Tóm tắt Luận văn tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra

Chia sẻ: Phong Tỉ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:27

Thêm vào BST

Báo xấu

30
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của luận án nhằm tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu quả.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Tóm tắt Luận văn tiến sĩ Nông nghiệp: Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM -------------------------------------------------- PHẠM MỸ DUNG PHẠM MỸ DUNG NGHIÊN CỨU TẠO GELATINASE TÁI TỔ HỢP VÀ ỨNG DỤNG TRONG THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 9 42 02 01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI, 2018
Công trình được hoàn thành tại: VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Phạm Công Hoạt 2. GS.TS. Lê Huy Hàm 3. TS. Phạm Công Hoạt 4. TS. Lê Huy Hàm Phản biện 1. 2. 3. Luận án được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án tiến sĩ họp tại Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam Có thể tìm kiếm luận án tại thư viện: 1. Thư Viện Quốc Gia Việt Nam 2. Thư viện của Viện Khoa học Nông Nghiệp Việt Nam
1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Gelatinase là một trong những enzym được nghiên cứu nhiều hiện nay với tác dụng thủy phân gelatin, pheromone, collagen, casein và fibrinogen thành các đoạn peptit ngắn và các axít amin. Gelatinase là enzym chứa kim loại, thuộc nhóm protease ngoại bào sử dụng trong ngành công nghiệp hóa chất, y học, công nghệ thực phẩm... Gelatinase tự nhiên được thu nhận từ nhiều loài vi khuẩn thuộc các chi khác nhau như Staphylococcus, Pseudomonas, Aerromonas, Enterobacter, Bacillus… Tuy nhiên, phần lớn vi khuẩn sinh gelatinase nói trên là các đối tượng vi sinh vật (VSV) gây bệnh có thể gây hại đối với con người, động vật nên không được sử dụng trực tiếp để sản xuất gelatinase. Ngoài ra, các vi khuẩn tự nhiên sinh gelatinase có hoạt tính không cao. Để khắc phục những tồn tại trên đối với nguồn gelatinase tự nhiên, hướng nghiên cứu sản xuất gelatinase tái tổ hợp đã và đang được các nhà khoa học, doanh nghiệp quan tâm nghiên cứu nhằm nâng cao hoạt tính enzym, sản xuất ở quy mô lớn và ứng dụng rộng rãi. Ngoài ra, gelatinase tái tổ hợp sản xuất được sẽ loại trừ tính độc của các chủng vi khuẩn tự nhiên, hạn chế tác dụng gây hại tới con người hay động vật. Một trong những phương pháp hiệu quả được chú trọng phát triển trên thế giới là ứng dụng kỹ thuật di truyền và công nghệ lên men tạo ra các chủng VSV tái tổ hợp có khả năng sinh tổng hợp gelatinase tái tổ hợp (rGEL) hoạt tính cao, sản lượng lớn và có khả năng ứng dụng trong công nghiệp. Bên cạnh đó, cả nước có diện tích trên 6.078 ha nuôi cá Tra đạt sản lượng xuất khẩu hơn 1,11 triệu tấn/năm và có tổng giá trị xuất khẩu cá tra của Việt Nam đạt 1,78 tỷ USD năm 2017. Sản phẩm xuất khẩu chủ yếu là cá phi-lê dạng miếng, nhưng theo ước tính cứ 2 ÷ 2,5 kg cá nguyên liệu sẽ chế biến được 1 kg cá phi-lê, phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến và tùy sản phẩm cụ thể, còn lại 1 ÷ 1,5 kg sẽ nằm trong phần phụ phẩm chế biến, trong đó da cá chiếm từ 4 ÷ 6% trên tổng lượng phụ phẩm. Từ da cá có thể tạo ra những sản phẩm khác có giá trị kinh tế cao hơn và có nhiều ứng dụng hơn trong thực tế, giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Vì thế, các công nghệ chế biến nhằm tăng giá trị của các phụ phẩm từ nhà máy chế biến cá Tra như sản xuất dầu, collagen, gelatin, thức ăn được quan tâm hàng đầu. Hiện nay, gelatin có thể được thủy phân trong môi trường kiềm hoặc axit. Tuy nhiên, các công nghệ sản xuất này yêu cầu thiết bị có tính chịu nhiệt, chịu axit hoặc base, đồng thời có thể gây ô nhiễm môi trường. Hơn nữa, việc sử dụng các dung dịch base hoặc axit để thủy phân gelatin sẽ rất dễ gây hiện tượng làm chuyển dạng đồng phân của các axít amin, đây là nguyên nhân làm mất hoạt tính của axít amin. Vì vậy, công nghệ enzym được lựa chọn như giải pháp an toàn. Xuất phát từ cơ sở thực tiễn như trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “ Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp và ứng dụng trong thủy phân gelatin da cá Tra”.
2 2. Mục tiêu của luận án Tạo được chủng Escherichia coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase có nguồn gốc từ Enterococcus faecalis và ứng dụng gelatinase tái tổ hợp thủy phân gelatin da cá Tra thành chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn ương giống có hiệu quả. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn Ý nghĩa khoa học Kết quả của luận án góp phần cung cấp thêm dữ liệu về nguồn gen các chủng vi sinh vật tổng hợp gelatinase tự nhiên. Từ đó tạo chủng E. coli tái tổ hợp sinh tổng hợp gelatinase hiệu quả và ứng dụng gelatinase trong thủy phân da cá Tra tạo nguồn axít amin bổ sung vào thức ăn nuôi cá Mú giống. Ý nghĩa thực tiễn Đưa ra khảo sát ứng dụng gelatinase tái tổ hợp để thủy phân da cá Tra thành bột axít amin và ứng dụng bổ sung vào thức ăn ương nuôi cá Mú chấm đen nhằm nâng cao hiệu quả. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 4.1. Đối tượng nghiên cứu - Chủng vi khuẩn MD4 sinh gelatinase tại Bộ sưu tập vi sinh vật của Khoa Công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội; Các chủng E. coli BL21(DE3), XL1-blue, nhận từ phòng thí nghiệm Genomics, Khoa Vi sinh vật học, Trường Đại học Quốc gia Kyungpook, Hàn Quốc.- Da cá Tra được thu tại công ty cổ phần Vĩnh Nguyên, Khu công nghiệp Trà Nóc,Thành phố Cần Thơ. Mẫu sau khi thu gom được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -20±2°C cho đến khi xử lý và phân tích. - Da cá Tra được thu tại công ty cổ phần Vĩnh Nguyên, Khu công nghiệp Trà Nóc,Thành phố Cần Thơ. Mẫu sau khi thu gom được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ - 20±2°C cho đến khi xử lý và phân tích. Cá Mú chấm đen: khỏe mạnh, đồng đều kích cỡ 7 cm/con, khối lượng cá trung bình 7,067 g/con được thu mua từ Trại ương cá Nghi Hợp – Nghi Lộc – Nghệ An. 4.2. Phạm vi nghiên cứu - Nghiên cứu tạo gelatinase tái tổ hợp, ứng dụng thủy phân gelatin da cá tra với quy mô phòng thí nghiệm, triển khai tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở HN. -Nghiên cứu ứng dụng bổ sung chế phẩm axit amin triển khai ở phạm vi mô hình thử nghiệm, được triển khai tại trại thực nghiệm nuôi hải sản – Trường Đại học Vinh. 4.3. Thời gian nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành từ năm 2013 đến năm 2017 5. Những đóng góp mới của luận án
3 -Là luận án đầu tiên phân lập nguồn gen gel mã hóa GEL từ nguồn vi khuẩn Enterococcus faecalis phân lập tại Việt Nam. - Đã tạo được chủng E. coli BL21[pET22(b)-gelE] tái tổ hợp sinh gelatinase. - Ứng dụng hiệu quả rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra tạo chế phẩm axít amin bổ sung vào thức ăn cho cá Mú chấm đen giai đoạn giống Cấu trúc của luận án: Luận án chính gồm 119 trang với 15 bảng số liệu và 39 hình. Luận án gồm 5 phần: Mở đầu (4 trang); Tổng quan tài liệu (45 trang); Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu (22 trang); Kết quả và thảo luận (46 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang). Luận án tham khảo 199 tài liệu trong đó 20 tài liệu tiếng Việt và 173 tài liệu tiếng Anh, 6 tài liệu từ Website. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong chương này luận án trình bày về cấu trúc, tính chất, ứng dụng của gelatin; đặc điểm, cấu trúc, chức năng, cơ chế hoạt động và nguồn sản xuất của gelatinase; trình bày nghiên cứu về sản xuất gelatinase tái tổ hợp: gen mã hóa gelatinase, biểu hiện gen gelatinase tái tổ hợp, một số yếu tổ ảnh hưởng đến lên men sinh tổng hợp gelatinase, thu hồi và tinh sạch gelatinase; nghiên cứu tình hình sản xuất và ứng dụng gelatinase tại Việt Nam, sản xuất gelatinase, ứng dụng gelatinase vào thủy phân da cá Tra, ứng dụng bổ sung axít amin thủy phân từ da cá Tra vào thức ăn cho cá mú. Sản xuất gelatinase tái tổ hợp đang được nhiều quan tâm nhiều vì chúng là một enzyme thủy phân được ứng dụng để chế biến các nguyên liệu thủy sản còn lại sau chế biến phi lê đang được xem là giải pháp hữu hiệu để tăng giá trị chất lượng sản phẩm thủy phân, đồng thời việc ứng dụng sản phẩm thủy phân từ da cá Tra vào lĩnh vực thực phẩm, chăn nuôi đang được quan tâm nhiều. Vì vậy, sản phẩm của đề tài luận án sẽ là cơ sở khoa học cho việc ứng dụng enzyme tái tổ hợp này vào thủy phân da cá Tra để phục vụ cho nhiều mục đích khác. CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Vật liệu nghiên cứu - Chủng giống vi sinh vật: + Chủng vi khuẩn E. coli DH5α [end A1 rec A1 hsdR17 supE44 gypA96 thi-1relA1Δlac U169 (Φ80 lacZM15)] được sử dụng làm chủng tách dòng. + Chủng vi khuẩn E. coli BL21(DE3) [F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3] được sử dụng làm chủng biểu hiện. + Chủng vi sinh vật sinh gây bệnh cho cá nước ngọt tại các hồ nuôi tại Hà Nội lưu giữ tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, - Da cá Tra: được thu tại công ty cổ phần Vĩnh Nguyên, Khu công nghiệp Trà Nóc, Thành
4 phố Cần Thơ. Mẫu sau khi thu gom được bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ -20 ±2oC cho đến khi xử lý và phân tích. - Cá Mú chấm đen: khỏe mạnh, kích cỡ 7,009 ± 0,185 cm/con, nặng 7,038 ± 0,176 g/con được thu mua từ Trại ương cá Nghi Hợp – Nghi Lộc – Nghệ An. • Thức ăn công nghiệp dạng viên (loại thức ăn dùng cho cá biển cỡ cá giống). 2.2. Nội dung nghiên cứu -Sàng lọc nguồn gen gelE mã hóa GEL từ vi khuẩn phân lập tại Việt Nam. -Tạo chủng E. coli tái tổ hợp sinh gelatinase và nghiên cứu điều kiện lên men biểu hiện rGEL . -Lựa chọn điều kiện thu hồi sản phẩm rGEL kỹ thuật và nghiên cứu đặc tính của rGEL. -Ứng dụng rGEL trong thủy phân gelatin da cá Tra 2.3.Phương pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp sàng lọc nguồn gen mã hóa gelatinase 2.4.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao * Định tính gelatinase bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch (Ball, 1997): * Xác định khả năng hóa lỏng gelatine của dịch nuôi cấy (Shanmugasundaram et al., 2012) *Xác định hoạt tính gelatinase ( Tran và Nagano, 2002) 2.4.1.2. Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn * Đặc điểm hình thái của chủng vi khuẩn lựa chọn * Đặc điểm sinh trưởng của chủng vi khuẩn lựa chọn - Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH môi trường: 2.4.1.3. Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hoá 16S rDNA * Tách chiết ADN tổng số ( Sambrook và Russell, 2001) *Phân loại chủng tuyển chọn dựa trên phân tích trình tự 16S rDNA 2.4.2. Phương pháp tạo chủng tái tổ hợp 2.4.2.1. Thiết kế mồi khuếch đại gen gel E. faecalis MD4 2.4.2.2. Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase 2.4.2.3. Giải trình tự và phân tích gen gelE 2.4.2.4. Tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen gelE * Chuẩn bị tế bào khả biến * Chuyển gen gelE vào vector tách dòng * Biến nạp vào tế bào khả biến E. coli (Sambrook và Russell, 2001). *Tách chiết plasmid *Điện di DNA trên gel agarose 2.4.2.5. Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E. coli
5 2.4.2.6. Phương pháp kiểm tra protein tái tổ hợp *Điện di protein trên gel polyacryalmide SDS – PAGE ( Laemmli, 1970). *Định lượng protein (Bradford, 1976) 2.4.3. Phương pháp nghiên cứu điều kiện biểu hiện rGEL 2.4.3.1. Nuôi cấy E. coli tái tổ hợp 2.4.3.2. Thu nhận GEL từ E. coli tái tổ hợp 2.4.3.3. Ảnh hưởng của các điều kiện biểu hiện: pH, nhiệt độ. IPTG, thời gian thu hồi 2.4.4. Phương pháp thu hồi, tinh sạch và đặc tính của rGEL 2.4.4.1. Thu hồi và tinh sạch rGEL 2.4.4.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt của rGEL 2.4.4.3. Ảnh hưởng của pH và độ bền pH của rGEL 2.4.4.4. Ảnh hưởng của ion kim loại 2.4.4.5. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa 2.4.4.6. Động học của rGEL với cơ chất gelatin 2.4.5. Ứng dụng rGEL thủy phân gelatin da các tra 2.4.5.1. Phương pháp nghiên cứu thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL *Phương pháp xử lý mẫu da cá Tra *Phương pháp trích ly gelatin *Phương pháp khảo sát điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL * Phương pháp xác định mức độ thủy phân * Phương pháp định lượng axit amin trong sản phẩm thủy phân 2.4.5.2. Đánh giá hiệu quả bổ sung chế phẩm axit amin vào thức ăn ương cá Mú chấm đen * Phương pháp bổ sung chế phẩm vào thức ăn công nghiệp: *Phương pháp xác định tăng trưởng của cá Mú thí nghiệm: định kỳ 7 ngày kiểm tra một lần về khối lượng, chiều dài thân cá, từ đó đánh giá tốc độ tăng trưởng trung bình ngày (ADG), tốc độ tăng trưởng đặc trưng (SGR). Cuối đợt thí nghiệm đánh giá hệ số sử dụng thức ăn (FCR). Xác định hệ số phân đàn (CV): Đánh giá tại thời điểm thả cá và thời điểm kết thúc thí nghiệm. CV (%) = Độ lệch chuẩn/ giá trị trung bình x 100. Xác định tỷ lệ sống của cá Mú ương . 2.4.6. Phương pháp thu thập và xử lý số liệu Toàn bộ số liệu được thu thập trong quá trình thí nghiệm và được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học trên phần mềm Excell 2007, SPSS 16.0. Dùng phép kiểm định Duncan, LSD0,05.
6 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. SÀNG LỌC NGUỒN GEN MÃ HÓA GELATINASE 3.1.1. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp gelatinase cao Từ bộ sưu tập giống gồm 216 chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzym thủy phân gelatin phân lập từ các mẫu mẫu cá nước ngọt bị bệnh lở loét, xuất huyết, đốm đỏ, tuột nhớt, tuột vẩy tại các hồ nuôi cá ở Hà Nội tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học – Viện Đại học Mở Hà Nội, chúng tôi tiến hành sàng lọc và tuyển chọn chủng có khả năng sinh gelatinase cao để tìm nguồn gen mã hóa gelatinase tạo chủng tái tổ hợp. Bảng 3.1. Hoạt tính phân giải gelatin của dịch lên men 11 chủng vi khuẩn phân lập phân lập từ các mẫu cá nước ngọt bị bệnh sau 48 giờ nuôi cấy. Đường kính vòng phân STT Ký hiệu chủng Hoạt tính gelatinase (U/ml) giải gelatin (D-d, mm) 1 MD1 20,50 ± 0,01 0,34±0,12 2 MD2 26,51 ± 0,03 0,40±0,10 3 MD3 24,60 ±0,11 0,40±0,16 4 MD4 28,21 ± 0,16 0,64±0,11 5 MD5 23,02 ±0,13 0,43±0,15 6 MD6 21,01 ±0,21 0,38±0,10 7 MD7 25,00 ±0,12 0,41±0,16 8 MD8 25,02 ±0,15 0,39±0,12 9 MD9 22,02 ±0,05 0,30±0,12 10 MD10 25,01 ±0,15 0,33±0,10 11 MD11 23,00 ±0,02 0,31±0,18 Ghi chú: D: Đường kính vòng phân giải (mm), d: Đường kính lỗ thạch (mm) Trong số 11 chủng trên, chủng MD4 cho hoạt tính cao nhất, đạt 0,64±0,11 U/ml (Bảng 3.1) và có khả năng hóa lỏng thạch gelatin 7,5g/L (Hình 3.1) được lựa chọn là chủng cung cấp nguồn gen mã hóa gelatinase cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.2. Đặc điểm sinh học, sinh lý, sinh hóa và định tên của chủng vi khuẩn lựa chọn * Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn Ở nhiệt độ 30oC sau 24 giờ khuẩn lạc vi khuẩn có kích thước không đều, bề mặt bóng, mặt cắt hình lồi nhọn, mép khuẩn lạc dạng rễ hình răng cưa, cấu trúc dạng sợi, bề mặt nhớt, vi khuẩn bắt màu xanh tím khi nhuộm Gram, soi trên kính hiển vi với vật kính x100 thấy hình dạng vi khuẩn là hình cầu hoặc bầu dục, liên kết thành cặp hoặc chuỗi kích thước tế bào từ 0,5 µm đến 0,7µm.
7 a. Khuẩn lạc MD4 trên môi b. Hình ảnh tế bào MD4 dưới c. Nhuộm Gram (x100 lần) trường MPA KHV điện tử quét (x 10.000) Hình 3.3. Hình ảnh khuẩn lạc trên môi trường MPA (a), tế bào MD4 dưới kính hiển vi điện tử quét (b) và nhuộm Gram (c) Chủng MD4 Khả năng đồng hoá nguồn carbon và nitơ và đặc điểm sinh trưởng của chủng MD4 sau 2 ngày nuôi cấy ở 37°C ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Khả năng đồng hoá nguồn carbon và nitơ và đặc điểm sinh trưởng của chủng MD4 sau 2 ngày nuôi cấy ở 37°C. Khả năng Nguồn đường Khả năng sinh Nguồn Nito (1,0%, w/v) sinh trưởng (1,0%, w/v) trưởng L-Asparagin monohydrate - D glucose + L-Histidine monohydrate - Arabinose + L-Phenylalanin + Mannose + L-Leucin - Manitol + L-Tryptophan + N-acetyl glucosamine + L-Arginin + Maltose - L-Isoleucin - Gluconate + L-Valin + Caprate - L-Methionin - Adipate - L-Lysin - Malate + L-Threonin + Citrate + Đối chứng âm (MPA) - Đối chứng âm - Khoảng nhiệt độ sinh trưởng: 20 ÷45°C (nhiệt độ tối ưu: 37°C) Nồng độ muối: 0÷5% pH 4÷10 ( pH thích hợp 7) Khả năng phân giải: Tinh bột + Casein + Gelatin + Ghi chú: (+) Phát triển tốt bằng hoặc tốt hơn đối chứng dương (D-Glucose); (-) Không phát triển hoặc phát triển yếu hơn đối chứng âm (khoáng); (++) Phát triển rất tốt
8 * Phân loại dựa trên xác định trình tự gen mã hoá 16S rDNA - Khuếch đại gen 16S rDNA Hình 3.4. Điện di đồ sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA trên gel agarose 1,0% Giếng M: Thang DNA chuẩn 1kb (Thermo scientific, Mỹ); Giếng 1: Sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S rDNA của chủng MD4 Kết quả khuếch đại gen 16S rDNA của chủng MD4 cho thấy, sản phẩm PCR cho một băng rất rõ nét và duy nhất có kích thước khoảng 1,4kb (Hình 3.4). Như vậy, sản phẩm PCR thu được là đặc hiệu, đáp ứng yêu cầu cho tinh sạch và giải trình tự gen 16S rDNA. - Phân tích trình tự gen 16S rRNA Bảng 3.3. Độ tương đồng trình tự gen 16S rRNA của vi khuẩn MD4 với trình tự gen tương ứng của các chủng được đăng ký trên Genbank (NCBI) Trình tự gene 16S rDNA của chủng vi Mã số truy cập trên Độ tương đồng khuẩn được so sánh GenBank (%) Enterococcus faecalis UFLA WFC616 KY660402.1 99 Enterococcus faecalis NBRC 100480 NR_113901.1 99 Enterococcus faecalis subsp. SJYF 14 KJ174472.1 99 Enterococcus faecalis ATCC 19433 NR_115765.1 99 Enterococcus dispar LMG 13521 NR_114781.2 98 Enterococcus lactis BT159 NR_117562.1 98 Từ cơ sở dữ liệu trên, Cây phát sinh chủng loại được thiết lập trên cơ sở khoảng cách di truyền theo Kimura, bằng việc sử dụng phương pháp Neighbor-joining. Phân tích giá trị Bootstrap của cây phát sinh chủng loại được tính với 1000 mẫu thử (Hình 3.5).
9 Hình 3.5. Cây phát sinh chủng loại dựa trên việc so sánh trình tự gen 16S rRNA của chủng MD4 với các trình tự gen tương ứng của các chủng khác trên GenBank. Giá trị bootstrap (%) thể hiện sự sai khác về mặt di truyền. Kết quả phân tích trình tự 16S rDNA và so sánh với trình tự gene đã công bố trên Genbank bằng công cụ BLAST (NCBI) cho thấy chủng MD4 có trình tự tương đồng cao với chủng Enterococcus faecalis UFLA WFC616 (99%), chủng Enterococcus faecalis NBRC 100480 (99%) (Bảng 3.3 và Hình 3.5). Dựa vào kết quả nghiên cứu về đặc điểm hình thái, sinh lý-sinh hóa và phân tích trình tự gen 16S rDNA, chủng vi khuẩn MD4 được định danh là Enterococcus faecalis MD4. Trình tự gen 16S rRNA của chủng MD4 được đăng ký trên GenBank (NCBI) dưới mã số MG982575.1. 3.2. TẠO CHỦNG TÁI TỔ HỢP 3.2.1. Thiết kế mồi khuếch đại gen gelE mã hóa gelatinase từ chủng E. faecalis MD4 Mồi xuôi TTATATG↓TCGACATGAAGGGAAATAAAATTTTATACATTTTAGG SalI Mồi ngược AATATTA↓AGCTTTTCATTGACCAGAACAGATTCACT HindIII 3.2.2. Nhân dòng gen gelE mã hóa gelatinase Đoạn gen mã hóa gelE của E. faecalis MD4 được khuếch đại bằng PCR từ khuôn DNA bằng cặp mồi EF-F1 và EF-R1. Trên băng 1 xuất hiện một vệt sáng đậm rõ nét khoảng 1,5 kb (Hình 3.6), tương ứng với kích thước mong đợi khi thiết kế mồi khuếch đại gen gelE của E. faecalis MD4. Như vậy, sản phẩm PCR nhận được là đặc hiệu cho quá trình khuếch đại gen gelE của E. faecalis MD4. Kb Hình 3.6. Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen gelE từ DNA của E. faecalis MD4. Giếng L: thang DNA chuẩn; Giếng 1: sản phẩm của PCR khuếch đại gen gelE từ DNA của E. faecalis MD4 Sản phẩm PCR được tinh sạch và xử lý bằng enzyme cắt đầu bằng DNA Blunting Enzym và ghép nối vào vector pJet1.2/Blunt, biến nạp vào E. coli DH5α và điện di kiểm tra kích thước plasmid tái tổ hợp so với plasmid gốc pJet1.2/Blunt (Hình 3.7).
10 Kb Kb Hình 3.7. Điện di đồ kiểm tra plasmid đã Hình 3.8. Điện di đồ sản phẩm cắt plasmid tách mang gen. Giếng 1: thang DNA chuẩn; dòng bằng enzym giới hạn. Giếng M: thang Giếng 2: Plasmid mang gen gelE; Giếng 3: DNA chuẩn; Giếng 1 và 2: plasmid plasmid pJet1.2/Blunt pJet1.2::gelE được cắt đồng thời bởi SalI và HindIII. Kết quả cho thấy plasmid tái tổ hợp có chứa gen gelE (sau đây ký hiệu là pJet1.2:gelE) khi mở vòng có kích thước 4,4 kb, tương ứng với kích thước vector tách dòng pJet1.2 (2,9 kb) và gen gelE (1,5 kb). Khi cắt plasmid tái tổ hợp pJet1.2:gelE bởi hai enzyme giới hạn SalI và HindIII cho hai băng tách biệt gồm: một băng tương ứng với kích thước gen gelE là 1,5kb và một băng 2,9 kb của vector pJet1.2 (Hình 3.8). Các kết quả phân tích cho thấy đã tách dòng thành công gen gelE trong vector tách dòng pJet1.2. 3.2.3. Giải trình tự và phân tích gen gelE Bảng 3.5. Mức độ tương đồng trình tự nucleotit của gen gelE của chủng E. faecalis MD4 với các gen gelE tương ứng cả các vi khuẩn được đăng kí trên GenBank Kb Kb Trình tự gen MD4 M37185.1 D85393.1 EF105504.1 EU862241.3 gelE MD4 100 a M37185.1 99 100 D85393.1 99 99 100 EF105504.1 99 99 100 100 EU862241.3 99 99 99 99 100 Trình tự gen gelE khuếch đại từ DNA của chủng E. faecalis MD4 có tương đồng cao (99%) so với các gen gelE khuếch đại từ mRNA của các chủng E. faecalis khác (Bảng 3.5). Trình tự nucleotide của gen gelE trong nghiên cứu có độ tương đồng gần 99% so với trình
11 tự của gen gelE tương ứng có mã số truy cập M37185.1, D85393.1, EF105504.1, EU862241.3 chỉ có một vài vị trí khác biệt. Trình tự axít amin suy diễn của chủng E. faecalis MD4 có tương đồng cao (99%) so với các gen gelE khuếch đại từ các chủng E. faecalis khác (Hình 3.10). Hình 3.10: Trình tự axit amin suy diễn của gelE của chủng E. faecalis MD4 3.2.4. Thiết kế vector tái tổ hợp cho biểu hiện gen gelE trong E. coli BL21(DE3) Để gắn gen gelE vào vector biểu hiện pET-22b(+) đúng chiều, đúng khung đọc, cả pJet1.2: gelE và pET22b(+) được cắt bằng SalI và HindIII tạo ra gen gelE và pET-22b(+) có hai đầu dính tương ứng. a) Thu gen gelE có hai đầu dính của hai enzym HindIII và SalI Thu vùng agarose chứa vệt DNA mong đợi và tinh sạch thu lấy đoạn gen này bằng kit Invitrogen. Sản phẩm gen gelE sau tinh sạch được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Gen gelE tinh sạch cho một vệt có kích thước 1,5 kb. Như vậy, chúng tôi đã có gen gelE với hai đầu bổ sung được tạo bởi hai enzym HindIII và SalI. b) Tạo 2 đầu dính cho vector pET-22b(+): Plasmid pET-22b(+) cũng được xử lý với hai enzym giới hạn trên. Sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 1%. Kết quả cho thấy vector đã được mở vòng hoàn toàn đảm bảo cho việc gắn gen tạo vector biểu hiện. Sau khi điện di, phần agarose chứa vector pET-22b(+) được thu lại và xử lý qua kit tinh sạch DNA (Invitrogen). Như vậy, chúng tôi đã có sẵn nguyên liệu cho việc tạo vector biểu hiện. c) Gắn gen gelE vào vector pET-22b(+) Dưới tác dụng của T4-ligase, gen gelE được gắn vào vector biểu hiện tạo thành hệ thống biểu hiện hoàn chỉnh. Sau phản ứng ghép nối gen, sản phẩm ghép nối được biến nạp vào tế bào E. coli DH5 để tạo dòng gen. (a) (b) Hình 3.12. Điện di đồ DNA plasmid từ thể biến nạp (a) và plasmid tái tổ hợp được xử lý bằng HindIII và SalI (b). Ghi chú: Giếng 1 (Hình a): pET22b(+) đối chứng, Giếng 2 ÷ 5 (Hình a): pET22b(+) mang đoạn chèn; Giếng 1 (Hình b): Thang DNA chuẩn, Giếng 2
12 (Hình b): pET 22b-gelE được cắt bằng HindIII và SalI. Các plasmid tái tổ hợp đều có kích thước lớn hơn vector pET22b(+) (Hình 3.12a). Sau khi được xử lý với HindIII và SalI, sản phẩm cắt các plasmid tái tổ hợp đều cho hai đoạn gen có kích thước tương đương với pET22b(+) (5,5 kb) và gen gelE (1,5 kb) tương ứng (Hình 3.12b). Plasmid pET22b(+) mang gen gelE được đặt tên là pET22b-gelE. 3.2.5. Tạo chủng E. coli tái tổ hợp mang gen gelE Mẫu cảm ứng bằng IPTG có một vệt protein mới khác biệt so với các mẫu không cảm ứng (Hình 3.13) và có kích thước khoảng 46 kDa, tương đương với kích thước theo tính toán của phân tử protein tái tổ hợp như mong đợi. Hình 3.13. Điện di đồ protein tái tổ hợp trên SDS-PAGE . Ghi chú: Giếng M: Thang protein chuẩn; Giếng 1 và 2: Protein tổng số từ E. coli tái tổ hợp được cảm ứng bởi 0,4 mM IPTG và protein tổng số từ tế bào E. coli tái tổ hợp không được cảm ứng bởi IPTG. Enzym GEL tái tổ hợp tạo ra một vệt rõ nét hơn các vệt protein khác chứng tỏ quá trình biểu hiện được thực hiện tốt. Hoạt tính của chủng tái tổ hợp đạt 2,45 U/ml dịch lên men, cao hơn hoạt tính của chủng gốc 6 lần. 3.3. ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN rGEL 3.3.1. Ảnh hưởng của pH đến biểu hiện rGEL Để lựa chọn được pH thích hợp cho chủng tái tổ hợp sinh trưởng và biểu hiện protein, chủng E. coli tái tổ hợp được nuôi cấy trên nền môi trường LB có các pH thay đổi từ 5÷ 8 với các điều kiện công nghệ được giữ như trên. Mẫu được thu sau 3 giờ cảm ứng, xác định hoạt tính và protein. Hình 3.15. Ảnh hưởng của pH đến biểu Hình 3.16. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hiện gelE tái tổ hợp biểu hiện gelE tái tổ hợp
13 Chủng E. coli BL21[pET22(b)-gelE] biểu hiện gelE thích hợp nhất ở vùng pH trung tính 6,5 ÷ 7 (Hình 3.15). Khoảng pH này cũng phù hợp cho sinh trưởng của E. coli nói chung. 3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến biểu hiện rGEL Trong thí nghiệm này, chủng E.coli tái tổ hợp được nuôi cấy ở 37oC đến khi OD600 đạt 0,5 ÷ 0,8. Sau đó tế bào được cảm ứng bằng IPTG 0,4 mM và tiếp tục được nuôi ở 25, 28, 34 và 37oC trong 16 giờ. Mức độ biểu hiện rGEL ở 25oC, 28oC, 34oC và 37oC đều cho một vệt protein rõ nét trong khoảng 46 kDa và không khác nhau đáng kể. Tuy nhiên, hoạt tính rGEL thu được tại các nhiệt độ này là khác nhau, cụ thể ở nhiệt độ 25oC thì sau 10 giờ hoạt tính GEL đạt cao nhất là 2 U/ml; 28oC thì sau 6 giờ hoạt tính đạt cao nhất là 2,18 U/ml; 34oC đạt 2,53 U/ml tại thời điểm 5 giờ và ở nhiệt độ 37oC đạt 2,89 U/ml ở thời điểm 3 giờ (Hình 3.16) Để kiểm tra khả năng biểu hiện protein ở 37oC, điện di kiểm tra protein hòa tan thu được khi phá tế bào E. coli tái tổ hợp và phần xác tế bào không tan sau khi biểu hiện (Hình 3.17). (a) (b) Hình 3.17 Điện di đồ GEL biểu hiện ở 37oC (a) và 34oC trên gel SDS-PAGE (b). Hình (a) biểu hiện ở 37oC: Giếng M: Thang protein chuẩn, Giếng 1: Protein tan, Giếng 2: Protein không tan từ xác tế bào; Hình (b) biểu hiện ở 34oC: Giếng M: Thang protein chuẩn, Giếng 1: Protein không tan từ xác tế bào, Giếng 2: Protein tan. Theo kết quả trên hình 3.17a, cho thấy băng 2 (protein không tan chạy từ xác tế bào) cũng có một vệt protein đậm và rõ (Hình 3.17a) có khối lượng khoảng 46 kDa tương ứng như trên băng 1 (protein hòa tan thu được khi phá tế bào E. coli tái tổ hợp). Như vậy, ở 37oC tế bào có khả năng biểu hiện protein ngoại lai với hiệu suất cao nhưng một phần protein ngoại không được đóng gói để tiết ra ngoài môi trường mà được giữ bên trong tế bào. Do vậy, nhiệt độ 37oC là không tốt đối với GEL trong quá trình biểu hiện.
14 Tương tự, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra khả năng biểu hiện của GEL ở 34oC (Hình 3.17b). Khi biểu hiện ở 34oC thì đa số protein tái tổ hợp đều ở dạng tan (Giếng 2). 3.3.3. Ảnh hưởng của IPTG đến biểu hiện rGEL Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ chất cảm ứng đến sinh trưởng và biểu hiện GEL Nồng độ IPTG Mật độ quang, Hoạt tính (mM) OD600nm cuối (U/ml) 0 3,82 ± 0,04 0 0,01 3,55 ± 0,11 1,21 ± 0,05 0,02 3,33 ± 0,22 1,75 ± 0,13 0,05 3,21 ± 0,13 2,86 ± 0,09 0,1 3,10 ± 0,12 2,69 ± 0,05 0,2 3,01 ± 0,24 2,29 ± 0,16 0,3 3,06 ± 0,02 2,05 ± 0,14 0,4 3,11 ± 0,42 1,98 ± 0,12 0,5 3,16 ± 0,05 1,85 ± 0,04 Ghi chú: ± sai số giữa các thí nghiệm, số thí nghiệm n=3. Nồng độ IPTG càng cao thì sinh trưởng của chủng càng giảm (Bảng 3.6). Hoạt tính GEL trong mẫu cảm ứng với nồng độ IPTG 0,05 mM là cao nhất, đạt 2,86 U/ml dịch lên men. Với nồng độ IPTG càng cao thì hoạt tính GEL thu được càng giảm, đặc biệt ở nồng độ IPTG 0,5 mM hoạt tính giảm khoảng 1,39 lần so với ở nồng độ IPTG 0,05 mM. 3.3.4. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp gelE tái tổ hợp Hình 3.19. Động thái quá trình lên men sinh tổng hợp gelatinase tái tổ hợp Kết quả nghiên cứu động thái của quá trình lên men cho thấy chủng sinh trưởng nhanh sau 2 giờ lên men và đạt cực đại tại giờ thứ 10. Trong khi đó, GEL bắt đầu được sinh tổng hợp sau khi cảm ứng, tăng dần theo thời gian lên men và đạt cao nhất sau 8,5 giờ (hoạt tính đạt khoảng 2,89 U/ml sau khi sinh trưởng đạt cực đại). Sau thời điểm này, hoạt tính
15 enzym không tăng lên nữa mà giảm dần. Như vậy, thời điểm thu hồi protein tái tổ hợp thích hợp là sau 8,5 giờ lên men. 3.4. THU HỒI, TINH SẠCH VÀ ĐẶC TÍNH CỦA rGEL 3.4.1. Thu hồi và tinh sạch rGEL Bảng 3.7. Hiệu suất tinh sạch của GEL tái tổ hợp Tinh Hoạt độ Protein Hoạt độ Hiệu suất Mẫu sạch (số tổng (U) tổng (mg) riêng (U/mg) thu hồi (%) lần) Dịch chiết enzym thô 72,25 23,24 3,11 1 100 Mẫu sau tinh sạch 60,89 2,78 21,90 7,04 84,27 Hình 3.20 Điện di đồ protein tái tổ hợp trước và sau tinh sạch GEL bằng cột sắc ký ái lực M: Thang protein chuẩn, 1: Mẫu protein tổng trước khi tinh sạch, 2: Sản phẩm protein tinh sạch. Kết quả điện di sản phẩm protein thu được sau quá trình tinh sạch cho thấy, trên băng hai chỉ xuất hiện một vệt protein đậm, có trọng lượng xấp xỉ 46 kDa, tương ứng với trọng lượng enzym tái tổ hợp trong mẫu protein tổng trước khi tinh sạch. Protein tinh sạch có hoạt độ riêng 21,9 U/mg protein, tăng 7,04 lần với ban đầu và hiệu suất thu hồi enzym là 84,27 % (Bảng 3.7). 3.4.2. Đặc tính của rGEL 3.4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và độ bền nhiệt Hình 3.22. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến Hình 3.23. Độ bền nhiệt của rGEL hoạt tính của rGEL
16 Sự biến thiên hoạt tính của rGEL cho thấy, hoạt tính tăng dần theo sự tăng của nhiệt độ từ 20 ÷ 55oC và đạt giá trị cao nhất ở 40oC , giảm nhẹ từ 45 ÷ 55oC và chỉ còn 60% hoạt tính xúc tác tại 55oC. Như vậy, nhiệt độ xúc tác của GEL dao động 37 ÷ 45oC. Từ kết quả thu được ở trên cho thấy hoạt tính gelatinase tái tổ hợp tương đối ổn định trong 2 giờ đầu (giữ được trên 97%), sau đó thời gian ủ càng lâu thì hoạt tính càng giảm. Đến 6 giờ thì khả năng thủy phân gelatin chỉ còn đạt 39,8% so với hoạt tính ban đầu ở mức nhiệt độ 45oC, tiếp đến là 46,9% ở mức nhiệt độ 40oC và cuối cùng là đạt 70,2% ở nhiệt độ 37oC. 3.4.2.2 Ảnh hưởng của pH và độ bền pH Hình 3.24. Ảnh hưởng của pH tới hoạt Hình 3.25. Ảnh hưởng của pH đến độ bền của động xúc tác của GEL GEL tái tổ hợp Kết quả cho thấy, GEL có thể xúc tác trong dải pH kiềm với biên độ khá rộng, từ 7,5 ÷ 11, hoạt động tốt nhất ở pH 7 ÷ 7,5. Sau thời gian ủ là 2 giờ ở nhiệt độ 40oC ở pH 7 và pH7,5 hoạt tính GEL vẫn được duy trì ở mức xấp xỉ 97÷100%, sau đó hoạt tính enzym giảm dần và đến 6 giờ hoạt tính gelatinase còn 75%; 73% so với ban đầu (p>0,05). Đối với pH 8,5 thì hoạt tính chỉ tương đối ổn định trong 1 giờ đầu sau đó hoạt tính giảm dần ở các giờ tiếp theo, đến 6 giờ thì hoạt tính GEL đạt 58,9% so với ban đầu. Mặt khác, ở pH5 thì sau 2 giờ hoạt tính enzym chỉ còn 83,1%, đến 6 giờ chỉ còn lại có 25% hoạt tính GEL. Còn pH7 và pH7,5 hoạt tính GEL duy trì ổn định trong 3 giờ, điều này cung cấp thông tin cơ sở cho thí nghiệm thủy phân gelatin sau này. 3.4.2.3. Ảnh hưởng của ion kim loại Bảng 3.8. Ảnh hưởng của các ion kim loại và hóa chất đến hoạt tính của GEL tái tổ hợp Hoạt tính tương đối (%) STT Ion bổ sung Không bổ sung ion 5 mM 1 Ca2+ 100 115 ± 1,2 2 Fe2+ 100 95 ± 1,5
17 3 Co2+ 100 92 ± 3,0 4 Mn2+ 100 97 ± 2,0 5 Cu2+ 100 104 ± 4,6 6 Mg2+ 100 100 ± 2,5 7 EDTA 100 0,0 ± 5,0 8 β-mercaptoetanol 100 0,0 ± 4,9 Kết quả nghiên trên cho thấy sự có mặt của Ca2+ làm tăng hoạt tính GEL cao nhất, xấp xỉ 15 ± 1,2%, trong khi đó các ion Mg2+, Cu2+ không làm ảnh hưởng mà còn làm tăng nhẹ hoạt tính của GEL, hoạt tính tương đối lần lượt là 100%, 104 ± 4,6%. Trong khi đó các ion như: Fe2+, Co2+, Mn2+ gây ức chế hoạt tính của enzym. EDTA và β-mercaptoetanol thì gây kìm hãm rất mạnh đối với hoạt tính của rGEL, ở hàm lượng 5 mM, cả hai chất này ức chế hoàn toàn hoạt động của enzym. 3.4.2.4. Ảnh hưởng của chất tẩy rửa Một số chất tẩy rửa có hoạt tính bề mặt như Tween 20, Triton X-100, SDS gây ảnh hưởng đến hoạt tính của gelatinase. Tween 20 nồng độ
18 Tốc độ phản ứng Vmax và hằng số Michaelis Km của gelatinase tái tổ hợp được thể hiện trên Hình 3.27. Giá trị Vmax và Km thu được lần lượt là 18,34 (µmol/L. phút) và 3,21 mM. 3.5. ỨNG DỤNG rGEL THỦY PHÂN GELATIN DA CÁ TRA 3.5.1. Kết quả xác định các điều kiện thủy phân gelatin da cá Tra bằng rGEL 3.5.1.1. Khảo sát tỷ lệ nước Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước khảo sát đến hiệu suất thủy phân Tỷ lệ nước khảo sát(%) Hiệu suất thủy phân (%) 0 41,11c 30 76,48a 50 62,37b 70 56,82b 100 51,12b (Ghi chú: Trong cùng một hàng ngang, các giá trị trung bình không cùng mẫu tự thì khác biệt ởmức ý nghĩa 95%) Từ kết quả ở bảng 3.9 cho thấy hiệu suất thủy phân gelatin da cá Tra bằng enzyme gelatinase tái tổ hợp đạt cao nhất với tỷ lệ nước khảo sát là 30% so với các tỷ lệ khác (p0,05). 3.5.1.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân Hình 3.28. Hiệu quả thủy phân gelatin ở các nồng độ rGEL khác nhau Hiệu suất thủy phân tăng chậm khi tăng nồng độ enzyme từ 25 UI lên 50 UI. Tuy nhiên, hiệu suất thủy phân tăng nhanh và đạt cao nhất ở nồng độ 75 UI gelatinase, đạt 76,12%. Khi tăng nồng độ enzyme lên đến 100 UI và 125 UI thì hiệu suất thủy phân tăng không đáng kể, chỉ đạt 75,79% và 76,12%. Kết quả này cho thấy, nồng độ 75 UI là phù hợp để thủy phân 100g cơ chất gelatin da cá Tra, với tỷ lệ nước khảo sát là 30%, đây cũng