Nghiên cứu Y họ
c
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 1 * 2021
Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử
171
TƯƠNG QUAN KIỂU GEN, KIỂU HÌNH TRONG BỆNH ALZHEIMER
Nguyễn Thị Tuyết Lan
1
, Đặng Thị Minh Trang
1
, Đỗ Nông Xuân Mai
1
, Tống Mai Trang
2
,
Trần Công Thắng
3
, Phan Ngọc Minh
1
, Giang Hoa
1
, Đỗ Thị Thanh Thủy
1
, Trương Đình Kiệt
1
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Bệnh Alzheimer (AD) là dạng sa sút trí tuệ (SSTT) phổ biến nhất (chiếm 60%-80%). Theo
WHO, AD là một trong năm nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế giới, là gánh nặng toàn cầu về
sức khỏe cũng như kinh tế xã hội. Hiện nay, các nghiên cứu tìm dấu ấn sinh học AD đang rất được quan tâm,
mục đích để phát hiện sớm bệnh Alzheimer. Tuy nhiên, những gì chúng ta làm được vẫn còn khiêm tốn, đến nay
AD vẫn là bệnh không thể chữa khỏi và rất khó dự phòng một cách hiệu quả. Trong nghiên cứu này, chúng tôi
thực hiện giải trình tự thế hệ mới trên mẫu DNA bộ gen từ máu ngoại vi của bệnh nhân AD Việt Nam để khảo
sát sự tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình. Sự thành công của nghiên cứu sẽ cung cấp phổ biến thể gen liên
quan đến thể khởi phát sớm và muộn của bệnh Alzheimer, tạo tiền đề cho các nghiên cứu mở rộng, hướng đến
mục đích phát hiện sớm để điều trị hiệu quả hơn căn bệnh này.
Mục tiêu: Đánh giá mối quan hệ kiểu gen - kiểu hình của bệnh nhân Alzheimer người Việt Nam bằng kỹ
thuật giải trình tự gen thế hệ mới.
Đối tượng - Phương pháp: Mẫu máu của bệnh nhân AD được thu nhận tại bệnh viện Đại học Y dược
TP Hồ Chí Minh, được tách chiết DNA bằng bộ kit Magjet Whole blood DNA, tạo thư viện và lai-bắt giữ các
phân đoạn DNA của các gen mục tiêu bằng bộ kit New England Biolabs (Mỹ), sau đó giải trình tự bằng hệ thống
giải trình tự thế hệ mới Illumina (Mỹ).
Kết quả: Trong 101 bệnh nhân AD, có 51 (50,5%) trường hợp khởi phát sớm (EOAD) và 50 (49,5%)
trường hợp khởi phát muộn (LOAD), độ tuổi khởi phát trung bình của các bệnh nhân EOAD là 57 tuổi và
LOAD là 73 tuổi. Ở nhóm EOAD, nghiên cứu ghi nhận có mối liên quan giữa đột biến APP/PSEN1 với bệnh
Alzheimer (p=0,03) và giữa độ tuổi khởi phát của nhóm mang đột biến APP/PSEN1 so với các nhóm mang đột
biến APOE (p=0,01). Ở thể LOAD, nhóm mang đồng hợp alen APOE e4 có độ tuổi khởi phát sớm hơn so với
nhóm mang e4 dị hợp alen APOE và nhóm không mang alen APOE e4 (p=0,057).
Kết luận: Kết quả này cho thấy có mối liên hệ giữa những kiểu gen khác nhau và độ tuổi khởi phát ở hai
nhóm bệnh Alzheimer. Đối với nhóm EOAD, sự hiện diện của biến thể trên gen APP/PSEN1 làm tăng độ tuổi
khởi phát của bệnh nhân EOAD. Đối với nhóm LOAD, sự hiện diện của đồng hợp alen APOE e4 trên bệnh nhân
thúc đẩy tiến trình khởi phát của bệnh sớm hơn so với nhóm mang dị hợp hay không mang alen này.
Từ khóa: bệnh Alzheimer (AD), sa sút trí tuệ (SSTT), bệnh Alzheimer khởi phát sớm (EOAD), bệnh
Alzheimer khởi phát muộn (LOAD), biến thể, kỹ thuật giải trình tự gen thế hệ mới (NGS)
1
Viện Di truyền Y học, Thành phố Hồ Chí Minh
2
Khoa Thần kinh, Bệnh viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
3
Bộ môn Thần Kinh, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: ThS. Nguyễn Thị Tuyết Lan ĐT: 0937130391 Email: lan.mgi@suckhoeditruyen.vn
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 1 * 2021
Nghiên cứu Y họ
c
Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử
172
ABSTRACT
INVESTIGATE THE ASSOCIATION BETWEEN GENOTYPE AND PHENOTYPE
OF ALZHEIMER DISEASE
Nguyen Thi Tuyet Lan, Dang Thi Minh Trang, Do Nong Xuan Mai, Tong Mai Trang, Tran Cong
Thang, Phan Ngoc Minh, Giang Hoa, Do Thi Thanh Thuy, Truong Dinh Kiet
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No 1 - 2021: 171-177
Background: Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia, (accounting for 60% - 80%).
According to WHO, AD is one of the top five causes of death worldwide. It is also a global burden on health as
well as on socioeconomic status. Currently, biomarkers of AD researches are highly interested, aiming for AD
early detection. However, what we have done is still modest, and AD is still incurable and difficult to prevent. In
this study, we perform new generation sequencing on genomic DNA samples from the blood of Vietnamese AD
patients to investigate the association between genotype and phenotype. The success of the study will provide the
proliferation of genotypes related to the early-onset and late-onset Alzheimer's disease, paving the way for
extensive research, aiming for early detection for more effective treatment of radicals this disease.
Objectives: Evaluate the association between genotype - phenotype of Alzheimer's patients in Vietnam
using new-generation sequencing (NGS).
Method: Blood from Alzheimer patients was collected at University Medical Center HCMC and used to
extract genomic DNA with Magjet Whole blood DNA kit, then preparing library and hybridization-capturing
DNA fragments of targeted genes using New England Biolabs kit (USA), loading for sequencing in Illumina
next-generation sequencing system.
Results: In 101 Alzheimer patients, there were 51 (50.5%) early-onset cases (EOAD) and 50 (49.5%) late-
onset cases (LOAD), the mean age of EOAD patients was 57 years old, and LOAD patients was 73 years old. In
the EOAD group, the study recorded the association between APP/PSEN1 mutations and Alzheimer’s disease
(p=0.03) and between the age of onset of the APP/PSEN1 group with the APOE groups (p = 0.01). Besides, in the
LOAD, the group having homozygote APOE e4 alleles had an earlier onset age than those with heterozygous
APOE e4 allele and non-APOE e4 allele patients (p=0.057).
Conclusion: These results showed a relationship between different genotypes and onset age in the two groups
of Alzheimer's disease. In the EOAD group, the presence of APP/PSEN1 variants increased the onset age of
EOAD patients. In the LOAD group, the attendance of the homozygote APOE e4 alleles stimulated the earlier
onset age of the disease than the heterozygous or non-allele group.
Key words: Alzheimer disease (AD), dementia, Early-Onset Alzheimer Disease (EOAD), late-onset
Alzheimer disease (LOAD), genetic variants, next-generation sequencing (NGS)
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Alzheimer (AD) gây ra những thay đổi
bất thường trong não, chủ yếu ảnh hưởng đến trí
nhớ, giảm nhận thức, rối loạn thời gian và không
gian, và các khả năng trí tuệ khác. Theo thống kê
tại Mỹ năm 2019, cứ mỗi 65 giây lại có thêm một
trường hợp bệnh mới được phát hiện và cứ 3
người già tử vong sẽ có 1 người được chẩn đoán
sa sút trí tuệ. Năm 2019, số người mắc
Alzheimer tại Mỹ khoảng 5,8 triệu người và đến
năm 2050 con số này sẽ tăng lên 14 triệu. Chi phí
chăm sóc cho bệnh nhân Alzheimer trên toàn thế
giới năm 2019 ước tính là 290 tỉ đô la Mỹ, dự báo
nếu bệnh không được ngăn chặn và kiểm soát,
đến năm 2050 con số này sẽ tăng lên 1,1 nghìn tỉ
đô la
(1)
.
Nghiên cứu Y họ
c
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 1 * 2021
Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử
173
Dựa trên độ tuổi khởi phát, bệnh Alzheimer
được chia thành hai loại, khởi phát sớm (EOAD)
trước 65 tuổi và khởi phát muộn (LOAD) sau 65
tuổi. Ở Việt Nam, nhiều nghiên cứu về AD cũng
đã được thực hiện nhưng còn chưa thực sự quan
tâm đến tính chất riêng biệt của hai nhóm khởi
phát này
(2-4)
. Hiện nay, nghiên cứu về gen của các
bệnh nhân Alzheimer đang là mối quan tâm
hàng đầu nhờ sự phát triển của kỹ thuật giải
trình tự thế hệ mới (Next-generation sequencing
– NGS), cho phép phân tích đồng thời nhiều gen
cùng lúc.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thực hiện
giải trình tự thế hệ mới DNA bộ gen từ mẫu
máu ngoại vi của bệnh nhân Alzheimer để khảo
sát sự tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình
bệnh Alzheimer ở Việt Nam. Sự thành công của
nghiên cứu sẽ cung cấp phổ biến thể gen liên
quan đến thể AD khởi phát sớm và muộn, tạo
tiền đề cho các nghiên cứu mở rộng, hướng đến
mục đích phát hiện sớm để điều trị hiệu quả hơn
căn bệnh này.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu máu ngoại biên của các bệnh nhân
được chẩn đoán mắc bệnh Alzheimer theo tiêu
chuẩn chẩn đoán rối loạn thần kinh nhận thức
DSM- 5 được thu nhận tại Bệnh viện Đại học Y
Dược TP. Hồ Chí Minh từ tháng 05/2019 tới
tháng 04/2020.
Tiêu chuẩn chọn mẫu
Bệnh nhân được chẩn đoán xác định mắc
Alzheimer theo tiêu chuẩn DSM-5; đồng ý tham
gia nghiên cứu; không truyền máu trong vòng 3
tháng trước khi được thu nhận mẫu máu cho
nghiên cứu; có thông tin lâm sàng, bệnh mãn
tính và tiền sử gia đình, kết quả chụp MRI.
Tiêu chuẩn loại trừ
Bệnh nhân (BN) không đồng ý tham gia
nghiên cứu (NC).
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu cắt ngang.
Cỡ mẫu
Quá trình nghiên cứu thu nhận được 101
mẫu máu của bệnh nhân Alzheimer.
Các biến số chính
Độ tuổi khởi phát và các nhóm đột biến trên
gen APP/PSENs và APOE (e4/e4, e4/e_, e_/e_)
Tách chiết DNA từ mẫu máu: DNA mẫu
máu thu nhận được ly trích bằng bộ kit Magjet
Whole blood DNA (Thermo Scientific, Đức) và
được phân chia vào tube, lưu trữ ở -20
0
C cho tới
khi thực hiện giải trình tự.
Chuẩn bị thư viện và làm giàu phân mảnh
DNA: DNA sau khi tách chiết được sử dụng để
tạo thư viện (phân mảnh DNA, chỉnh sửa đầu
mút, gắn adaptor, index và PCR) bằng bộ kit
Ultra II FS library preparation (New Englands
Biolab, Mỹ) và NEBnext Multiplex Oligos Dual
(NEBnext). Qui trình thực hiện theo hướng dẫn
của bộ kit. Sản phẩm phải đạt hàm lượng ít nhất
là 500 ng để đảm bảo đủ lượng DNA cho bước
tiếp theo.
Lai và bắt giữ gen mục tiêu: Sản phẩm PCR
từ bước tạo thư viện tiếp tục được lai với hỗn
hợp mẫu dò đã được gắn biotin đặc hiệu cho các
gen mục tiêu. Mẫu dò được thiết kế dựa trên
trình tự mRNA của các gen mục tiêu và tổng
hợp bởi IDTDNA (Mỹ). Sau đó, thông qua tương
tác streptavidin-biotin, sử dụng hạt từ
Dynabeads MyOne Streptavidin T1
(ThermoFisher) để bắt giữ phân mảnh DNA của
các gen mục tiêu. Phản ứng lai sử dụng hóa chất
và thực hiện theo huớng dẫn của bộ kit xGen
library hybridization (IDTDNA, Mỹ). DNA sau
khi được bắt giữ sẽ được nhân bản lần 2 bằng
PCR để đạt nồng độ cần thiết cho giải trình tự
thế hệ mới là 10 nM.
Giải trình tự trên hệ thống giải trình tự thế
hệ mới NextSeq (Ilumina, Mỹ): Thư viện đạt
chuẩn nồng độ trên 10nM được biến tính và giải
trình tự bằng kit Nextseq 500/550 High Output
trên hệ thống NextSeq 550 (Illumina, Mỹ).
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 1 * 2021
Nghiên cứu Y họ
c
Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử
174
Phân tích kết quả giải trình tự: Dữ liệu giải
trình tự được sao lưu và gửi lên máy chủ để
phân tích kết quả. Kết quả giải trình tự thế hệ
mới đạt được là hàng triệu cặp trình tự DNA có
kích thước 75 nucleotit. Từng trình tự DNA sau
đó được sắp xếp lên bộ gen người chuẩn của
National Center of Biotechnology Information
(NCBI) để xác định vị trí của trình tự này trên bộ
gen người
(5)
. Vị trí của mỗi trình tự trong cặp
trình tự cho phép xác định biến đổi xảy ra trên
vùng gen mục tiêu.
Phần mềm phân tích được xây dựng dựa
trên trình tự tại từng vị trí nucleotit để xác định
các biến đổi di truyền xảy ra. Toàn bộ phần mềm
được viết dựa trên phương pháp phân tích tối
ưu hoá bởi Viện nghiên cứu Broad thuộc Đại học
Harvard – Mỹ
(6)
. Kết quả phân tích ghi nhận
những biến thể di truyền trong các vùng gen
mục tiêu.
Phân loại các biến đổi di truyền: biến thể
phát hiện được phân loại làm 5 nhóm đột biến:
(1) lành tính (benign),
(2) gần giống lành tính (likely benign),
(3) gây bệnh (pathogenic),
(4) gần giống gây bệnh (likely pathogenic) và
(5) không rõ chức năng (variant of uncertain
significance - VUS).
Trong đó, nhóm (1) và (2) là những biến thể
không làm gia tăng nguy cơ mắc bệnh AD,
nhóm (3) và (4) lại làm tăng nguy cơ mắc AD thể
khởi phát muộn. Nhóm (5) là những biến thể
chưa có bằng chứng khoa học đầy đủ trong việc
xác định vai trò của biến thể liên quan đến nguy
cơ gây bệnh.
Sự phân loại đột biến này dựa trên cơ sở dữ
liệu thông tin lâm sàng về biến thể của Trung
tâm Quốc gia về Thông tin Công nghệ Sinh học
Mỹ (Clinvar database, NCBI, Mỹ) và cơ sở dữ
liệu đột biến liên quan bệnh Alzheimer
(www.alzforum.org).
Xử lý số liệu
Số liệu được và xử lý bằng phần mềm Stata®
phiên bản 13.0 (StataCorp Inc., Texas, Hoa Kỳ).
Thống kê mô tả: tần số, tỉ lệ %, trung bình ±
độ lệch chuẩn, khoảng tin cậy.
Thống kê phân tích: phép kiểm Chi bình
phương, phép kiểm định chính xác Fisher’s.
Sự khác biệt được xem có ý nghĩa thống kê
khi p <0,05 với độ tin cậy 95%.
KẾT QUẢ
Mô tả đặc điểm của nhóm bệnh nhân
Alzheimer trong nghiên cứu
Trong 101 trường hợp bệnh nhân AD tham
gia nghiên cứu có 51 trường hợp khởi phát sớm
(chiếm tỉ lệ 50,5%) và 50 trường hợp khởi phát
muộn (chiếm tỉ lệ 49,5%). Thông tin lâm sàng
của 2 nhóm này được tóm tắt trong Bảng 1.
Bảng 1: Thông tin lâm sàng của 101 bệnh nhân AD
Đặc tính
Nhóm khở
i phát
sớm (EOAD)
n = 51
Nhóm khở
i phát
muộn (LOAD)
n = 50
Tuổi khởi phát trung
bình
57,39 ± 4,52
(56,11-58,66)
73,12 ± 6,17
(71.37 - 74.87)
Giới tính
Nam 19 (37,3%) 16 (32,0%)
Nữ 32 (62,7%) 34 (68,00%)
Tiền sử gia đình có người sa sút trí tuệ
Có 20 (39,2%) 18 (36,0%)
Không 31 (60,8%) 32 (64,0%)
Các bệnh thường gặp
trong từng nhóm khởi
phát
21 (41,18%) 33 (66,0%)
Cao huyết áp 6 (28,57%) 2 (6,06%)
Đái tháo đường 2 (9,52%) 5 (15.15%)
Tim mạch 1 (4,76%) 3 (9.09%)
Bệnh lý khác 5 (23,81%) 4 (12.12%)
Nhiều bệnh nền (≥2
bệnh) 7 (33,33%) 19 (57.58%)
Mối liên hệ giữa kiểu gen và kiểu hình của
bệnh nhân Alzheimer Việt Nam
Để tìm hiểu mối liên hệ giữa kiểu gen và
kiểu hình của bệnh nhân Alzheimer Việt Nam,
nghiên cứu tiến hành phân tích tỉ lệ đột biến
trong từng nhóm: EOAD (n=51), LOAD (n=50)
và nhóm đối chứng người khoẻ mạnh (n=28) (dữ
liệu từ đề tài của tác giả Giang Hoa [8]). Kết quả
thể hiện ở biểu đồ 1 ghi nhận chỉ tìm thấy các
đột biến trên 2 gen APP/PSEN1 ở nhóm bệnh
nhân EOAD (11,7%) và không có trường hợp
Nghiên cứu Y họ
c
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 1 * 2021
Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử
175
nào trong nhóm LOAD và nhóm chứng mang
đột biến ở 2 gen trên (p=0,03, Fisher exact test).
Tỉ lệ mang alen APOE e4 ở các nhóm bệnh
EOAD và LOAD luôn cao hơn nhóm đối chứng,
đặc biệt ở nhóm APOE e4 đồng hợp, LOAD có
sự khác biệt so với nhóm đối chứng (p=0,02,
Fisher exact test). Ngoài ra, kết quả phân tích
không ghi nhận sự khác biệt có ý nghĩa thống kê
giữa nhóm EOAD và LOAD ở các nhóm mang
alen APOE e4 đồng hợp, dị hợp và không mang
alen APOE e4 (Hình 1).
Hình 1: Tỉ lệ đột biến gen trong nhóm EOAD,
LOAD và đối chứng
Mối liên hệ giữa kiểu gen APP/PSEN1 và kiểu
hình của bệnh nhân Alzheimer khởi phát sớm
Để tìm mối liên hệ giữa kiểu gen
APP/PSEN1 và kiểu hình của bệnh nhân
Alzheimer khởi phát sớm, biểu đồ survival plot
được khảo sát trên bốn nhóm bệnh nhân EOAD:
nhóm mang đột biến APP/PSEN1, nhóm mang
đột biến đồng hợp APOE e4, nhóm mang đột
biến dị hợp APOE e4 và nhóm không mang đột
biến APOE e4 (Bảng 2).
Kết quả cho thấy nhóm bệnh nhân EOAD
mang đột biến APP/PSEN1 có độ tuổi khởi phát
sớm hơn rất nhiều so với 3 nhóm còn lại (p=0,01)
(Hình 2).
Hình 2: Sự tương quan kiểu gen – độ tuổi khởi phát
trên bệnh nhân EOAD
Bảng 2: Bảng so sánh số bệnh nhân mang đột biến theo độ tuổi khởi phát trong nhóm EOAD (các nhóm đột biến
bao gồm: APP/PSEN1, APOE e_/e_, APOE e4/e_, APOE e4/e4)
Số ca trong nhóm
mang đột biến
Độ tuổi khởi phát
39 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64
APP/PSEN1 1 1 0 2 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0
APOE e_/e_ 0 2 2 1 2 2 1 4 2 4 1 1 5 0 2
APOE e4/e_ 0 0 0 0 1 1 0 1 1 0 1 0 2 1 0
APOE e4/e4 0 0 0 0 0 1 0 1 1 1 2 0 1 1 0
Mối liên hệ giữa kiểu gen APOE và kiểu hình
của bệnh nhân Alzheimer khởi phát muộn
Nghiên cứu ghi nhận được tuổi khởi phát
trung bình của nhóm bệnh nhân Alzheimer khởi
phát muộn có mang APOE e4 đồng hợp là 69
tuổi, nhóm mang APOE e4 dị hợp là 73 tuổi và
nhóm không mang APOE e4 là 76 tuổi. Số bệnh
nhân của từng nhóm đột biến theo độ tuổi khởi
phát được thể hiện trong Bảng 3.