độc lập. VP5 không chỉ có vai trò điều hòa trong sự tổng hợp ARN mà còn có vai trò trong tiến triển gây bệnh do một số thực nghiệm đã chứng minh: nếu virus thiếu thành phần hay khiếm khuyết thành phần VP5 thì có khả năng mất một phần hay hoàn toàn tính gây bệnh. IBDV có sức đề kháng hoàn toàn với Ether, Chloroforn, nhưng kém đề kháng với Formalin và Chloramin. Virus có sức chịu nhiệt tốt, có thể sống sót sau khi xử lý nhiệt ở nhiệt độ 56OC trong 5h hoặc ở nhiệt độ 37 OC hàng ngày, do vậy khử trùng nhiệt tốt nhất đối với virus là bằng cách đun sôi. Các loại hóa chất và thuốc sát trùng phải ở nồng độ cao (1% trở lên) mới có khả năng tác dụng. Chỉ có hóa chất chứa ion Clo và Iod tự do như hợp chất Chloramin, Iodine hoặc Formalin nồng độ cao (1% trở lên) mới tiêu diệt được chúng. II.1.5 Những đặc điểm của bệnh Gumboro: II.1.5.1 Nguồn bệnh: Theo Benton (1967) virus tồn tại được từ 52-122 ngày trong các ô chuồng trước đó xảy ra dịch bệnh. Trong phân, nước, chất độn chuồng, dụng cụ chăn nuôi, chất thải, chất bẩn... IBDV vẫn giữ nguyên đặc tính gây nhiễm và gây bệnh. II.1.5.2 Phương thức truyền lây: Bệnh có thể lây gián tiếp qua trứng, qua không khí, hoặc thức ăn, nước uống, dụng cụ chăn nuôi nhiễm mầm bệnh. NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 6
  7. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Bệnh lây lan trực tiếp giữa gà mang mầm bệnh và gà khỏe do tiếp xúc. II.1.5.3 Cơ chế lây bệnh của IBDV: Virus tấn công vào các tế bào lympho đặc biệt là các tế bào lympho B. Đối với những gà con khoảng 2-8 tuần tuổi có hoạt động của túi Fabricius cao thì có khả năng mắc bệnh cao hơn. Đối với gà hơn tám tuần tuổi thì có khả năng kháng lại và không có những biểu hiện lâm sàng, trừ khi bị nhiễm bởi chủng độc lực cao. Sau khi xâm nhiễm, virus này phá hủy các nang lympho của túi Fabricius cũng như các tế bào lympho B thứ cấp như GALT, CALT, BALT, tuyến Harderian,….bệnh cấp tính và dẫn đến tử vong là do hiện tượng “necrotizing”của những virus trên mô chủ. II.1.5.4 Triệu chứng: Thời gian ủ bệnh ngắn 2-3 ngày. Sau khi IBDV xâm nhập vào túi Fabracius gà sẽ có những biểu hiện: + Đàn gà uống nhiều nước, sào xạc khi có tiếng động lạ hay khi có người bước vào chuồng. + Cơ vùng hậu môn co bóp nhanh, mạnh, gà có phản xạ như muốn đi ngoài nhưng không thực hiện được, gà có biểu hiện đi giật lùi. + Sau đó gà sốt cao, uống nhiều nước dẫn đến rối loạn tiêu hoá, gà tiêu chảy mạnh, viêm hoại tử ruột. + Phân gà trắng loãng, lúc đầu có màu trắng ngà sau chuyển sang vàng trắng, trắng nhớt đôi khi lẫn máu. + Bệnh tiến triển rất nhanh chỉ sau 6-8 giờ kể từ con ốm đầu tiên, đàn gà căn bản đã thay đổi về mặt thể trạng, chúng trở nên xơ xác, xù lông, run rẩy, yếu dần rồi chết. Gà bắt đầu chết từ ngày thứ 3 sau khi phát bệnh, tỉ lệ chết tăng nhanh, sau 5 - 7 ngày thì ngưng, những con còn sống sót khỏi bệnh. Tỉ lệ chết thường thấp, nhưng nếu điều kiện chăn nuôi kém tỉ lệ chết có thể lên đến 30% hoặc cao hơn. Hình: Gà bệnh nằm ủ rũ, xù lông Hình: Gà tiêu chảy phân loãng trắng. NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 7
  8. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.1.5.5 Bệnh tích: Xác chết khô, lông xơ xác, chân khô. Túi Fabricius ở giai đầu sưng rất to, xung quanh túi có thủy thũng mạnh đặc biệt ở vùng cuống túi tiếp giáp với trực tràng, túi chuyển từ màu vàng sáng sang trắng đục, túi dễ cấu, dễ bục, các nếp múi khế sưng to không rõ nét, nhiều trường hợp túi xuất huyết ở dạng lấm tấm đinh ghim hoặc kéo dài thành vật ở niêm mạc túi. Điển hình tiếp theo là xung xuất huyết hệ cơ, nếu xung huyết khi lột da, cơ khô nhanh và có màu thẫm. Nếu xuất huyết, khi lột da và quan sát thấy có dạng vệt xuất huyết, có khi chạy dài thành từng tia xuyên suốt chiều dài sợi cơ. Ngoài ra lách sưng nhẹ, thận sưng căng nhưng bệnh tích ở thận không được coi là điển hình. Một điều cần chú ý là cá biệt có trường hợp thấy xuất huyết ở dạ dày tuyến nên dễ nhầm với bệnh gà rù. Nếu gà nhiễm bệnh đến ngày thứ 5,6,7 thì túi Fabricius nhỏ lại, đến ngày thứ 8 thì chỉ bằng 1/3 trọng lượng ban đầu. Hình: Túi Fabricius sưng to, đỏ, xuất huyết lấm tấm. Hình: Cơ đùi xuất huyết thành từng vệt. NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 8
  9. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Hình: Xuất huyết trên niêm mạc dạ dày tuyến (chổ tiếp giáp giữa mề và tiền mề). II.1.5.6 Phòng bệnh: Chủ yếu là dùng vaccin phòng bệnh Gumboro (tiêm cho gà lúc 1 tuần tuổi, cần tiêm phòng cho đàn gà bố mẹ để tạo miễn dịch thụ động cho gà con trong những ngày đầu mới nở), loại bỏ gà có triệu chứng lâm sàng ngay sau khi chủng vaccin để loại bỏ mầm bệnh. Vệ sinh chuồng trại sạch sẽ, vệ sinh thức ăn, nước uống tránh nhiễm mầm bệnh. Tiến hành ủ phân để tiêu diệt mầm bệnh. Định kỳ mỗi tuần sát trùng chuồng trại Trong quá trình nuôi cung cấp thêm các sản phẩm bổ sung chất dinh dưỡng, vitamin, chất điện giải nhằm tăng cường sức đề kháng bệnh, chống stress… II.1.5.7 Điều trị: Bệnh do virus gây ra do đó không có thuốc đặc hiệu để điều trị, khi đàn gà phát bệnh biện pháp chủ yếu để giảm tỉ lệ chết là tăng cường sức đề kháng bằng việc nuôi dưỡng, quản lý, chăm sóc, cung cấp đầy đủ chất điện giải, vitamin. Điều trị bệnh Gumboro phải theo nguyên tắc: hạ sốt + giải độc + trợ lực + chống xuất huyết + loại trừ bội nhiễm các vi khuẩn gây bệnh khác. Vì thấy gà chết chủ yếu do: + Sốt cao. + Ngộ độc urat do thận bị tổn thương. + Bội nhiễm các loại vi khuẩn khác. + Mất nước do tiêu chảy quá nặng. Hiệu quả điều trị bệnh cao hay thấp tùy thuộc vào thời điểm mà chúng ta phát hiện bệnh, nếu phát hiện sớm việc điều trị sẽ mang lại hiệu quả cao. NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 9
  10. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Mặt khác, khi đàn gà mắc bệnh, việc dùng kháng sinh để điều trị càng làm bệnh trở nên trầm trọng và tăng tỉ lệ chết. Khi gà bệnh cần cho uống đường glucose và một số loại thuốc hỗ trợ đề kháng như: Vime C Electrolyte, Vimeperos, Vimix Plus, Vimevit Electrolyte, Aminovit, Vitaral…. II.2 Enzym - Linked Immunosorbent Assay ( ELISA): ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) – xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzym, là một kỹ thuật sinh hóa hữu ích và mạnh trong việc xác định việc hiện diện cũng như định lượng ở mức ng/ml, pg/ml các chất có trong dung dịch như: huyết thanh, tinh dịch, nước tiểu, dịch huyền phù nuôi cấy. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khoa học sự sống và bệnh học nói chung. II.2.1 Nguyên lý chung của ELISA: Sử dụng 1 enzym để phát hiện sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên ( Antigen-Ag) và kháng thể (Antibody-Ab). Enzym sẽ chuyển cơ chất không màu thành sản phẩm có màu, nhờ đó ta sẽ thấy được sự liên kết giữa Ag-Ab. Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng Ag trong mẫu nghiên cứu. II.2.2 Một số ứng dụng của ELISA: Xác định nồng độ của Ab trong huyết thanh; Kiểm tra sự có mặt của Ag Phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm Xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học …. II.2.3 Các phương pháp ELISA: Có 3 phương pháp chính gồm: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA sandwich. Tất cả các kiểu này đều có thể được sử dụng trong các xét nhiệm được gọi là ELISA cạnh tranh (competition ELISA) hay ELISA kềm hãm (inhibition ELISA) NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 10
  11. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.2.3.1 ELISA trực tiếp: gồm các bước chính: 1. Kháng nguyên được pha loãng trong dung dịch đệm (thường là carbonate/bicarbonate ở pH cao 9.6 hay dung dịch PBS trung tính), rồi bổ sung dung dịch vào pha rắn. ( trong dung chị đệm không chứa các protein có thể cạnh tranh với kháng nguyên mục tiêu để gắn vào pha rắn) 2. Kháng nguyên sẽ bám thụ động vào bề mặt pha rắn trong quá trình ủ. Tuy nhiệt độ, thời gian ủ là không quan trọng, nhưng việc chuẩn hóa các điều kiện là rất cần thiết, chẳng hạn ta nên ủ ở 37oC. 3. Sau khi ủ, ta tiến hành rửa để loại bỏ các kháng nguyên không hấp thụ được vào bề mặt rắn. 4. Kháng thể có gắn enzym được bổ sung trực tiếp vào các vị trí kháng nguyên trên bề mặt rắn. Các kháng thể này được pha loãng trong dung dịch đệm chứa một số cơ chất ức chế sự hấp thu thụ động của protein, nhưng cũng cho phép sự gắn kết miễn dịch. Sau khi ủ, kháng thể sẽ gắn vào kháng nguyên của chính nó. 5. Rửa lần 2 để loại bỏ các kháng thể không bám, để còn lại trên đĩa là phức hợp kháng nguyên - kháng thể có gắn enzym. 6. Bổ sung các cơ chất phù hợp cho enzym đã gắn vào kháng thể. Điều này giúp hổ trợ cho phản ứng xúc tác tạo màu của enzym. Cuối cùng màu của dung dịch sẽ được xác định qua máy quang phổ trắc quang ( spectrophotometer), đọc tại một bước sóng phù hợp. Ưu điểm của phương pháp: đơn giản nhất. Nhược điểm của phương pháp: độ đặc hiệu bị giới hạn vì thông thường thì kháng nguyên có ít nhất là 2 epitop mà trong phương pháp này chỉ sử dụng một kháng thể gắn vào 1 epitop. Tốn công: phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng. NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 11
  12. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.2.3.2 ELISA gián tiếp: các bước đầu tiên tương tự như ELISA trực tiếp. 1. Sau khi kháng nguyên được hấp phụ trên bề mặt vật rắn và rửa bỏ những phần không hấp phụ, một kháng thể không đánh dấu được bổ sung vào. 2. Sau khi ủ, rửa bỏ các kháng thể không bám vào kháng nguyên. 3. Bổ sung một kháng thể thứ 2 có gắn enzym để kháng lại kháng thể thứ nhất. (kháng thể này cũng được pha loãng trong dung dịch đệm khóa) 4. Tiến hành ủ, và rửa bỏ các kháng thể không bám. 5. Cuối cùng bổ sung cơ chất cho enzym để tiến hành phản ứng tạo màu, đọc kết quả. Ưu điểm của phương pháp: kháng thể có gắn enzym nên có thể dùng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên do đó rất tiện lợi, kinh tế, và dễ thương mại hóa. Nhược điểm của phương pháp: độ đặc hiệu của từng kháng huyết thanh là khác nhau. Điều này dẫn đến các kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác nhau để kết quả có thể tin tưởng được. II.2.3.3 ELISA sandwich: Trong phương pháp này kháng nguyên được kẹp giữa các kháng thể vừa phát hiện ở pha rắn và hoạt động như một kháng thể gắn enzym. Kháng thể gắn vào pha rắn được gọi là “kháng thể bắt giữ” (capture antibody), kháng thể còn lại gọi là “kháng thể phát hiện” (antibody detector). Với cách sử dụng cùng lúc 2 kháng thể này để phát hiện 1 kháng nguyên đã làm tăng tính chính xác của các xét nghiệm. Các hệ thống sandwich khác nhau tùy thuộc vào nguồn kháng thể mà ta sử dụng. Có 2 cách: sandwich trực tiếp và sandwich gián tiếp. ELISA sandwich trực tiếp: 1. Kháng thể được gắn thụ động vào pha rắn. 2. Các kháng thể trên sẽ gắn vào kháng nguyên.( kháng nguyên được pha loãng trong dung dịch đệm khóa để tránh gắn không chuyên biệt vào pha rắn và trong dung dịch đệm khóa cũng không chứa bấy kỳ thành phần kháng nguyên nào có thể gắn kết vào kháng thể bắt giữ) 3. Kháng thể thứ 2 được thêm vào và chúng có gắn kết với enzym 4. Cơ chất được thêm vào để xúc tác phản ứng tạo màu cho enzym. NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 12
  13. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO 5. Kết quả được đọc bằng máy quang phổ trắc quang (spectrophotometer). ELISA sandwich gián tiếp: Tương tự như trực tiếp nhưng có điểm khác quan trọng là: kháng thể thứ 2 thêm vào không gắn với enzym do đó để phát hiện phức hợp kháng nguyên - kháng thể ta phải sử dụng một kháng thể khác kháng lại kháng thể thứ 2 có gắn enzym được thêm vào sau đó. Việc tiến hành ELISA sandwich gián tiếp sẽ có nhiều ưu điểm hơn, vừa mang ưu điểm của ELISA sandwich, vừa mang ưu điểm của ELISA gián tiếp. II.2.3.4 ELISA cạnh tranh-ức chế: Sự hiện diện của kháng nguyên (hay kháng thể) có thể được phát hiện và định lượng trong mẫu chưa biết bằng cách xác định khả năng cạnh tranh của kháng nguyên (hay kháng thể) không đánh dấu và kháng nguyên (hay kháng thể) có đánh dấu để gắn vào kháng thể (hay kháng nguyên) được gắn vào giếng trước đó. Đầu tiên một đường chuẩn được thiết lập để xác định lượng kháng nguyên (hay kháng thể) trong các mẫu chưa biết bằng cách so sánh với đường chuẩn được thiết lập sẵn trong hệ thống. Đường chuẩn cho thấy khả năng cạnh tranh gắn của kháng nguyên (hay kháng thể) đánh dấu và không đánh dấu vào các kháng thể (hay kháng nguyên) đã được cố định trên giếng khi bổ sung một lượng kháng nguyên (hay kháng thể) có đánh dấu với các lượng khác nhau đã biết trước nồng độ của kháng nguyên (hay kháng thể) không đánh dấu. Nếu nồng độ kháng nguyên (hay kháng thể) không đánh dấu càng thấp thì phần lớn các vị trí kháng thể (hay kháng nguyên) trên giếng sẽ bị kháng thể đánh dấu gắn vào, và ngược lại. Dựa vào mối quan hệ này ta thiết lập đường cong biểu diễn mối quan hệ tín hiệu hay % gắn của kháng nguyên (hay kháng thể) đánh dấu với nồng độ kháng nguyên (hay kháng thê) không đánh dấu. II.3 Kỹ thuật ELISA trong chẩn đoán virus Gumboro: ELISA là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc kháng thể ở nồng độ rất thấp (0,1ng / ml). So với các kỹ thuật miễn dịch khác thì kỹ thuật này vừa rẻ tiền lại an toàn mà vẫn đảm bảo độ chính xác cao. ELISA được dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh như virus, vi khuẩn, nấm…. NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 13
  14. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Trong giới hạn seminar này chỉ giới thiệu kỹ thuật Indirect ELISA qua 2 phần nhỏ: 1. Một bài nghiên cứu “ Dùng ELISA phát hiện IBDV ở những tỷ lệ pha loãng khác nhau của huyết thanh” của Department of Animal Biotechnology, Madras Veterinary College, Tamil Nadu Veterinary and Animal Sciences University, Tamil Nadu, India. 2. Sử dụng một bộ kit thương mại trên thị trường (FLOCKSCREEN™ Infectious Bursal Disease Antibody ELISA kit ) để phát hiện kháng thể kháng lại IBDV. Bộ kit này của công ty Guildhay Ltd, England. II.3.1 ELISA phát hiện IBDV ở những tỷ lệ pha loãng khác nhau của huyết thanh. II.3.1.1. Nuôi cấy virus: IBDV được phân lập từ Tamil Nadu - một vùng đất của Ấn Độ được sử dụng trong nghiên cứu này. Chúng được nhân lên trong tế bào Vero, và sau đó được tách qua ly tâm theo gradian nồng độ sucrose tinh khiết 30% hay 60%. Các IBDV tinh khiết này được sử dụng như các kháng nguyên được ủ trong các đĩa ELISA. II.3.1.2. Sự tinh chế kháng nguyên: Các kháng nguyên của IBDV được tinh chế bằng cách sử dụng phương pháp của SNYDER và các cộng sự. Những tế bào Vero bị nhiễm trong nuôi cấy lơ lửng (culture supernatant), chúng sẽ được lọc ra qua ly tâm lạnh 10.000 vòng/phút trong 20phút ở 4oC ( Sigma, Germany), và cũng để loại bỏ các mãnh vỡ tế bào. Những chất nổi lơ lững cũng sẽ được loại bỏ qua ly tâm 35.000 vòng/phút trong 3h30 phút ở 4oC (Beckman Ti 70 rotor, USA). Các pellet virus sẽ được tái huyền phù (resuspended) trong một phần mười dung dịch đệm gốc TNE (0,01 mol / L Tris HCl, 0,1 mol / L mol NaCl và 0,00 1 / L EDTA, pH 8,3). Dung dịch huyền phù này được ly tâm lại một lần nữa với 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 oC để loại bỏ các mãnh vỡ tế bào. Dung dịch huyền phù được thu thập và được chạy gián đoạn trên gradiant sucrose 30% và 60%. Sau đó được ly ở 35.000 vòng / phút trong 3h30 ở 4 oC (Beckman Ti 60 rotor). Sau khi ly tâm, chúng sẽ tách ra thành 2 lớp: sucrose 30% và 60%, sau đó được thu nhận và pha loãng với dung dịch đệm TNE theo tỷ lệ 1:5, và được lưu giữ tại -70 oC và nồng độ protein được định lượng là 7mg/ml NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 14
  15. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.3.1.3. Tiến hành thí nghiệm: + Kháng nguyên được pha loãng theo tỷ lệ 1:75 với dung dịch đệm cacbonat và bicarbonate pH=9,6 và 100 µL dịch virus pha loãng được bổ sung cho mỗi giếng. + Đĩa được ủ qua đêm ở 4 oC để kháng nguyên bám vào bề mặt đĩa. Các giếng sẽ được rửa 3 lần với dung dịch PBST. + Kháng nguyên bám vào các giếng sẽ được cố định bằng cách sử dụng dung dịch BSA 2%. + 100µL dung dịch đệm khóa (blocking solution) PBST-BSA được bổ sung vào mỗi giếng, ủ ở 37oC trong vòng 1 giờ và sau đó các giếng được rửa lại ba lần với dung dịch PBST. + Mẫu huyết thanh được pha loãng theo tỷ lệ 1:100 với dung dịch PBS và tiếp tục pha loãng hai lần để đạt được các tỷ lệ pha lõang liên tiếp, cho đến khi đạt tỷ lệ 1:12800 thì dừng. Từ các dung dịch huyết thanh pha loãng trên, hút 100µL cho vào các giếng để chúng bắt cặp đặc hiệu với kháng nguyên đã có sẵn trong giếng. + Đĩa được ủ ở 37 oC trong 1h, và rửa lại ba lần với dung dịch PBST. + Bổ sung 100µL dung dịch pha loãng theo tỷ lệ 1:3000 kháng thể thỏ kháng kháng thể gà IgG HRP pha trong dung dịch PBS. + Ủ trong 1h ở 30 oC, các giếng sẽ được rửa 3 lần với dung dịch PBST. + Thêm 100µL cơ chất tạo màu ( dung dịch ABTS với H2O2) + Ủ ở 37 oC trong 5 phút. + Phản ứng này được ngừng lại bằng cách thêm vào 50µL dung dịch SDS 5% và cuối cùng đọc kết quả ở bước sóng 405nm. Để giảm sự sai khác giữa các đĩa, một đường chuẩn của huyết thanh được thiết lập bằng cách sử dụng tỷ lệ mẫu trên các mẫu dương tính (S/P ratio) và chúng được tính như sau. Sample OD - Negative OD S/P ratio = ( ) Positive OD - Negative OD Nếu tỷ lệ S/P > 0, thì mẫu kiểm tra có chứa kháng thể kháng IBDV. Và qua kết quả nghiên này, người ta đưa ra một phương trình hồi quy xác định nồng độ kháng thể trong mẫu: log 10X= 0.0958 * (log10 S/P ratio) + 3.5936 NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 15
  16. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO II.3.2 FLOCKSCREEN™ Infectious Bursal Disease Antibody ELISA kit II.3.2.1 Bộ kit được sử dụng để: Ước lượng thời gian thích hợp nhất cho tiêm phòng. Giám sát các phản ứng sau khi tiêm vaccin. Xác nhận các tình trạng của bệnh. II.3.2.2. Đề nghị cách lấy mẫu xét nghiệm: Theo hướng dẫn, chỉ cần 1% mẫu là đủ cho tiêm phòng hoặc giám sát dịch bệnh. Trong thực tế, đối với IBD, chỉ cần có từ 20-50 gia cầm mỗi trại là đủ để tiến hành thí nghiệm kiểm tra. II.3.2.3. Thành phần bộ kit :dành cho bộ kit có 2 đĩa 96 giếng 1. 2 đĩa 96 giếng, các giếng có phủ sẵn kháng nguyên IBD. 2. Mẫu đối chứng dương với kháng thể kháng IBDV trong dung dịch đệm phosphate có protein ổn định và ProClin 0.063% (500µl) (ProClin là một chất kháng các vi sinh vật và không ngăn cản việc gắn kết kháng thể) 3. Mẫu đối chứng âm là huyết thanh gà sạch bệnh trong dung dịch đệm phosphate cũng có protein ổn định và ProClin 0.063% (500µl). 4. Kháng thể thứ cấp kháng kháng thể của gà thu nhận từ lừa được đánh dấu bằng enzyme alkaline phosphastase trong dung dịch đệm Tris với 1 thuốc nhuộm trơ có màu xanh và Sodium Azide (NaN3) 0.1% (11ml). 5. Cơ chất tạo màu phản ứng bao gồm phenolphthalein monophosphate và coenzyme trong dung dịch đệm diethanolamine (11ml). 6. Dung dịch dừng phản ứng là NaOH trong dung dịch đệm diethanolamine (11ml). 7. Dung dịch đệm rửa: đệm phosphate với ProClin 0.63% (50ml) vừa đủ để pha được 1000ml dung dịch rửa. 8. Dung dịch pha loãng mẩu: đệm phosphate, protein ổn dịnh và Proclin 0.63% (50ml) vừa đủ để pha được 500 ml dung dịch pha loãng. II.3.2.4. Mô tả thí nghiệm: Bộ kit cung cấp một phương pháp test nhanh chóng, đơn giản và nhạy để phát hiện kháng thể của IBDV trong huyết thanh hoặc lòng đỏ trứng gà. Một đĩa được phủ sẵn với các kháng nguyên tinh khiết của virus. Mẫu huyết thanh pha loãng được ủ trong các giếng, nơi mà các kháng thể sẽ gắn kết đặc hiệu với kháng nguyên. NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 16
  17. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Các phần từ dư thừa, không gắn kết đặc hiệu sẽ được rửa bỏ loại khỏi các giếng. Một kháng thể thứ cấp kháng kháng thể của gà thu từ lừa được đánh dấu bằng enzyme alkaline phosphastase được thêm vào các giếng để gắn kết đặc hiệu với kháng thể của gà. Sau đó các giếng được rửa thêm lần nữa để loại bỏ các thành phần không gắn kết. Cơ chất tạo màu PMP được bổ sung vào các giếng. Cường độ màu có liên quan trực tiếp đến số luợng kháng thể có trong mẫu huyết thanh. Hình: Sơ đồ hóa tiến trình thí nghiệm. II.3.2.5. Tiến hành thí nghiệm: Chuẩn bị mẫu Mẫu huyết thanh cần được giữ tươi và sạch thì càng tốt và được lưu trữ ở 4oC (có thể bảo quản lên đến 2 ngày) hoặc ở -20 oC sẽ bảo quản được lâu hơn. Tiến hành pha loãng mỗi mẫu thí nghiệm theo tỷ kệ 1:500 trong dung dịch đệm pha loãng bằng cách thêm từ 2.5 – 5 μl mẫu huyết thanh đã được hoàn nguyên và cho vào trong một tube nhựa 5ml. Đảo ngược nhẹ nhàng 2 hoặc 3 lần để trộn. Ngoài ra, ở bước 2 có thể sử dụng các đĩa để pha loãng và có thể dùng tối thiểu là 5μL mẫu. Các bước thí nghiệm: + Ðánh dấu vị trí mẫu và đối chứng. + Bổ sung 50µl huyết thanh vào mỗi giếng, ủ ở 37 oC trong 30ph. + Các thành phần dư thừa, không gắn kết đặc hiệu sẽ được rửa bỏ loại khỏi các giếng bằng dung dịch đệm rửa (300µl/giếng). + Thêm 50 µl kháng thể thứ cấp có gắn với enzym. + Ủ ở 37 oC trong 30ph + Tiến hành rửa các thành phần dư thừa, không gắn kết đặc hiệu bằng dung dịch đệm rửa (300µl/giếng). NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 17
  18. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO + Thêm 50µl cơ chất tạo màu phản ứng, lắc đều. + Ủ ở 37 oC trong 15ph. Dung dịch chuyển thành màu hồng nhạt. + Thêm 50µl dung dịch kết thúc phản ứng, lắc đều. + Tiến hành đọc kết quả bằng máy Microtitre Plate Reader ở buớc sóng 550nm trong vòng 15ph sau khi thêm dung dịch dừng phản ứng. Kết quả thí nghiệm sẽ có giá trị khi: Độ hấp thu của đối chứng âm < 0.2 Độ hấp thu của đối chứng dương > 0.6 Và để tính toán kết quả tỷ lệ S/P (tỷ lệ mẫu trên các mẫu dương tính) được đề nghị sử dụng ( theo công thức ( )). Và trong trường hợp này nhà sản xuất đã đưa ra công thức hồi quy để tính nồng độ kháng thể trong mẫu như sau: log10X = 0.557 * ( log10 S/P ) + 3.6845 X = 10^[ 0.557 * ( log10 S/P) + 3.6845] Tỷ lệ S/P có thể được lý giải theo như bảng sau: Tỷ lệ S/P Mức IBV Tình trang tạo kháng thể 0.017 > 501 Quá cao để tiêm phòng . NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 18
  19. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO Chương 3 KẾT LUẬN Bệnh Gumboro là bệnh cấp tính của gà, virus gây bệnh Gumboro (IBDV - Infectious bursal disease virus) phá huỷ túi Fabracius, làm giảm khả năng miễn dịch của gà. Lứa tuổi gà mắc bệnh cao nhất là 3 – 6 tuần tuổi, gà nhỏ hơn có thể mắc bệnh ở thể tiềm ẩn, không biểu hiện triệu chứng nhưng ảnh hưởng rất lớn vì nó làm ức chế quá trình sinh miễn dịch. Đây là một bệnh nguy hiểm, gây thiệt hại rất lớn cho chăn nuôi gà, kể cả gà nuôi công nghiệp và gà nuôi thả vườn trên toàn thế giới cũng như ở Việt Nam. Do đặc điểm phức tạp của bệnh nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi nhiều dụng cụ, trang thiết bị hiện đại mới thực hiện được. Ngày nay cùng với sự phát triển nhanh chóng và sự hỗ trợ đắc lực của công nghệ sinh học đặc biệt là sinh học phân tử với kỹ thuật chẩn đoán ELISA đã tạo điều kiện thuận lợi cho công tác nghiën cứu, chẩn đoán cũng như phòng trừ bệnh. NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 19
  20. KỸ THUẬT ELISA TRONG CHẨN ĐOÁN VIRUS GUMBORO TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. Công Nghệ Sinh Học Trong Thú Y – Nguyễn Ngọc Hải – NXB Nông Nghiệp 2. Công Nghệ Sinh Học Trên Người và Động Vật – Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc – NXB Giáo Dục. 3. The ELISA Guidebook ( Second edition ) – John R.Crowther. 4. www.poultryhub.org/index.php/Infectious_bursal_disease_(or_Gumboro) 5. http://www.isapoultry.com/downloads/1/2007- 11_infectious_bursal_disease.pdf 6. http://en.wikipedia.org/wiki/Infectious_bursal_disease 7.www.informaworld.com/smpp/section?content=a727478229&fulltext=713 240928 8. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3015105 9. www.hrcak.srce.hr/file/38236 10.http://search.cosmobio.co.jp/cosmo_search_p/search_gate2/docs/GDH_/ V094.20060703.pdf 11. http://www.hytest.fi/data_sheets/newsletters/Poultry%20Diseases.pdf 12. http://chonongnghiep.com/forum.aspx?g=posts&t=1393 13. http://chonongnghiep.com/forum.aspx?g=posts&t=1393 14. http://cnts.hua.edu.vn NGUYỄN TRẦN LÂM THANH 20
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

LV.15: Bộ Đồ Án Tốt Nghiệp Chuyên Ngành Cơ Khí
65 tài liệu
2431 lượt tải
THÔNG TIN
TRỢ GIÚP
HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG
Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2022-2032 TaiLieu.VN. All rights reserved.

 

Đồng bộ tài khoản
4=>1