Tinh sạch và đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của sắc tố đỏ prodigiosin từ Serratia marcescens

TAP CHI SINH HOC 2015, 37(1se): 210­216<br />  DOI:     10.15625/0866­7160/v37n1se.<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> TINH SẠCH VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN <br /> CỦA SẮC TỐ ĐỎ PRODIGIOSIN TỪ Serratia marcescens<br /> <br /> Nguyễn Sỹ Lê Thanh*, Lê Đình Quyền<br /> Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *nslthanh@ibt.ac.vn<br /> <br /> TÓM TẮT:  Prodigiosin (Pg) là hợp chất chuyển hóa sinh học thứ  cấp alkaloid có nhiều tác  <br /> dụng đặc biệt như  kháng ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm,  ức chế  miễn dịch.  Prodigiosin <br /> được sản xuất bởi một số chủng vi khuẩn như   Serratia marcescens, Hahella chejuensis, Vibrio <br /> psychroerythrus và Streptomyces coelicolor, trong đó loài S. marcescens được biết đến sớm nhất <br /> và được tìm hiểu từ rất sớm. Trong nhiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện  <br /> để tách chiết và tinh sạch sơ bộ Pg từ dịch lên men chủng S. marcescens M10. Ethyl acetate có <br /> chứa 5% acetone là hệ  dung môi thích hợp để  tách chiết Pg từ  dịch nuôi cấy. Hệ  dung môi <br /> chloroform: methanol: H2O với tỷ lệ tương  ứng là 8: 0,5: 0,1 thích hợp cho việc phân tách hoạt <br /> chất Pg trên hệ  sắc kí bản mỏng TLC. Bước đầu được tinh sạch qua cột sắc ký chứa silicagel  <br /> 60, trên bản sắc kí bản mỏng TLC, chúng tôi đã thu được một băng đậm có kích thước ngang  <br /> với Pg chuẩn. Pg từ chủng S. marcescens M10 có khả năng ức chế sự phát triển của các chủng  <br /> vi khuẩn như S. aureus, B. subtilis và không ức chế vi khuẩn như E. coli.<br /> Từ khóa: Serratia marcescens M10, môi trường, prodigiosin, tinh sạch, vi khuẩn đỏ.<br /> <br /> MỞ ĐẦU Mười loài của  Serratia  đã được mô tả, trong <br /> đó   chỉ   ba   loài   có   khả   năng   sinh   tổng   hợp <br /> Prodigiosin  (Pg)  là   chất   chuyển   hóa   thứ <br /> prodigiosin:  <br /> cấp tự  nhiên được sinh tổng hợp bởi các loài <br /> S. plymuthica, S. rubidaea  và  S. marcescens.  <br /> lựa chọn của vi khuẩn như  S. marcescens,  S.  <br /> S. marcescens  là một vi sinh vật hô hấp tuỳ <br /> proteamacula  657 ,  Hahella chejuensis  KCTC <br /> tiện và do đó các sắc tố  được sản xuất dưới  <br /> 2396,  V. psychroerythrus,  V. ruber  sp. nov,  V. <br /> cả  hai điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Sản xuất <br /> gazogenes  ATCC   29988T,  Streptomyces  <br /> sắc   tố   rất   khác   nhau   giữa   các   loài   và   phụ <br /> coelicolor,  Pseudoalteromonas  sp.   1020R, <br /> thuộc   vào   nhiều   các   yếu   tố   như   nguồn   loài <br /> Pseudomonas   magnesiorubra  , <br /> điển hình, thời gian nuôi cấy, pH, carbon, nitơ <br /> Janthinobacterium   lividum  ,  Zooshikella <br /> và các muối vô cơ. Với các thành phần môi  <br /> rubidus S1­1 . Hiện nay, prodigiosin đã và đang <br /> trường   và   các   yếu   tố   nuôi   cấy   tối   ưu,   các <br /> nhận   được   nhiều   sự   quan   tâm   của   các   nhà <br /> chủng  S. marcescens  phân lập  ở  các nơi khác <br /> nghiên cứu do khả  năng  ức chế  miễn dịch và <br /> nhau cho năng suất sinh tổng hợp prodigiosin <br /> kháng ung thư trên nhiều dòng tế bào ung thư <br /> rất   khác   nhau,   như  S.   marcescens  SWML08: <br /> kháng thuốc như  MDR1, BCRP, hoặc MRP2 , <br /> 1,39796 mg/L,  S. marcescens: 1,84527 mg/L . <br /> hay tế bào bạch cầu nguyên bào tuỷ K562 mãn <br /> Song   et   al.   (2006)     đã   chiết   và   tinh   sạch <br /> tính  ở  người . Ngoài ra, Pg còn có hoạt tính  <br /> prodigiosin   từ   chủng  Serratia  sp.   KH­95   từ <br /> kháng khuẩn, kháng nấm  và ít gây ảnh hưởng  <br /> chất hấp phụ  bên trong sử  dụng methanol đã <br /> tới   tế   bào   bình   thường.   Trong   các   loài   vi <br /> acid hóa và tách pha với nước và chloroform. <br /> khuẩn  S. marcescens  là loài có khả  năng sinh <br /> Tiếp theo, chất được tinh sạch bằng sắc ký <br /> tổng hợp prodigiosin được biết đến sớm nhất <br /> silica   gel   và   sắc   ký   lỏng   hiệu   năng   cao  <br /> và được tìm hiểu từ rất sớm . S. marcescens là <br /> (HPLC). Sắc tố  quan tâm được tinh chế  qua <br /> trực khuẩn hình que, vi khuẩn hô hấp tuỳ tiện,  <br /> cột sắc ký (50×1 cm) sử  dụng silica làm chất  <br /> thuộc họ  Enterobacteriaceae và đặc trưng bởi <br /> hấp phụ. Việc nghiên cứu những loại thuốc <br /> khả   năng   tạo   ra   các   sắc   tố   đỏ   prodigiosin. <br /> <br /> <br /> 210<br /> có tác dụng chống ung thư, có giá thành phù  ̣ ̉ ̉<br /> hiên trên ban mong silica gel Merck 60 F254,  <br /> hợp với  điều kiện của  đa số  người bệnh  ở  day 0,25 mm, v<br /> ̀ ới hệ  dung môi là  chloroform: <br /> Việt Nam là một việc làm rất quan trọng, cần  ́ ̣ ́ ử <br /> methanol: H2O sau đo hiên mau băng thuôc th<br /> ̀ ̀<br /> thiết và cấp bách. Vì vậy để bước đầu nghiên  iodine.<br /> cứu về  thu nhận prodigiosin, việc nghiên cứu  Săc ky côt <br /> ́ ́ ̣<br /> tách chiết và thử  nghiệm hoạt tính là vô cùng <br /> cần thiết. ́ ́ ̣<br /> Săc ky côt (Column chromatography, CC)  <br /> được sử dung đê phân tach cac chât d<br /> ̣ ̉ ́ ́ ́ ựa vao đô<br /> ̀ ̣ <br /> VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU phân cực cua chung hoăc tuy theo kich th<br /> ̉ ́ ̣ ̀ ́ ươć  <br /> Môi trường nuôi phân tử. Trong nghiên cưu nay, viêc phân lâp<br /> ́ ̀ ̣ ̣  <br /> cac chât đ<br /> ́ ́ ược thực hiên băng săc ky côt v<br /> ̣ ̀ ́ ́ ̣ ơí <br /> Chủng  Serratia   marcescens  M10   được  chât mang la SiO<br /> ́ ̀ 2. Tẩm SiO2 với cặn chiết lên <br /> phân lập, định danh theo các nghiên cứu trước  men theo tỷ  lệ  1:1 w/w, nhồi cột SiO2 bằng  <br /> đây [15,16]. Môi trường nuôi cấy khảo sát khả  kỹ  thuật nhồi  ướt và đẩy với hệ  dung môi đã <br /> năng sinh tổng hợp sắc tố đỏ  prodigiosin của   chọn là dichloromethane: ethyl acetate với t ỷ <br /> các chủng vi khuẩn: (30 ml LB + 2% lạc xay;   lệ  thể  tích thay đổi từ  100/0 đến 50/50. Rửa <br /> tinh dầu vừng, casein). Chủng vi khuẩn sinh   giải cột bằng hệ  dung môi  ở  trên với tỷ  lệ <br /> sắc tố đỏ trên trong 3 ml môi trường LB lỏng,   tăng   độ   phân   cực   (bắt   đầu   từ   100/0   đến <br /> nuôi lắc 200 rpm ở 28oC qua đêm. Sau đó tiếp  0/100). Sau khi thu được các phân đoạn chính, <br /> giống 5% (1,5 ml) vào các bình tam giác chứa  tiến   hành   chạy   TLC   để   xác   định   vạch  chất  <br /> 50 ml các môi trường khác nhau, nuôi lắc 200   cần, lấy phân đoạn có vạch xác định tách lại <br /> rpm  ở  28oC trong 120 giờ  nuôi cấy, kiểm tra  để  phân lập tiếp bằng sắc ký cột hoặc kết  <br /> các mẫu nuôi lắc mỗi ngày để  chọn lựa môi  tinh.<br /> trường có khả  năng sinh tổng hợp prodigiosin <br /> cao nhất. Xác định khả năng kháng vi sinh vật của <br /> dịch chiết<br /> Xác định hàm lượng prodigiosin bằng <br /> đường chuẩn Phương   pháp   thử   hoạt   tính   ức   chế   vi <br /> khuẩn được thực hiện theo phương pháp của  <br /> Prodigiosin   chuẩn  (Sigma)   có   hàm   lượng  Hadacek   et   al.   (2000)   .   Một   khuẩn   lạc   các <br /> 100 µg/ml được chúng tôi tiến hành pha loãng  chủng vi sinh vật nghiên cứu được nuôi lắc  <br /> ở các nồng độ xác định và đo OD ở bước sóng <br /> 200   vòng/phút   ở   37 C   qua   đêm   trong   môi <br /> 535 nm. Tiến hành lặp lại 3 lần sau đó lấy giá <br /> trường LB không bổ  sung kháng sinh. Trải 50 <br /> trị  trung bình để dựng đường chuẩn.  Đường <br /> chuẩn   prodigiosin   được   dựng   dựa   vào   hàm  l dịch nuôi trên môi trường thạch LB không <br /> lượng prodigiosin  pha loãng  và  giá  trị   OD  ở  bổ  sung kháng sinh, sau  đó đục  lỗ  thạch và <br /> nồng   độ   pha   loãng   đó   .   Đường   chuẩn  nhỏ  100  l dịch chiết có chứa prodigiosin tách <br /> prodigiosin: Y = 0,2544X + 0,0711. từ   dịch   nuôi   cấy,   để   4 C   trong   3­4   giờ   rồi <br /> chuyển sang nuôi 37 C, qua đêm. Quan sát khả <br /> Sắc kí bản mỏng<br /> năng kháng khuẩn.<br /> Săć   ký   bản   mong ̉   (Thin   layer  <br /> chromatography, TLC) được sử  dụng để  phân  KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN<br /> ́ ̀ ́ ̣<br /> tich va xac đinh sô l ́ ượng cac nhom chât khac<br /> ́ ́ ́ ́ <br /> Thu   nhận   và   tách   chiết   Pg   từ  Seratia  <br /> ́ ̀ ̀ ̣<br /> nhau co trong thanh phân dich chiêt hoăc cac ́ ̣ ́ <br /> ̣ ́<br /> phân đoan tach ra. D ựa trên nguyên tăc cac chât<br /> ́ ́ ́  marcescens M10<br /> ́ ̣<br /> khac nhau co đô phân c<br /> ́ ực khac nhau nên đ<br /> ́ ược <br /> tach ra <br /> ́ ở  cac vi tri khac nhau. Đây la ph<br /> ́ ̣ ́ ́ ̀ ương  <br /> phap vi l<br /> ́ ượng, hiêu qua tach cao va th<br /> ̣ ̉ ́ ̀ ơi gian<br /> ̀  <br /> thực hiên ngăn. Săc ky l<br /> ̣ ́ ́ ́ ơp mong <br /> ́ ̉ được  thực  <br /> <br /> <br /> 211<br />  được thấp hơn so với kết quả  của chúng tôi  <br /> 60 53,1 53,94 và chỉ  đạt 1,84527 mg/L, và tương đương với <br /> 50 41,27 prodigiosin sản xuất bởi  S. marcescens  trong <br /> 40 môi trường có chứa hạt vừng và lạc xay trong  <br /> 30 nghiên cứu của Giri et al. (2004) . Nghiên cứu <br /> 20 của Aurjo et al. (2010)   cho thấy, hàm lượng  <br /> prodigiosin bởi  S. marcescens  UCP 1549 cũng <br /> 10<br /> 0,06 0,21 thấp hơn trong môi trường chất thải sắn khi  <br /> 0 so sánh nồng độ  prodigiosin trong nước luộc  <br /> Lạc  Bột  Casein Tinh  Bôt <br /> sắn thu được.<br /> xay gạo dầu  s ắn<br /> vừng Để  lựa chọn dung môi thích hợp và thơi <br /> Prod igiosin  ( mg/ L) gian tiến hành tách chiết, dịch lên men sau khi <br /> Hình 1. Ảnh hưởng của cơ chất nuôi cấy lên  đã ly tâm loại tế bào được ủ với các dung môi  <br /> tổng hợp Pg khác   nhau   như   ethyl   acetate,   ethyl   acetate:  <br /> acetone (95:5) và chloroform trong khoản thời  <br /> Chủng  Seratia   marcescens  M10   đã   được  gian 24, 48, 72, 96 và 120 phút trên máy lắc  ở <br /> định   danh,   tối   ưu   môi   trường   nuôi   cấy   sinh  nhiệt độ phòng. Kết quả ở hình 2 cho thấy, hệ <br /> tổng   hợp   prodigiosin   trong   các   nghiên   cứu  dung môi ethyl acetate: acetone (95:5) cho hàm <br /> trước đây . Tuy nhiên, với điều kiện nuôi cấy  lượng   Pg   cao   nhất   sau   72   phút   ở   nhiệt   độ <br /> ở  các nghiên cứu trước với nguồn cơ  chất là  phòng.<br /> lạc xay dịch tách chiết rất khó phân tách khi <br /> 0,7<br /> tinh sạch. Đặc biệt trong môi trường có chứa  <br /> dầu  lạc,   việc tinh  sạch và   chạy sắc  kí   bản  0,6<br /> mỏng gặp nhiều khó khăn. Vì vậy, chúng tôi  0,5<br /> cũng  đã   nghiên  cứu   tìm   môi   trường   dễ   tách <br /> chiết và đảm bảo hàm lượng prodigiosin đạt  0,4<br /> mD<br /> O<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> cao nhất. <br /> n<br /> 3<br />  5<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 0,3<br /> Chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng  S.  0,2<br /> marcescens M10 trong môi trường chứa các cơ <br /> 0,1<br /> chất là lạc xay, bột gạo, casein, tinh dầu dừa  <br /> và bột sắn với hàm lượng là 1% (w/v). Kết   0<br /> quả hình 1 cho thấy, chủng M10 sinh tổng hợp   24 48 72 96 120<br /> Thời gian (phút)<br /> prodigiosin   cao   nhất   ở   môi   trường   có   chứa <br /> Hình 2.  Ảnh hưởng của dung môi và thời gian <br /> casein 1% (w/v) tương đương với môi trường <br /> ủ  lên hiệu quả  tách chiết Pg từ dịch chiết lên <br /> lạc xay (hình 1).<br /> men   chủng  S.     marcescens  M10.   ▲   Ethyl <br /> Theo một số nghiên cứu trước đây, các tác  acetate ;   ■   Ethyl   acetate :Acetone   (95 :5) ;   ♦ <br /> giả   đã   thu   được   sản   phẩm   prodigiosin   thu   Chloroform<br /> <br /> <br /> A B C D E<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 212<br />  Hình 3. TLC dịch chiết lên men chủng S.  marcescens M10 với các hệ dung môi khác nhau: <br /> A (8 : 1,5 : 0,1); B (8 : 1,3 : 0,1); C (8 : 1 : 0,1); D (8 : 0,5 : 0,1); E (8 : 0,8 : 0,1).<br /> <br /> Sau khi lựa chọn môi trường và điều kiện  phù hợp cho TLC,  chúng tôi đã khảo sát  <br /> tách chiết cho thí nghiệm tiếp theo, chúng tôi  nhiều hệ  dung môi khác nhau và kết quả  cho  <br /> tiến hành kiểm tra các sản phẩm từ dịch chiết  thấy   hệ   dung   môi   có   chứa  chloroform: <br /> trong các môi trường có chứa casein, lạc xay   methanol: H2O cho vạch tương đối rõ nét và <br /> và tinh dầu vừng. Kết quả  TLC  ở  hình 3 với   gọn.   Khi   tìm   được   hệ   dung   môi   thích   hợp, <br /> hệ dung môi chloroform: methanol: H2O với tỷ  chúng tôi tiến hành lựa chọn tỷ  lệ  dung môi <br /> lệ D (8 : 0,5 : 0,1) cho thấy, dịch chiết từ môi  để  cho bản sắc kí được tách ra các vạch rõ  <br /> trường   có   chứa   casein   cho   số   băng   vạch   ít  nét. Kết quả   ở  hình 3 cho thấy, hệ  dung môi  <br /> hơn. Điều này có thể lý giải là do môi trường  với tỷ lệ D  (8 : 0,5 : 0,1) cho các băng vạch rõ <br /> lạc xay và môi trường tinh dầu vừng có thế có   nét   và   tách  rời   khỏi   nhau.   Vì   vậy   chúng  tôi <br /> thêm   các   chất   béo   trong   dịch   chiết.   Vì   vậy,  chọn hệ  dung môi chloroform: methanol: H2O <br /> môi trường casein là môi trường được chúng  với tỷ  lệ  D (8 : 0,5 : 0,1) cho các thí nghiệm <br /> tôi chọn lựa cho các nghiên cứu tiếp theo. tiếp theo.<br /> Lựa chọn hệ dung môi phù hợp cho TLC<br /> Hệ  dung môi và tỷ  lệ dung môi khác nhau <br /> khi chạy sắc kí bản mỏng sẽ  cho những hình <br /> ảnh khác nhau. Vì vậy, để lựa chọn dung môi<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 213<br />  4,5<br />  CHCl3/MeOH <br /> 4<br /> OD, 535 nm<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 3,5     80/20<br /> 3    90/10<br /> 2,5    94/6<br /> 2 CHCl3<br /> <br /> 1,5<br /> 1<br /> 0,5<br /> 0<br /> 0 100 200 300 400 500 600 700<br /> Thể tích (ml)<br /> Hình 4. Phân đoạn tinh sạch sắc tố đỏ thô qua cột silica gel. Thứ tự rửa giải: 0­300 ml với <br /> CHCl3; 310­400 ml với CHCl3/CH3OH 94/6 (v/v); 410­600 ml với CHCl3/CH3OH 90/10 (v/v); từ <br /> 610 ml với CHCl3/CH3OH 80/20 (v/v).<br /> <br /> Tinh  sạch sắc tố   đỏ  prodigiosin  qua  cột   gom các phân đoạn theo các đỉnh thu được khi <br /> silicagel chạy cột, các mẫu có hàm lượng Pg cao nhất <br /> khi  đo  OD  535nm   được   chúng  tôi   tiến  hành <br /> Sắc tố đỏ prodigiosin được tách chiết theo <br /> qua cột lần hai để  thu được các phân đoạn có <br /> quy  trình   đã   nêu  ở   trên   được   chúng  tôi   tiến <br /> độ tinh sạch cao hơn.<br /> hành tinh sạch qua cột sắc ký. Khoảng  5 mg <br /> sắc tố đỏ thô trong ethyl acetate được sây khô  Kết quả TLC của các phân đoạn tinh sạch <br /> trong máy cô quay chân không Buchi (Đức) hòa  theo thứ  tự  cho thấy, có 4 phân đoạn 4­7 cho <br /> trở  lại trong 5 ml methanol. Nhồi mẫu lên cột  một băng sạch không chứa các vạch phụ và có <br /> (2,5x35 cm), cột được nhồi với silica gel 60   Rf ngang với chuẩn Pg (hình 5).<br /> (0,063­0,200   mm)   (Merck   KgaA   ­   Đức),   cân <br /> 1     2      3     4     5    6     7<br /> bằng cột trong chloroform. Thu các phân đoạn <br /> được thực hiện một cách tự  chảy với tốc độ <br /> dòng chảy 5­10 ml/phút, rửa giải đầu tiên với <br /> chloroform   tinh   khiết,   sau   bằng <br /> chloroform/methanol với tỷ  lệ  khác nhau. Các <br /> mẫu được rửa giải trong chloroform tinh khiết  <br /> có màu đỏ tươi, sau đó thay đổi thành màu nâu <br /> đỏ   trong   phân   đoạn   chloroform/methanol,   và <br /> đỏ  tím  trong phân  đoạn methanol  tinh  khiết. <br /> Các phân đoạn thu được xác định hàm lượng <br /> Pg bằng đo OD 535 nm. Các phân đoạn tinh  Hình 5. Kết quả chạy sắc kí bản mỏng (TLC) <br /> sạch thu được nhiều đỉnh với hàm lượng Pg   mẫu M10 <br /> khác nhau (hình 4), sau đó được TLC kiểm tra  1: Pg chuẩn (SIGMA); 2: dịch nổi; 3: dịch chiết 4­<br /> với   chuẩn   Pg   (Sigma).   Chúng   tôi   tiến   hành  7: Các phân đoạn prodigiosin sau khi chạy qua cột <br /> <br /> <br /> 214<br /> sắc kí theo thứ tự rửa giải với CHCl3/CH3OH 94/6  giếng   thạch.  50  μl  mẫu   được   nhỏ   vào   mỗi <br /> (v/v); 410­600 ml với CHCl3/CH3OH 90/10 (v/v);  giếng (9 mm) được đục bằng khoanh đục lỗ vô <br /> từ 610 ml với CHCl3/CH3OH 80/20 (v/v). trùng trên đĩa thạch LB và YP đã trải vi khuẩn <br /> Thử  hoạt tính kháng khuẩn của sắc tố  đỏ  kiểm định trên bề mặt. Đĩa thử nghiệm được ủ <br /> prodigiosin ở  30°C trong 18­24 giờ. Sự  kháng khuẩn được <br /> Pg được biết đến là một hợp chất thứ  cấp   thể  hiện với khu vực  ức chế  (vòng vô khuẩn) <br /> có màu đỏ và có hoạt tính kháng khuẩn, ức chế  xung quanh giếng cũng đã được thể hiện trên đĩa  <br /> miễn dịch, kháng ung thư. Trong nghiên cứu tiếp  thạch (hình 6). Dịch chiết Pg đã không xuất hiện <br /> theo, chúng tôi kiểm tra khả năng kháng một số  vòng   kháng   khuẩn   trên   đĩa   thạch   có   chứa   vi <br /> loại vi khuẩn. Mẫu dịch chiết sắc tố đỏ và các  khuẩn E. coli DH10B, điều này phù hợp với các <br /> phân đoạn tinh sạch được thử  hoạt tính kháng  nghiên cứu của nhiều tác giả trên thế giới . Trên <br /> khuẩn   với   các   chủng   vi   khuẩn   kiểm   định  đĩa thạch có chứa B. subtilis WB800 và chủng S.  <br /> Bacillus   subtilis  WB800,  E.   coli  DH10B,   và  aureus  đã xuất hiện vòng kháng khuẩn tương <br /> chủng  S. aureus, theo phương pháp khuếch tán  đối rõ nét.<br /> <br /> A B C<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> Hình 6. Khả năng ức chế vi sinh vật kiểm định của sắc tố đỏ Pg<br /> A. S. aureus;  B. B. subtilis; C. E. coli; Ampi: ampicillin; Pg: standard prodigiosin; CL: dịch chiết từ môi <br /> trường lạc xay; Casein: dịch chiết từ môi trường casein; DC (­): methanol (đối chứng âm).<br /> <br /> KẾT LUẬN nghiệm hoạt tính kháng ung thư trên các dòng <br /> tế bào ung thư khác nhau.<br /> Nghiên cứu này chỉ ra rằng môi trường có <br /> bổ sung casein là tốt nhất để sinh tổng hợp Pg   Lời cảm  ơn. Công trình có sự  hỗ  trợ  của <br /> và dễ  dàng tinh sạch. Dung môi ethyl acetate  nhiệm  vụ   quỹ   gen:  “Khai  thác  và  phát  triển <br /> có chứa 5% acetone là hệ  dụng môi thích hợp  nguồn gene vi sinh vật tổng hợp prodigiosin có <br /> để tách chiết Pg từ dịch nuôi cấy. Chúng tôi đã  hoạt   tính   chống   ung   thư”   Bộ   Khoa   học   và <br /> tách chiết được sắc tố  đỏ  từ  dịch nuôi chủng  Công nghệ, 2014­2016. <br /> S.  marcescens M10 bằng dung môi phân cực,  TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> dịch chiết được tinh sạch sơ  bộ  bằng sắc kí <br /> cột silicagel xuất hiện vạch trùng với chuẩn  1. de Araujo H. W., Fukushima K., Takaki G. <br /> Pg   khi   kiểm   tra   bằng   TLC.   Pg   từ   chủng   S.  M.,   2010.  Prodigiosin   production   by <br /> marcescens  M10 có khả  năng  ức chế  sự  phát  Serratia   marcescens  UCP   1549   using <br /> triển của các chủng vi khuẩn như    S. aureus,  renewable­resources as a low cost substrate. <br /> B. subtilis  và không  ức chế  vi khuẩn như  E.  Molecules, 15(10): 6931­6940.<br /> coli. 2. Duzhak A.  B.,  Panfilova  Z.  I.,  Duzhak  T. <br /> Các kết qua thu được sẽ  được phát triển  G.,   Vasyunina   E.   A.,   Shternshis   M.   V., <br /> thêm để tinh sạch lượng lớn Pg và tiến tới thử  2012. Role of prodigiosin and chitinases in <br /> <br /> <br /> 215<br />  antagonistic   activity   of   the   bacterium  as   antibacterial   and   plasmid   agent.  Kurd <br /> Serratia   marcescens  against   the   fungus  Biol. Sci., 12(1): 268­274.<br /> Didymella applanata. Biochem Biok, 77(8):  11. Miao L., Wang X., Jiang W., Yang S., Zhou <br /> 910­916. H.,   Zhai   Y.,   Zhou   X.,   Dong   K.,   2013. <br /> 3. Elahian F., Moghimi B., Dinmohammadi F.,  Optimization of the culture condition for an <br /> Ghamghami M., Hamidi M., Mirzaei S. A.,  antitumor bacterium  Serratia proteamacula <br /> 2013.   The   anticancer   agent   prodigiosin   is  657   and   identification   of   the   active <br /> not a multidrug resistance protein substrate,  compounds.  J.   Microbiol.     Biotechnol., <br /> DNA Cell Biol, 32(3): 90­97. 29(5): 855­863.<br /> 4. Gerber   N.   N.,   1975.   Prodigiosin­like  12. Schloss P. D., Allen H. K., Klimowicz A. <br /> pigments.  Crit   Rev   Microbiol,  3(4):   469­ K.,  Mlot  C.,  Gross  J.  A.,  Savengsuksa  S., <br /> 485. McEllin   J.,   Clardy   J.,   Ruess   R.   W., <br /> 5. Giri A. V., Anandkumar N., Muthukumaran  Handelsman J., 2010. Psychrotrophic strain <br /> G., Pennathur G., 2004. A novel medium for  of Janthino bacterium lividum from a cold <br /> the enhanced cell growth and production of  Alaskan   soil   produces   prodigiosin.   DNA <br /> prodigiosin   from  Serratia   marcescens  Cell Biol, 29(9): 533­541.<br /> isolated from soil. BMC  Microbiol.,  4: 11­ 13. Smithen D. A., Forrester A. M., Corkery D. <br /> 15. P., Dellaire G., Colpitts J., McFarland S. A., <br /> 6. Hadacek   F.,   Greger   H.,   2000.   Testing   of  Berman   J.   N.,   Thompson   A.,   2013. <br /> antifungal natural products: methodologies,  Investigations   regarding   the   utility   of <br /> comparability   of   results   and   assay   choice.  prodigiosenes   to   treat   leukemia.  Org. <br /> Phytochem Analysis, 11: 137­147. Biomol. Chem., 11(1): 62­68.<br /> 7. Harned   R.   L.,   1954.   The   production   of  14. Song M. J., Bae J., Lee D. S., Kim C. H., <br /> prodigiosin   by   submerged   growth   of  Kim   J.   S.,   Kim   S.   W.,   Hong   S.   I.,   2006. <br /> Serratia marcescens.  Appl Microbiol,  2(6):  Purification   and   characterization   of <br /> 365­368. prodigiosin   produced   by   integrated <br /> bioreactor from Serratia sp. KH­95. J Biosc <br /> 8. Kamble   K.   D.,   Hiwarale   V.   D.,   2012. <br /> Bioeng, 101(2): 157­161.<br /> Prodigiosin   production   from  Serratia  <br /> marcescens strains obtained from farm soil.  15. Nguyen Sy Le Thanh, Le Dinh Quyen, Do <br /> Int   J   Environ   Sci,  3(1):doi:10.6088/  Thi Tuyen, Vu Trong Luong, Nguyen Thi <br /> ijes.2012030131061. Anh   Tuyet,   Quyen   Dinh   Thi,   2014. <br /> Optimized   culture   conditions   and <br /> 9. Lee J. S., Kim Y. S., Park S., Kim J., Kang <br /> preliminary   purification   of   prodigiosin <br /> S. J., Lee M. H., Ryu S., Choi J. M., Oh T.  production from  Serratia marcescens  M10. <br /> K.,   Yoon   J.   H.,   2011.   Exceptional  Pub Sci Tech, 335­344.<br /> production   of   both   prodigiosin   and <br /> cycloprodigiosin   as   major   metabolic  16. Nguyen Sy Le Thanh, Le Dinh Quyen, Vu <br /> constituents   by   a   novel   marine   bacterium,  Trong Luong, Do Thi Tuyen, Quyen Dinh <br /> Zooshikella   rubidus  S1­1.  Appl.   Environ.  Thi,   2014.   Screening,   determination   of <br /> Microbiol., 77(14): 4967­4973. bacteria   producing   prodigiosin.,   Viet   Nam <br /> Med, 421: 120­124.<br /> 10. Mekhael R., F. Y. S., 2009. The role of red <br /> pigment   produced   by  Serratia   marcescens <br /> <br /> PURIFICATION AND ANTIBACTERIA ACTIVITY OF ANTICANCER AGENT <br /> PRODIGIOSIN FROM Serratia marcescens M10<br /> <br /> 216<br />  Nguyen Sy Le Thanh, Le Dinh Quyen<br /> Institute of Biotechnology, VAST<br /> <br /> <br /> SUMMARY<br /> <br /> Prodigiosin  (Pg)  is  a   secondary  metabolite  alkaloid  with  anti   cancer,  immunosuppressive,  antifungal <br /> properties.  Pg   is   a   red   pigment,   which   isolated   from   bacteria,   such   as  Serratia   marcescens,   Hahella  <br /> chejuensis, Vibrio psychroerythrus  and  Streptomyces coelicolor. In present study,  we focus on selection  of <br /> culture medium for effective pigment production, and preliminary purification of the Pg from culture of S. <br /> marcescens  M10. Casein supplemented with LB medium acts as a good substrate for Pg production by  S. <br /> marcescens M10. We used casein broth for the further studies as we knew the ingredients in the broth, using  <br /> it would be easier for extraction than using the natural substrates as sesame or peanut because of its unknown  <br /> component. In addition, ethyl acetate containing 5% acetone is the most effective solvent for extraction to get <br /> the   highest   total   prodigiosin.  The   pigment   extracted   from   supernatant   was   passed   through   the   column <br /> chromatography   containing   silicagel   60   to   purify   prodigiosin.   On   TLC,   it   can   seen   that   the   interested <br /> fragments observed run the same with a known compound as standard prodigiosin. The crude extract from <br /> peanut powder broth, casein broth and standard prodigiosin were tested against common pathogen B. subtilis <br /> and S. aureus, which are Gram­positive bacteria. In addition, it was not against the pathogen E. coli, which is <br /> a gram­negative bacterium.<br /> Keywords: Serratia marcescens M10, Red­pigment microoganism medium, prodigiosin, purification.<br /> <br /> Ngày nhận bài: 22­10­2014<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 217<br />