ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
---------------------------------
NGUYỄN VĂN TUÂN
TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC
THÁI NGUYÊN- 2009
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
---------------------------------
NGUYỄN VĂN TUÂN
TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60. 42. 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. Quyền Đình Thi
Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học-
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
THÁI NGUYÊN - 2009
LỜI CẢM ƠN!
Trƣớc hết tôi xin gửi lời cảm Sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi, Trƣởng
phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng nghiên cứu,
hƣớng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hoá chất cũng
nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học
Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình
làm luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học, Khoa Sau đại học, trƣờng
Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình
giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hoá- Sinh học, Ban chủ nhiệm
khoa Khoa học Cơ bản, Trƣờng đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên đã
tạo điều kiện cho tôi đi học.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình
và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Thái Nguyên tháng 9 năm 2009
Học viên
Nguyễn Văn Tuân
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
CÁC CHỮ VIẾT TẮT
APS Ammonium persulphate
BSA Bovine serum albumin
CMC Carboxyl methyl cellulose
cs Cộng sự
DNA Deoxyribonucleic acid
DEAE Diethylaminoethyl
ĐC Đối chứng
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
IU International unit
kb Kilo base
kDa Kilo Dalton
LB Luria and Bertani
M Marker
Nxb Nhà xuất bản
OD Optical density
PCR Polymerase chain reaction
rRNA Ribosome ribonucleic acid
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis
TBE Tris base-Boric acid-EDTA
TE Tris-EDTA
v/v Volume/volume
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
w/v Weight/volume
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1
KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE ............ 3
1.2
NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE .................. 4
1.2.1 Nguồn gốc ............................................................................................. 4
1.2.2 Phân loại ................................................................................................ 6
1.3
CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE .......................................... 7
1.3.1 Cấu trúc bậc một .................................................................................... 7
1.3.2 Cấu trúc không gian ............................................................................... 9
1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất ......................... 9
1.4
CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ........................... 11
1.5
ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................... 12
1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm ............................................................. 12
1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc ......................................... 13
1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ...................................... 15
1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy ....................................... 15
1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa .............................................. 16
1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh .................... 16
ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG
1.6
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE ....................................................... 17
1.7
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE ...................... 20
1.8
MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM ...................... 22
CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ........................................ 25
2.1
NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT ............................................................... 25
2.1.1 Chủng nấm .......................................................................................... 25
2.1.2 Thiết bị thí nghiệm .............................................................................. 25
2.1.3 Hóa chất .............................................................................................. 26
2.1.4 Môi trƣờng .......................................................................................... 26
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.1.5 Dung dịch và đệm ................................................................................ 27
2.2
PHƢƠNG PHÁP ........................................................................................... 28
2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật ............................................................................. 28
2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase ........................................................ 28
2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase ................................................................................................ 30
2.2.4 Tinh sạch enzyme ................................................................................ 32
2.2.5 Điện di SDS-PAGE ............................................................................. 33
2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase ....................................... 34
2.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số ..................................................... 35
2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử ...................................................... 36
2.2.9 Xử lý số liệu ........................................................................................ 41
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 42
TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI
3.1
SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO ........................................................ 42
3.1.1 Tuyển chọn .......................................................................................... 42
3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA .............. 43
3.2
TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE .... 45
3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian ......................... 45
3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy ................................................................................ 47
3.2.3 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng ............................................ 48
3.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon ...................... 50
3.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen ................. 52
3.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu .......................................................... 54
3.3
TINH SẠCH ENDOGLUCANASE ............................................................ 55
3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 ................................ 55
3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE ........................................ 56
3.4
NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE ................. 57
3.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất .......................................................... 57
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu ..................................................................... 58
3.4.3 pH phản ứng tối ƣu .............................................................................. 60
3.4.4 Độ bền nhiệt độ ................................................................................... 61
3.4.5 Độ bền pH ........................................................................................... 63
3.4.6 Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ ......................................................... 64
3.4.7 Ảnh hƣởng của ion kim loại................................................................. 65
3.4.8 Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa ...................................................... 67
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................. 69
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 71
PHỤ LỤC ............................................................................................................. 79
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ................................. 25
Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm ..................... 26
Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm ......................... 27
Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein ............................................... 33
Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori ............................... 43
Bảng
3.2. Trình
tự
nucleotide
đoạn
gene
28S
rRNA
chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 79
Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian .......................... 79
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy .......................................................... 80
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng .................................................... 80
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon ................................................................ 50
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô ............................................................ 80
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen ............................................................. 52
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate .......................................... 81
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu ................................ 81
Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 ....... 81
Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE ............ 82
Bảng 3.13. Tóm
tắt quá
trình
tinh
sạch endoglucanase
từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 57
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase ............. 82
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .......... 82
Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase .... 83
Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase ..................................................... 83
Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase ............................................................. 84
Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase ...................................... 85
Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase............ 86
Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại ................................................................ 66
Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase ........ 86
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase ........................ 3
Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số
chủng vi sinh vật .................................................................................................... 8
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B)
của Cel12A từ H. grisea ......................................................................................... 9
Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea ............................. 10
Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các
enzyme thuộc phức hệ cellulase ............................................................................. 11
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose............................................................... 30
Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 . 33
Hình 2.3. Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn ........................................ 36
Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu ............. 42
Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA
tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng
XbaI và XhoI (C). ................................................................................................. 44
Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099 ..................................... 45
Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của chủng
A. awamori VTCC-F-099 ..................................................................................... 46
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 48
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase
của chủng A. awamori VTCC-F-099 .................................................................... 49
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 51
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 .............................................. 53
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 ............................................. 54
Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase
từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 ............................... 56
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm
tinh sạch endoglucanase
trên gel
polyacrylamide....... ............................................................................................... 57
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 58
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 60
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 61
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 62
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH
tới độ bền endoglucanase
từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 ...................................................................................... 63
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH
tới độ bền endoglucanase
từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 theo thời gian ................................................................ 64
Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 65
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099. ..................................................................................... 68
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1 MỞ ĐẦU
Cellulose là một thành phần quan trọng cấu tạo nên lớp thành tế bào
thực vật. Đó là một loại polysaccharide có cấu trúc phức tạp. Việc phân hủy
cellulose bằng các tác nhân lý hóa gặp nhiều khó khăn, làm ảnh hƣởng đến
tốc độ của nhiều quá trình sản xuất công nghiệp.
Endo-β-1,4-glucanase (3.2.1.4) là một trong ba loại enzyme thuộc hệ
enzyme thủy phân cellulose (cellulase). Enzyme này tham gia phân cắt
ngẫu nhiên các liên kết β-1,4 glucoside từ bên trong các phân tử cellulose và
một số loại polysaccharide tƣơng tự khác tạo thành các oligosaccharide.
Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc sản xuất bởi rất nhiều loại vi sinh vật
nhƣ vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn có ở
thực vật, động vật nguyên sinh và một số loài động vật không xƣơng sống
khác. Các enzyme có nguồn gốc khác nhau sẽ có cấu trúc khác nhau. Điều
này dẫn tới sự khác nhau về hoạt tính xúc tác và điều kiện phản ứng tối ƣu
của các enzyme.
Hiện nay, việc sử dụng các enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase
trong một số ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp
chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giặt, sản xuất dung môi hữu
cơ và xử lý môi trƣờng là rất quan trọng, mang lại nhiều giá trị to lớn.
Tuy nhiên, những enzyme và chế phẩm có liên quan đƣợc sử dụng
trong các ngành công nghiệp ở Việt Nam và một số nƣớc hiện nay chủ yếu
đƣợc nhập khẩu từ nƣớc ngoài với giá thành cao. Vì thế, việc nghiên cứu, sản
xuất ra các chế phẩm enzyme có nguồn gốc tự nhiên đang là một đòi hỏi cấp
thiết đối với nhiều quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Nƣớc ta là
một nƣớc sản xuất nông nghiệp nên nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất các
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1
enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase là rất phong phú. Xuất phát từ những lý do
trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề
tài: “Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4-
glucanase” với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori
sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao và tìm môi trƣờng nuôi cấy thích hợp
để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch đƣợc endo-β-1,4-
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó.
2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết
-1,4-O-glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tƣơng tự khác.
Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và đƣợc xếp thành
3 nhóm cơ bản: endo-β-1,4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase)
(EC 3.2.1.4), exo-β-1,4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và
β-glucosidase hay β-D-glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21) [30], [39].
Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và
nhờ có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất đƣợc
thủy phân hoàn toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.
Endo-β-1,4-glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng
thủy phân các liên kết β-1,4 glucoside ở bên trong các phân tử cellulose và
một số cơ chất tƣơng tự khác thành các sản phẩm đơn giản hơn (các
oligosaccharide).
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
3
Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase
2.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE
2.2.1 Nguồn gốc
Endo-β-1,4-glucanase có thể đƣợc tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác
nhau trong tự nhiên, trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong
tự nhiên có rất nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm
men có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase.
Nấm mốc là một trong những đối tƣợng vi sinh vật có khả năng
sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhất. Nhiều chủng nấm mốc thuộc
các chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Phanerochaete đã đƣợc
nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ:
Aspergillus niger [25], [26], A. flavus, A. fumigatus [27] A. terreus [29]
Trichoderma reesei [53], Penicillium persicinum, P. brasilianum [33],
Penicillium sp. [10], Phanerochaete chrysosporium [34].
Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng đƣợc xem là một trong những đối
tƣợng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase khá phong phú. Nhiều
loài vi khuẩn hiếu khí đã đƣợc nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ Acidothemus cellulobuticus [22], Bacillus
pumilis [32], Cellulomonas flavigena, C. udai [20], [21], Pseudomonas
fluoressens [42]. Không chỉ có các vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn
kỵ khí cũng có khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ
Clostridium [57].
Nhiều chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có
khả năng sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase mạnh nhƣ: Actinomyces griseus
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
4
[13], Streptomyces reticuli [61].
Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase còn đƣợc sinh tổng hợp ở thực vật
Arabidopsis [23], ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xƣơng
sống khác nhƣ mối [62], ở động vật thân mềm nhƣ Mytilus edulis [63].
Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật đƣợc xem là nguồn
cung cấp enzyme với nhiều ƣu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vƣợt xa
so với enzyme có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng đƣợc
sử dụng rộng rãi trong quá trình sản xuất các chế phẩm enzyme.
Trƣớc hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme
với số lƣợng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con ngƣời chủ động tạo
ra đƣợc. Chu kỳ sinh trƣởng của vi sinh vật ngắn (từ 16-100 giờ). Vi sinh vật
sinh trƣởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lƣợng lại nhỏ,
kích thƣớc bé, nhƣng tỷ lệ enzyme trong tế bào tƣơng đối lớn nên quy trình
sản xuất chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa,
enzyme từ vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vƣợt xa các sinh vật khác. Đối
với một số trƣờng hợp có thể dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn
enzyme.
Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trƣờng, thành phần
dinh dƣỡng nuôi chúng cũng nhƣ một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó
có thể thay đổi những điều kiện nuôi cấy để chọn những chủng cho
hàm lƣợng enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao. Có thể nói rằng, với
vi sinh vật, ngƣời ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn trên
các đối tƣợng khác để tăng lƣợng enzyme đƣợc tổng hợp hoặc tổng hợp
định hƣớng enzyme. Tuy vậy, trong quá trình chọn nguồn nguyên liệu từ
vi sinh vật, cần lƣu ý một số vi sinh vật có khả năng sinh độc tố để có
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
5
biện pháp xử lý thích hợp.
2.2.2 Phân loại
Theo Ủy ban danh pháp của Hiệp hội Hóa sinh và Sinh học phân tử
Quốc tế, cellulase thuộc lớp 3 (hydrolase): các enzyme xúc tác phản ứng
thủy phân, tổ 2 (glycosidase): thủy phân các liên kết glycoside, nhóm 1:
thủy phân liên kết O- và S-glycoside (International Union of Biochemistry
and Molecular Biology, 1992; http://afmb.cnrs-mrs.fr/ pedro/CAZY/db.html).
Cellulase là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau. Tùy theo
quan điểm của từng tác giả mà các enzyme thuộc phức hệ cellulase đƣợc xếp
thành các nhóm khác nhau. Trƣớc đây, cellulase đƣợc chia làm hai nhóm:
nhóm enzyme C1 và nhóm enzyme Cx. Các enzyme C1 có khả năng thủy phân
sợi cellulose tự nhiên, có tính đặc hiệu không rõ ràng. Các enzyme Cx đƣợc
chia thành hai loại: exo -1,4-glucanase (3.2.1.21) xúc tác cho phản ứng cắt
đứt gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose; endo -1,4-glucanase
(3.2.1.4) hoạt động tùy tiện hơn, xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết
bên trong phân tử cellulose [7].
Hiện nay, cellulase đƣợc chia làm ba dạng: dạng 1 là endoglucanase
hoặc 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay carboxylmethylcellulase
(CMCase) (EC 3.2.1.4), dạng 2 là exoglucanase bao gồm 1,4--D-glucan (EC 3.2.1.74) và glucanohydrolase cellodextrinase) (còn gọi là
1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase) (EC 3.2.1.91), dạng 3 là
-glucosidase hoặc -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase
xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết ở bên trong phân tử cellulose.
Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử
cellulose. -glucosidase thủy phân các phân tử cellodextrin và cellobiose
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6
thành glucose [30], [39], [45].
Các cellulase có nguồn gốc khác nhau đƣợc sắp xếp thành các họ.
Trƣớc đây, dựa vào cấu trúc bậc một của phân tử protein enzyme, cellulase
đƣợc chia làm 6 họ: A, B, C, D, E và F [35]. Sau đó, cellulase đƣợc chia
thành 9 họ: A, B, C, D, E, F, G, H và I dựa vào cấu trúc của tâm xúc tác [31].
Hiện nay, các cellulase đƣợc sắp xếp trong 12 họ: 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 44, 45,
48, 61 và 74 [45].
2.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE
2.3.1 Cấu trúc bậc một
Endoglucanase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần cấu tạo và
cấu trúc khác nhau. Sự khác nhau đó thể hiện trƣớc hết ở sự đa dạng về khối
lƣợng phân tử, thành phần và trật tự sắp xếp của các amino acid trên chuỗi
polypeptide. Chủng A. oryzae KBN616 có khả năng sinh tổng hợp hai loại
endoglucanase là Cel A và Cel B. Phân tử protein Cel A gồm 239 amino acid,
trọng lƣợng phân tử 31 kDa, đƣợc xếp vào họ cellulase H. Trong khi đó,
Cel B đƣợc xếp vào họ cellulase C với chiều dài 416 amino acid và
khối lƣợng phân tử 53 kDa [43]. Phân tử endoglucanase từ A. aculeatus
bao gồm 410 amino acid với khối lƣợng phân tử khoảng 43,7 kDa [59]. Các
endoglucanase từ chủng A. niger Z10 có khối lƣợng phân tử 83 kDa và
50 kDa [25], từ A. terreus là 25 kDa [29], từ Trichoderma reesei là 48 kDa và
55 kDa [40], [47], từ Bacillus sp. D04 có khối lƣợng 35 kDa [56].
Sandgren và cs (2003) đã có những nghiên cứu chi tiết về cấu trúc
Cel12A thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase từ nấm chịu nhiệt
Humicola grisea. Cel12A của H. grisea là một chuỗi polypeptide gồm 224
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
7
amino acid cấu tạo nên các chuỗi , và các vùng nối (Hình 1.2) [55].
Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
8
Cel12A từ một số chủng vi sinh vật [55].
2.3.2 Cấu trúc không gian
Sự khác nhau về cấu trúc của các enzyme còn thể hiện ở sự sắp xếp
trong không gian các chuỗi polypeptide, các trung tâm xúc tác và các vùng
liên kết cơ chất. Chính nhờ sự khác nhau về cấu trúc không gian của
các protein enzyme dẫn tới sự khác nhau về các tính chất hóa lý của chúng.
Phân tử Cel12A của H. grisea cấu tạo bởi 1 chuỗi , 2 chuỗi (A và
B). Chuỗi -A đƣợc cấu tạo bởi 6 dải xoắn (A1-A6), chuỗi -B đƣợc cấu tạo
bởi 9 dải xoắn (B1-B9). Các dải xoắn đƣợc nối với nhau bởi các vùng nối,
có 4 vùng nối lớn 29-32, 40-47, 92-96, và 165-169 nối tƣơng ứng các
dải xoắn : B2-A2, A2-A3, A5-B5 và A6-B7 (Hình 1.3A) [55].
2.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất
Trung tâm xúc tác của Cel12A từ H. grisea gồm 2 amino acid là
glutamic acid E-120 và E-205 (Hình 1.3B), còn ở Cel12A từ Trichoderma
reesei là E-116 và E-200 [55].
Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
9
(B) của Cel12A từ H. grisea [55]
Vai trò liên kết cơ chất khi tham gia xúc tác thủy phân cellulose của các
cellulase đƣợc thực hiện nhờ các vùng liên kết đặc hiệu cellulose bind domain
(CBD). Các CBD có thể nằm trong trung tâm hoạt động của enzyme hoặc
không. Tùy thuộc vào từng loại enzyme mà vùng liên kết này có cấu tạo
hóa học và cấu trúc không gian khác nhau. Cel12A của H. grisea có 3 vùng
liên kết với sự tham gia của các amino acid, trong đó cystein (C175, C206,
C216) đóng vai trò trung tâm. CBD1 với C175 làm trung tâm nằm trên
dải xoắn -A6 liên kết yếu với các amino acid T85, I123, A144, F173, I177,
và F180 bằng tƣơng tác Van der Walls. Liên kết giữa các amino acid trong
CBD1 có kích thƣớc 3,5 đến 4,1 Å (Hình 1.4A). CBD2 với C206 làm
trung tâm nằm trên dải xoắn -B4 liên kết với các amino acid Q34, W52,
W54, S63, P65, Y91, A98 và T204. Liên kết giữa các amino acid trong CBD2
có kích thƣớc 3,3 đến 4,9 Å và CBD2 chứa trung tâm hoạt động (Glu 205)
(Hình 1.4B). CBD3 với C216 làm trung tâm nằm trên dải xoắn -A4 liên kết
với các amino acid W48, V87, W89, F214 và F219. Liên kết giữa các
amino acid trong CBD3 có kích thƣớc 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.4C) [55].
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10
Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea [55]
2.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase tham gia thủy phân phân tử
cơ chất theo một cơ chế riêng. Tuy nhiên, những enzyme này thƣờng
phối hợp hoạt động để thủy phân hoàn toàn phân tử cơ chất thành sản phẩm
đơn giản nhất là glucose.
Endo-β-1,4-glucanase tham gia thuỷ phân các liên kết β-1,4 glucoside ở
bên trong các phân tử cellulose và một số loại polysaccharide tƣơng tự khác.
Sản phẩm phân cắt là các oligosaccharide. Exoglucanase thủy phân các
liên kết ở đầu khử và đầu không khử của phân tử cơ chất, giải phóng các
oligosaccharide, cellobiose và glucose. -Glucosidase thủy phân các phân tử
cellodextrin và cellobiose tạo thành các phân tử glucose [45], [58] (Hình 1.5).
Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
11
(B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase
2.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Các cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng đƣợc
ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp nhƣ: công nghiệp
thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất
dung môi hữu cơ, sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy và bột giấy, đặc biệt
trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh.
2.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm
Sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một trong những phƣơng
hƣớng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nƣớc quả và nƣớc uống không
cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thƣờng chứa các thành phần tế bào thịt quả và
các chất sơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu
đục. Glucanase thƣờng đƣợc sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các
polysaccharide làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách
chiết và làm trong. Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong
chế phẩm enzyme Viscozyme 120L đƣợc ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ
màng tế bào đậu tƣơng [14]. Trong quá trình sản xuất nƣớc cà rốt thƣờng sử
dụng endoglucanase xử lý ở giai đoạn dịch hóa đã tạo ra nhiều pectin hơn.
Trong công nghệ sản xuất bia, dịch lên men ngoài các thành phần
đƣờng, protein còn có một lƣợng không nhỏ các phân tử khối lƣợng cao nhƣ
cellulose và -glucan, làm ảnh hƣởng xấu đến quá trình lọc và chất lƣợng sản
phẩm. Ngƣời ta thƣờng sử dụng -glucanase để loại bỏ những thành phần
này. Các chế phẩm nhƣ Finizym 200L gồm các cellulase từ A. niger,
-glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã đƣợc
sử dụng trong sản xuất bia.
Ngoài ra, endoglucanase còn đƣợc sử dụng trong công nghệ sản xuất
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12
bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicola
insolens đƣợc ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho
bánh mỳ. Glucanase từ Trichoderma reesei, A. niger đƣợc ứng dụng trong sản
xuất fructooligosaccharide. Đây là một trong số các oligosaccharide chức
năng (prebiotic) đƣợc sản xuất để bổ sung vào khẩu phần ăn. Prebiotic có
nhiều lợi ích về mặt dƣợc phẩm cũng nhƣ có ảnh hƣởng tốt đến sức khỏe. Khi
đƣợc bổ sung vào cơ thể ngƣời và động vật, prebiotic có nhiều tác động sinh
lý quan trọng nhƣ: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh vật gây bệnh,
bảo vệ các chức năng của gan, làm giảm lƣợng cholesterol trong huyết thanh,
tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thƣ, cản trở sự
phát triển của các vi sinh vật trong khoang miệng [38], [64]. Các phế phụ
phẩm nông nghiệp nhƣ lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tƣởng cho
việc sản xuất các oligosaccharide. Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình
này chủ yếu có nguồn gốc từ nấm mốc. Hiện nay, nhu cầu sử dụng các
oligosaccharide ở các nƣớc trên thế giới là rất lớn. Tại Nhật Bản, nhu cầu
hàng năm về các oligosaccharide vào khoảng 1000-2000 tấn/năm [48].
2.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc
Chăn nuôi là một nhánh quan trọng của ngành nông nghiệp Việt Nam.
Thu nhập từ chăn nuôi hàng năm đạt 20% tổng giá trị kinh tế của ngành
nông nghiệp. Chăn nuôi không những cung cấp các loại thực phẩm nhƣ trứng,
thịt, sữa cho thị trƣờng mà còn cung cấp nguồn phân bón rất hữu ích cho
ngành trồng trọt. Đây cũng là nguồn thu nhập đáng kể góp phần xóa đói
giảm nghèo, nâng cao đời sống cho ngƣời dân Việt Nam. Tuy nhiên, ngành
nông nghiệp nói chung và chăn nuôi nói riêng đang gặp phải nhiều khó khăn.
Một trong những vấn đề cần đƣợc giải quyết hiện nay là làm thế nào để
nâng cao năng suất vật nuôi, tăng hiệu quả chăn nuôi mà vẫn đảm bảo an toàn
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
13
cho môi trƣờng xung quanh, đặc biệt là sức khỏe con ngƣời.
Trƣớc tình hình đó, nhiều nhóm giải pháp đã đƣợc đƣa ra và một trong
những giải pháp đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm là sử dụng các loại thức
ăn chăn nuôi có nguồn gốc sinh học hoặc bán sinh học nhƣ sản xuất và bổ
sung các chế phẩm enzyme vào trong thức ăn chăn nuôi. Bổ sung chế phẩm
enzyme vào thức ăn chăn nuôi một mặt làm tăng khả năng tiêu hóa thức ăn và
hấp thụ chất dinh dƣỡng, từ đó làm tăng tốc độ sinh trƣởng phát triển, nâng
cao chất lƣợng vật nuôi. Mặt khác, nhờ tác dụng của enzyme mà thức ăn đƣợc
tiêu hóa triệt để, khai thác tối đa nguồn năng lƣợng vốn có, tiết kiệm chi phí
chăn nuôi, đồng thời làm giảm lƣợng phân thải ra ngoài, góp phần quan trọng
trong việc giảm thiểu ô nhiễm môi trƣờng.
Thức ăn gia súc, gia cầm đƣợc chế biến từ các loại ngũ cốc có chứa
nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này thƣờng không đƣợc tiêu hóa
triệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày. Do đó chúng đã hạn chế sự hấp thu
các chất dinh dƣỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật. Bổ sung
-glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên,
giải phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng
hấp thu và chuyển hóa thức ăn [14]. Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi bổ sung
glucanase độc lập hoặc kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi
làm tăng đáng kể tốc độ tăng trƣởng và giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi.
Omogbenigun và cs (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợp chế phẩm glucanase
và một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase)
xử lý thức ăn cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng
tiêu hóa so với đối chứng là khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme nhƣ sau:
khả năng tiêu hóa tinh bột tăng 87-94%, các polysaccharide khác
tăng 10-18%, phytate tăng 59-70% [52].
Tiềm năng ứng dụng to lớn của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sự
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
14
quan tâm của nhiều công ty chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Một số chế
phẩm là tổ hợp các enzyme khác nhau có thể kể đến nhƣ: Rovazyme G2
(DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 3 loại enzyme
(cellulase, β-glucanase và xylanase); Roxazyme G (DSM Nutritional Products
Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 7 loại enzyme (cellulase, glucanase, protease,
amylase, pectinase, xylanase, hemicellulase); Natugrain (tập đoàn BASF,
Đức) là hỗn hợp của endoxylanase và endoglucanase; Rhodizyme-CF
(Rampart-Power Bangladesh Ltd) là tổ hợp của 5 loại enzyme (cellulase,
amylase, protease, lipase, pectinase). Chế phẩm SSF của Mỹ hiện đang bán tại
thị trƣờng Việt Nam là tổ hợp của 6 loại enzyme: β-glucanase (200 BGU/g),
phytase (1000 PU/g), α-amylase (30 FAU/g), pectinase (4000 AJDU/g),
protease (700 HUT/g) và xylanase (100 XU/g) [3].
Ở Việt Nam đã có một số nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong
chăn nuôi. Chu Thị Thanh Bình và cs (2002) đã nghiên cứu ứng dụng các
chủng nấm men trong chế biến bã thải từ hoa quả giàu chất sơ làm thức ăn
cho gia súc [2].
2.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ
Sử dụng glucanase xử lý nguyên liệu giàu cellulose, glucan trƣớc khi
lên men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi lên trung bình là 1,5%. Nhiều
chế phẩm enzyme đã đƣợc sử dụng trong ngành công nghiệp này nhƣ
neutrase 0,5L có chứa -glucanase sử dụng trong công nghiệp sản xuất
ethanol. Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium
sinh tổng hợp glucanase đƣợc sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất dung
môi hữu cơ, acetic acid [24], sản xuất acetone, butanol và isopropanol [28].
2.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, nguyên liệu ban đầu đƣợc
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
15
nghiền cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ đƣợc tách riêng khỏi nhau
chuyển thành bột giấy chứa các sợi và bột mịn. Trong quy trình sản xuất giấy
cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy, còn cellulose thì đƣợc giữ lại. Phƣơng pháp
thông thƣờng là bổ sung dung dịch chlor hoặc chlor diocide. Đây là một
phƣơng pháp tốn kém và thƣờng gây ô nhiễm môi trƣờng do thành phần chlor
tồn dƣ trong nƣớc thải. Vì thế, trong những năm gần đây một giải pháp mới
đƣợc đƣa ra để thay thế phƣơng pháp truyền thống, đó là sử dụng các
chế phẩm enzyme trong đó có glucanase để xử lý bột giấy.
Glucanase thƣờng đƣợc bổ sung vào công đoạn nghiền bột giấy để làm
thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết kiệm
khoảng 20% năng lƣợng cho quá trình nghiền cơ học. Đồng thời xử lý
glucanase trƣớc khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏ
ngoài của gỗ, làm tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ,
tăng hiệu quả khử lignin [14], [15]. Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy,
glucanase đƣợc sử dụng để tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra
triển vọng đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy
tái sinh [37].
2.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa
Cùng với protease, lipase, amylase, cellulase và hemicellulase đƣợc
ứng dụng để sản xuất chất tẩy rửa. Cellulase sẽ thủy phân các tơ sợi của sợi
vải là nơi bám của các phân tử bụi bẩn, loại bỏ chúng khỏi quần áo. Tính đến
năm 2002 đã có nhiều cellulase đƣợc sản xuất dùng cho bột giặt nhƣ:
endoglucanase và exoglucanase từ Thermomyces lanuginous [51].
2.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh
Việc sử dụng enzyme quan trọng nhất trong công tác bảo vệ môi trƣờng
là sử dụng enzyme trong xử lý chất thải, chuyển các chất thải thành sản phẩm
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
16
có ích, hoặc trong công nghệ tái sử dụng phế thải, chuyển các phế thải
thành sản phẩm có ích. Trong nhiều năm qua cả ở thế giới và Việt Nam, các
chủng vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme phân hủy cellulose đã đƣợc ứng dụng
rất có hiệu quả để xử lý rác thải sinh hoạt.
Năm 1999, Nguyễn Lan Hƣơng và cs đã phân lập và tuyển chọn đƣợc
các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn có hoạt tính cellulase, sau đó bổ sung vào bể
ủ rác thải đã rút ngắn đƣợc chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt từ 5-7 ngày. Nhiều
chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm đã đƣợc nghiên cứu và ứng dụng có hiệu
quả trong quá trình xử lý rác thải ở Việt Nam [1], [5], [8], [12].
Nhiều chế phẩm vi sinh trong đó có chứa hệ sinh vật sinh tổng hợp
cellulase đã đƣợc nghiên cứu và sản xuất để xử lý rác thải. Trong đó,
chế phẩm Micromix 3 khi bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã rút ngắn
đƣợc 15 ngày ủ, giảm một nửa thời gian lên men so với đối chứng. Đồng thời,
lƣợng mùn tạo thành khi xử lý rác bằng chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%
và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so với đối chứng. Sản phẩm của quá
trình xử lý rác thải đƣợc phối trộn và bổ sung thêm một số vi sinh vật có ích
cố định đạm tạo thành phân bón vi sinh, đƣợc sử dụng rộng rãi trong nông
nghiệp đã góp phần nâng cao năng suất cây trồng, giảm thiểu đƣợc nguồn và
nguy cơ gây ô nhiễm môi trƣờng [1].
Ngoài ra, đã có những nghiên cứu ảnh hƣởng của cellulase đến nấm
gây bệnh cây trồng nhƣ cellulase của Trichoderma harzianum, từ đó ứng
dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học [6].
2.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ
NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các
nguồn hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trƣờng thành các chất dinh dƣỡng
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
17
cần thiết cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của mình. Khả năng
sinh trƣởng, phát triển cũng nhƣ khả năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự
tác động của nhiều yếu tố môi trƣờng nhƣ: nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trƣờng,
nguồn carbon, nguồn nitrogen.
Nguồn carbon: các loài vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase có thể
sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc đặc điểm của từng loài. Có
loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài thì không đòi
hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau.
Nguồn carbon có thể đơn giản nhƣ các loại đƣờng đơn, đƣờng đôi hoặc
phức tạp nhƣ glucan, tinh bột, cellulose.
Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cho thấy, nguồn carbon
thích hợp cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn
chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC. Nguồn carbon
thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ
khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12
là lactose [5]; các chủng Actinomyces griseus là bã mía hoặc mùn cƣa. Nguồn
carbon thích hợp đối với các chủng xạ khuẩn ƣu ấm là vỏ lạc hoặc rơm [12].
Đối với các chủng nấm mốc, nguồn carbon thích hợp cho quá trình sinh
tổng hợp cellulase và một số loại enzyme khác là các nguồn carbon tự nhiên,
đặc biệt là các phế phụ phẩm nông nghiệp. Theo Acharya và cs (2008), nguồn
carbon thích hợp nhất cho các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase là
mùn cƣa [18]. Còn theo kết quả nghiên cứu của Ojumu và cs (2003), chủng A.
flavus Linn isolate NSPR 101 có khả năng sinh tổng hợp cellulase khi sử
dụng mùn cƣa, bã mía hay lõi ngô làm nguồn cơ chất, trong đó mùn cƣa đƣợc
xem là nguồn cơ chất tối ƣu.
Các loài Penicillium pinophilum, P. persicinum, P. brasilianum
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
18
sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất đối với nguồn cellulose tự nhiên, còn đối
với nguồn carbon xylan hoặc birchwood xylan thì khả năng sinh tổng hợp rất
kém [33]. Theo kết quả nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006), nguồn carbon
thích hợp nhất cho chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 là rơm [10].
Nguồn nitrogen: các loài vi sinh vật khác nhau có nhu cầu khác nhau
đối với nguồn nitrogen. Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả
nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ nhƣng mức độ đồng hóa tùy thuộc từng loài.
Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất
trong môi trƣờng chứa nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men [5].
Nguồn nitrogen urea và đậu nành ảnh hƣởng mạnh mẽ đến quá trình
sinh tổng hợp cellulase của chủng A. niger NRRL-363 với hoạt tính cellulase
tổng số từ 46 đến 76 IU/g [11]. Nghiên cứu của Narasimha và cs (2006) cho
thấy, các chủng A. niger có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau nhƣ:
urea, peptone, ammonium nitrate. Trong đó, urea là nguồn nitrogen tốt nhất
cho khả năng sinh tổng hợp các cellulase của các chủng nấm này [49].
Nhiệt độ nuôi cấy: Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trƣởng, các
loài vi sinh vật đƣợc chia làm 3 nhóm: các loài ƣa lạnh và chịu lạnh; các loài
ƣa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài ƣa lạnh có khả năng sinh trƣởng trong
điều kiện dƣới 15C, các loài ƣa ấm thƣờng sinh trƣởng phát triển tốt ở
khoảng nhiệt độ 20-37C; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trƣởng và
phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50C.
Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập
từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở
điều kiện nhiệt độ 45-55C và có thể chịu đƣợc nhiệt độ 65-80C [5].
Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hƣơng và cs (2003) cũng cho thấy, các chủng
vi khuẩn và xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
19
50C [9]. Chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus có khả năng sinh tổng hợp
cellulase tối ƣu ở nhiệt độ 58C [13]. Trong khi đó, các chủng nấm mốc N1
và N2 có nhiệt độ sinh tổng hợp cellulase tối ƣu là 31 và 34C [8]. Acharya
và cs (2008) cho rằng, các chủng A. niger tổng hợp cellulase mạnh nhất khi
lên men trong điều kiện 28C, pH 4,0-4,5 [18].
pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu: pH môi trƣờng ban đầu ảnh hƣởng
quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật.
Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trƣờng ban đầu thích hợp là
acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh
tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trƣờng ban đầu là 8,0 [5]; còn chủng
xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH môi trƣờng ban đầu là 6,7
[13]. Đối với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ƣu ở
môi trƣờng có pH ban đầu là 4,5 và 5,5 [8]; các chủng A. niger sinh tổng hợp
cellulase mạnh nhất trong khoảng pH môi trƣờng ban đầu từ 6,0-7,0 [19].
Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp
các loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố
khác nhƣ: thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục khí, lƣợng giống đƣợc tiếp vào
ban đầu.
2.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE
Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt
mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định. Độ bền đối với nhiệt độ và pH hay mức
độ và tính chất chịu ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ hay
ion kim loại cũng có sự khác nhau.
Ảnh hƣởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác
chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chƣa ảnh hƣởng
đến cấu trúc enzyme. Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp,
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
20
khoảng nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50C. Ở nhiệt độ
cao, enzyme bị biến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính; còn ở
nhiệt độ thấp dƣới 0C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhƣng lại có thể
phục hồi khi đƣa về nhiệt độ thích hợp [4].
Cellulase từ A. niger NRRL-363 hoạt động mạnh nhất ở 50C [11];
trong khi đó cellulase từ A. niger Z10 là 40C [25], còn hoạt tính xúc tác của
endoglucanase III từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở 55C [46]. Theo
kết quả nghiên cứu của Kiamoto và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A.
oryzae KBN616 hoạt động tốt nhất trong dải nhiệt độ 45-55C [43].
Ảnh hƣởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc
vào pH môi trƣờng phản ứng. Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH
thích hợp để enzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid. Theo
nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, pH tối ƣu cho hoạt động của cellulase từ
A. niger NRRL-363 là 5,5 [11]; của cellulase từ A. niger Z10 là 4,5 và 7,5
[25]; của endoglucanase III từ Trichoderma reesei là 4,0-5,0 [46]; của
endoglucanase từ A. oryzae KBN616 là 4,0 và 5,0 [43]. Khi nghiên cứu ảnh
hƣởng của pH lên hoạt tính endoglucanase từ chủng nấm ƣa acid A. terreus
M11, Gao và cs (2008) cho rằng enzyme này có khả năng hoạt động trong dải
pH 2-5, trong đó pH 2 là tốt nhất [29].
Ảnh hƣởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc
hoạt hóa sự hoạt động của các enzyme. Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất
định có thể gây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme. Sharma và cs (1995) nhận thấy, ion Ca2+ làm tăng hoạt tính cellulase của Bacillus sp. D04 lên 40% so với đối chứng; còn Mg2+ làm giảm nhẹ (hoạt tính còn lại 92%) và Zn2+ ức chế mạnh hoạt tính enzyme này (hoạt tính còn lại bằng 37%
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
21
so với đối chứng) [56]. Theo nghiên cứu của Gao và cs (2008), endoglucanase từ A. terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg2+ (2 mM), 59% khi ủ với Cu2+ (2 mM) [29].
Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hƣởng mạnh
mẽ đến hoạt tính của enzyme. Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng
nhƣ bản chất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hƣởng tới hoạt động
của enzyme là khác nhau. Nghiên cứu của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng
Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy, các dung môi hữu cơ methanol, ethanol,
isopropanol và acetone đều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là
n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạt tính cellulase chỉ còn 33-63%. Các chất
tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS và triton X-100 đều làm giảm hoạt tính
cellulase ở mức độ khác nhau, trong đó SDS làm giảm mạnh hoạt tính
cellulase chỉ còn 18-34% [10].
2.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM
Cho đến nay, ở Việt Nam đã có khá nhiều tác giả nghiên cứu về
cellulase nói chung và endo-β-1,4-glucanase nói riêng. Các nghiên cứu đƣợc
tiến hành trên nhiều phƣơng diện khác nhau liên quan đến loại enzyme này.
Vấn đề môi sinh ngày càng trở nên trầm trọng trên phạm vi toàn cầu. Ở
Việt Nam, lƣợng rác thải ra ngoài môi trƣờng ngày càng lớn, nguy cơ ô nhiễm
môi trƣờng ở nhiều nơi là rất cao. Việc sử dụng biện pháp vi sinh học
trong xử lý rác thải đã và đang mang lại nhiều giá trị to lớn. Tuy nhiên,
việc sử dụng các vi sinh vật có sẵn trong tự nhiên để xử lý rác thải, thời gian
thƣờng kéo dài gây nên tình trạng ô nhiễm môi trƣờng, tốn nhiều diện tích và
công sức. Để xử lý rác triệt để hơn, giảm giá thành và thời gian xử lý,
ngoài việc tạo điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển tốt thì việc tuyển
chọn các vi sinh vật có khả năng sinh trƣởng nhanh, hoạt tính phân giải mạnh,
chịu đƣợc nhiệt độ cao để bổ sung vào các bể rác là một trong những hƣớng
nghiên cứu đã và đang đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm.
Năm 1999, Tăng Thị Chính và cs đã tiến hành nghiên cứu các điều kiện
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
22
lên men và ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến khả năng sinh tổng hợp
cellulase của một số chủng vi khuẩn ƣa nhiệt đƣợc phân lập từ bể ủ rác thải,
nhằm tìm ra điều kiện tối ƣu nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase, ứng
dụng vào việc xử lý rác thải chứa nhiều cellulose. Kết quả cho thấy, các
chủng vi sinh vật nghiên cứu có khả năng chịu đƣợc nhiệt độ 80C, nhiệt độ
lên men tối ƣu từ 45C đến 55C, pH môi trƣờng ban đầu thích hợp nhất là 8.
Nguồn carbon tốt nhất cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các
chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC; nguồn nitrogen là peptone và
cao nấm men. Các tác giả cũng đã nghiên cứu động thái của quá trình
sinh tổng hợp cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở
48 giờ lên men [5].
Nguyễn Đức Lƣợng và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu khả năng
sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus. Qua nghiên cứu tác giả thấy
rằng khả năng sinh tổng hợp cellulase của A. griseus là cao và
khả năng này đạt tối ƣu ở 58C, pH ban đầu là 6,7, độ ẩm ban đầu là 55% với
thời gian nuôi cấy là 72 giờ. Qua nghiên cứu tác giả cũng thấy rằng
nguồn lignocellulose thích hợp là bã mía hoặc mùn cƣa [13]. Cũng trong năm
này, Phạm Thị Ngọc Lan và cs đã tiến hành nghiên cứu và tuyển chọn đƣợc
một số chủng xạ khuẩn ƣa ấm phân lập từ mùn rác ở một số nơi có khả năng
phân giải cellulose mạnh. Trong số 195 chủng xạ khuẩn nghiên cứu thì
các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ các mẫu rơm mục và đất chân đống rơm
có khả năng phân giải cellulose và CMC mạnh nhất [12].
Trong số các loài vi sinh vật, nấm sợi là một trong những đối tƣợng có
khả năng sinh tổng hợp cellulase cao. Việc tìm ra các chủng nấm sợi có khả
năng phân hủy cellulose cao và tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp cellulase của
chúng đang là vấn đề đƣợc nhiều tác giả quan tâm. Năm 1999, Đặng Minh
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
23
Hằng đã nghiên cứu tuyển chọn đƣợc hai chủng nấm sợi có khả năng phân
giải cellulose cao. Tác giả cũng đã nghiên cứu và tìm ra đƣợc một số điều
kiện tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của hai chủng nấm này [8].
Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cs đã nghiên cứu khả năng sinh tổng
hợp và đặc điểm của cellulase từ chủng A. niger NRRL-363. Qua nghiên cứu,
tác giả đã tìm ra đƣợc một số thông tin và điều kiện cơ bản cho sự tổng hợp
cellulase của chủng này trên môi trƣờng trấu xay và một số chất thải
công nghiệp nhƣ mật rỉ đƣờng [11].
Bằng cách tuyển chọn các chủng vi sinh vật chịu nhiệt, phân giải
cellulose cao, Lý Kim Bảng và cs (1999) đã xây dựng đƣợc quy trình
công nghệ sản xuất chế phẩm Micromix 3 bổ sung vào bể ủ rác thải. Nghiên
cứu cho thấy, khi chế phẩm này đƣợc bổ sung vào bể ủ rác thải có thổi khí đã
rút ngắn đƣợc 15 ngày ủ, một nửa thời gian lên men so với bể đối chứng
bổ sung chế phẩm VSV-xen. Lƣợng mùn tạo thành của bể ủ bổ sung
chế phẩm Micromix 3 cao hơn 29%, và các chất dinh dƣỡng cao hơn 10% so
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
24
với bể đối chứng [1].
3 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT
3.1.1 Chủng nấm
Hai mƣơi sáu chủng A. awamori do Viện Vi sinh vật và Công nghệ
Sinh học - Đại học Quốc Gia Hà Nội cung cấp đƣợc sử dụng để tuyển chọn,
nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất. Từ đó thu
enzyme làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.1.2 Thiết bị thí nghiệm
Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Thiết bị
Hãng sản xuất (quốc gia)
Bể ổn nhiệt
Trung Quốc
Box cấy LB-1234
Việt Nam
Cân phân tích BL 150S
Sartorius (Thụy Sỹ)
Hệ thống chụp ảnh gel
Wealtec (Mỹ)
Hệ thống điện di ngang
Mupid (Nhật bản)
Lò vi sóng
SamSung (Hàn Quốc)
Máy ly tâm lạnh Mikro 22R
Hettich (Đức)
Máy quang phổ UV-2500
LaboMed Inc (Mỹ)
Máy PCR Mastercycler personal
Eppendorf (Đức)
Máy chuẩn pH 827 pH Lab
Metrohm (Thụy Sỹ)
Máy lắc nuôi cấy
Certomat HK (Đức)
Nồi khử trùng ES-315
Tomy (Nhật Bản)
Tủ lạnh 4ºC, -20ºC, -80ºC
Toshiba, Sanyo (Nhật Bản)
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
25
3.1.3 Hóa chất
Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
Hóa chất
Hãng sản xuất (quốc gia)
3,5-dinitrosalicylic acid (DNS)
Fluka
Difco (Mỹ)
Cao nấm men
Heldelberg (Đức)
DEAE
Merck (Đức)
Peptone
Sigma (Mỹ)
SDS
Pharmacia (Mỹ)
Sephadex G100
Sigma (Mỹ)
Sodium dodecylsulfate
Merck (Đức)
Triton X-100
BioBasic Inc (Mỹ)
Tween-20
BioBasic Inc (Mỹ)
Tween-80
Prolabo (Pháp)
CMC
3.1.4 Môi trƣờng
Môi trƣờng Czapek: 0,2% (w/v) NaNO3, 0,1% K2HPO4, 0,05%
MgSO4, 0,05% KCl, 2% Saccharose, pH 6,5. Môi trƣờng đặc bổ sung
2% agar.
Môi trƣờng MT1 theo Mandles (g/l): urea 0,3; (NH4)2SO4 1,4;
KH2PO4 2; CaCl2 0,3; MgSO4.7H2O 0,3; peptone 1; cao nấm men 10;
tween 80 1; CMC 10; các yếu tố vi lƣợng 0,1% (v/v) bao gồm các muối:
FeSO4 18 mM; MnSO4 6,6 mM; ZnSO4 4,8 mM, CoCl2 15 mM. pH 7,0
[36], [60].
Môi trƣờng LB (Luria-Bertani): 1% (w/v) peptone; 0,5% (w/v) cao nấm
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
26
men; 1% (w/v) NaCl; pH 7,0, khử trùng, với môi trƣờng đặc bổ sung
2% (w/v) agar. Đối với việc chọn chủng mang plasmid, môi trƣờng đƣợc
bổ sung 100 g/ml ampicillin.
3.1.5 Dung dịch và đệm
Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm
Dung dịch
Thành phần, nồng độ
Dung dịch Bradford gốc
100 ml 95% ethanol; 350 mg serva blue G; 200 ml 88% phosphoric acid
Đệm Bradford thí nghiệm 425 ml H2O; 15 ml 95% ethanol; 30 ml 88%
phosphoric acid; 30 ml dung dịch bradford gốc
Đệm điện di protein (biến tính)
25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0,1% SDS, pH 8,4
Đệm KP (K2HPO4)
0,1 M K2HPO4, pH 6,5
Đệm tra mẫu protein (biến tính) 5x
10% SDS; 0,05% brommophenol blue; 50% glycerol; 10% 2 mecaptho ethanol pha trong đệm 0,312 M Tris-HCl, pH 6,8
Dung dịch DNS (1000 ml) 205,4 g KNaC4H4O6.4H2O; 4,15 g Na2S2O5; 5,3 g
DNS; 9,9 g NaOH; 3,8 ml phenol
Dung dịch I
Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 50 mM NaCl
Dung dịch II
Đệm Tris HCl 50 mM, pH 8,0; 1000 mM NaCl
Dung dịch III
Đệm 80 mM phosphate, pH 7,5
Dung dịch A
Đệm 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8
Dung dịch APS
10% ammonium persulfate
Dung dịch B
Đệm 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8
Dung dịch C
30% acrylamide; 0,8% bis-acrylamide
Dung dịch D
10% SDS; 25 mM EDTA
Dung dịch nhuộm gel polyacrylamide
0,1% (w/v) coomassie brilliant blue; 30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid
Dung dịch rửa PAGE
30% (v/v) methanol; 10% (v/v) acetic acid
Dung dịch protease K
20 g/ml protease K
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
27
Dung dịch RNase
10 g/ml RNase
Dung dịch ampicillin gốc
100 mg/ml ampicillin
0,1 g/ml ethidium bromide
Dung dịch nhuộm gel agarose
Đệm TE
100 mM Tris- HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0
Đệm tra mẫu DNA 6x
0,09% (w/v) brommophenol blue; 0,09% (w/v) xylene xyanol (FF); 60% (v/v) glycerol
Đệm TBE 10x
108 g Tris base; 55 g boric acid; 40 ml 0,5 M EDTA pH 8,0
Đệm cell lysis
10 mM Tris, 100 mM EDTA, 2% (w/v) SDS, pH 8,0
3.2 PHƢƠNG PHÁP
3.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật
Nuôi cấy hoạt hóa nấm sợi
Các chủng A. awamori lấy từ các ống giống đƣợc nuôi cấy trên
môi trƣờng Czapek lỏng ở điều kiện 30C, pH 6,5, lắc 200 vòng/phút trong
72 giờ.
Nuôi cấy nấm thu sinh khối enzyme
Các chủng A. awamori sau khi hoạt hóa đƣợc nuôi cấy chìm trong
môi trƣờng MT1 với 0,5% CMC làm cơ chất, ở 30°C, lắc 200 vòng/phút. Sau
96 giờ nuôi cấy, dịch canh trƣờng đƣợc ly tâm loại sinh khối tế bào, thu dịch
enzyme thô.
3.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase
Định tính hoạt tính endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase đƣợc xác định tƣơng đối theo phƣơng pháp
khuếch tán enzyme trên đĩa thạch. Đĩa thạch chứa 0,5% cơ chất CMC trong
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
28
đệm 100 mM potassium phosphate pH 6,5, dày khoảng 0,5 cm đƣợc đục lỗ
đƣờng kính 0,5 cm. 50 µl dịch enzyme vào lỗ rồi ủ 12 giờ ở 4C cho enzyme
khuếch tán đều xung quanh. Sau đó ủ tiếp 8 giờ ở 37C, lấy ra nhuộm bằng
dung dich 1% lugol và đo đƣờng kính vòng phân giải cơ chất.
Hoạt tính tƣơng đối của enzyme tỷ lệ thuận với kích thƣớc đƣờng kính vòng
phân giải cơ chất: Dhalo = D - d (với D là đƣờng kính vòng ngoài và d là
đƣờng kính lỗ) [7].
Xác định hoạt độ endoglucanase
Hoạt độ endoglucanase đƣợc xác định chính xác dựa vào lƣợng
đƣờng khử tạo thành sau phản ứng bằng phƣơng pháp đo quang phổ
theo Miller (1959) [47].
Tiến hành
Ống thí nghiệm (lặp lại 3 lần): 0,1 ml dịch enzyme đƣợc hút vào ống
nghiệm, thêm 0,4 ml dung dịch 0,5% CMC trong đệm 100 mM potassium
phosphate, pH 6,5. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó
bổ sung ngay 1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS và đun sôi cách thủy 5 phút.
Ống đối chứng: 0,1 ml dịch enzyme đƣợc hút vào ống nghiệm, thêm
1,25 ml dung dịch thuốc thử DNS ủ trong 5 phút, bổ sung tiếp 0,4 ml dung
dịch 0,5% CMC. Hỗn hợp đƣợc lắc đều và ủ ở 50°C trong 20 phút, sau đó lấy
ra và đun sôi cách thủy 5 phút.
Hỗn hợp sau phản ứng đƣợc đo độ hấp thụ quang phổ ở bƣớc sóng
540 nm. Kết quả đo độ hấp thụ quang phổ đƣợc đối chiếu với đồ thị chuẩn
nồng độ glucose để suy ra lƣợng đƣờng khử tƣơng đƣơng đƣợc giải phóng ra.
Dựng đƣờng chuẩn: Glucose đƣợc pha trong nƣớc cất với nồng độ
chuẩn khác nhau từ 0,04-0,18 mg/ml. 2 ml dung dịch glucose chuẩn đƣợc đo
độ hấp phụ ở bƣớc sóng 540 nm nhƣ trên. Sau đó, mối tƣơng quan giữa độ
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
29
hấp phụ và nồng độ glucose đƣợc xây dựng bằng phần mềm Microsoft Excel.
Kết quả cho thấy, đƣờng nồng độ chuẩn glucose tuyến tính trong dải
nồng độ 0,04-0,18 mg/ml (Hình 2.1).
Đƣờng chuẩn có phƣơng trình: y = 2,6411x - 0,0799. Trong đó:
y - độ hấp phụ ở bƣớc sóng 540 nm (OD540 nm); x - nồng độ glucose (mg/ml)
Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose
Đơn vị hoạt độ: một đơn vị hoạt độ quốc tế (IU) đƣợc định nghĩa là
lƣợng enzyme làm thủy phân cơ chất (CMC) thành đƣờng khử tƣơng đƣơng
1 mol glucose trong một phút ở điều kiện thí nghệm.
3.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase
3.2.3.1 Thời gian nuôi cấy
Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1
cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, dịch canh trƣờng đƣợc thu
sau những khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau: từ 24-240 giờ và xác định
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
30
hoạt tính endoglucanase.
3.2.3.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường
Để xác định nhiệt độ nuôi cấy tối ƣu, chủng nấm nghiên cứu đƣợc nuôi
trong môi trƣờng MT1 cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, lắc
200 vòng/phút ở 25C, 28C; 30C, 32C và 37C; pH 7,0. Dịch canh trƣờng
đƣợc thu sau 96 giờ nuôi cấy và xác định hoạt tính endoglucanase.
3.2.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất cảm ứng
Cơ chất với một nồng độ nhất định thƣờng đóng vai trò là chất cảm ứng
cho quá trình sinh tổng hợp loại enzyme tƣơng ứng. Để xác định khả năng
cảm ứng của cơ chất CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, chủng
A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng MT1 cơ bản
pH 7,0, lắc 200 vòng/phút ở 30C, CMC đƣợc bổ sung vào môi trƣờng với
các nồng độ khác nhau từ 0,2-4%. Sau 96 giờ nuôi cấy, thu dịch nổi và
xác định hoạt tính endoglucanase.
3.2.3.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon
Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng
MT1 cơ bản với 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, nuôi lắc
200 vòng/phút ở 30C, pH 7,0 và nguồn cao nấm men đƣợc thay thế bằng các
nguồn carbon khác (vỏ cà phê, glucose, vỏ lạc, vỏ quýt, lõi ngô, bã mía,
saccharose, lactose, vỏ cám trấu, mùn cƣa, xơ dừa) với cùng nồng độ. Dịch
nổi canh trƣờng đƣợc thu sau 96 giờ để xác định hoạt tính endoglucanase
ngoại bào.
Sau khi chọn đƣợc lõi ngô là nguồn carbon thích hợp nhất cho
khả năng sinh tổng hợp endoglucanase, lõi ngô đƣợc bổ sung vào môi trƣờng
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
31
với các nồng độ khác nhau từ 0-5% (w/v) để xác định nồng độ tối ƣu.
3.2.3.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen
Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng
MT1 cơ bản với 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, 3% lõi ngô làm
nguồn carbon, nuôi lắc 200 vòng/phút ở 30C, pH 7,0 và các nguồn nitrogen
(ammonium sulphate, urea, peptone) đƣợc thay thế bằng các nguồn nitrogen
khác với cùng nồng độ. Dịch nổi canh trƣờng đƣợc thu sau 96 giờ nuôi cấy để
xác định hoạt tính endoglucanase ngoại bào.
3.2.3.6 Ảnh hưởng của pH môi trường
Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng
MT1 bổ sung 2% CMC làm nguồn cơ chất cảm ứng, 3% lõi ngô làm
nguồn carbon và 0,3% ammonium acetate làm nguồn nitrogen, nuôi lắc
200 vòng/phút ở 30C, pH ban đầu thay đổi từ 3,0-8,0. Dịch nổi môi trƣờng
đƣợc thu ở 96 giờ để xác định hoạt tính endoglucanase ngoại bào.
3.2.4 Tinh sạch enzyme
Dịch enzyme sau khi đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, đƣợc
đƣa lên cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100 với tổng thể tích 10 ml. Cột có
kích thƣớc 2,6 x 60 cm đƣợc cân bằng với đệm 50 mM potassium phosphate,
pH 7,5. Tốc độ dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích
mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme đƣợc xác định
trong mỗi phân đoạn.
Dịch enzyme sau khi qua cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, chọn
những phân đoạn có hoạt tính endoglucanase cao đƣợc đƣa tiếp lên cột sắc kí
trao đổi ion DEAE với tổng thể tích 12 ml. Cột có kích thƣớc 2,6 x 60 cm
đƣợc cân bằng với đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM NaCl, thôi mẫu
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
32
bằng đệm 50 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1000 mM NaCl. Tốc độ dòng chảy là
20 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml. Hàm lƣợng
protein và hoạt tính enzyme đƣợc xác định cho mỗi phân đoạn. Quá trình
tinh sạch endoglucanase có thể đƣợc tóm tắt nhƣ sơ đồ hình 2.2.
Dịch enzyme thô ↓ Ly tâm 10000 vòng/10 phút ↓ Dịch trong ↓ Cột Sephadex G100 ↓ Cột DEAE ↓ Enzyme tinh sạch
Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099
3.2.5 Điện di SDS-PAGE
Khối lƣợng phân tử tƣơng đối của enzyme tách chiết và độ tinh sạch
của các dịch enzyme đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp điện di trên gel
polyacrylamide theo Laemmli [44]. Thành phần gel điện di đƣợc thể hiện nhƣ
bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein
Thành phần
Gel tách (l)
Gel co (l)
1940
1180
H2O
Dung dịch A
1500
0
Dung dịch B
0
500
Dung dịch C
2500
300
Dung dịch D
60
20
APS 10%
24
10
TEMED
7
5
Tổng
6031
2015
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
33
Bản điện di đƣợc chạy với cƣờng độ dòng điện 18-20 mA cho gel
co và 25-28 mA cho gel tách.
3.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase
3.2.6.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất
Để tìm nồng độ cơ chất thích hợp dùng xác định hoạt tính
endoglucanase, phản ứng đƣợc thực hiện với các nồng độ cơ chất từ 0,2-2%
CMC pha trong đệm 100 mM potassium phosphate, pH 6,5. Hoạt tính enzyme
đƣợc xác định sau 20 phút phản ứng ở 50C.
3.2.6.2 Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt
Hỗn hợp phản ứng của dịch enzyme (0,002 mg protein) với cơ chất
1,2% (w/v) CMC pha trong đệm potassium phosphate pH 6,5 đƣợc ủ ở các
nhiệt độ khác nhau trong khoảng 30-70C, trong 20 phút để tìm nhiệt độ phản
ứng tối ƣu.
Để xác định độ bền nhiệt của endoglucanase từ chủng nấm nghiên cứu,
dịch enzyme đã tinh sạch (0,002 mg protein) đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác nhau
từ 30C đến 70C, sau các khoảng thời gian: 6; 12; 24; 36; 48; 60 và 72 giờ.
Hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định theo phƣơng pháp nêu trên với
thời gian phản ứng là 20 phút ở nhiệt độ phản ứng tối ƣu.
3.2.6.3 Xác định pH phản ứng tối ưu và độ bền pH
Để xác định pH phản ứng tối ƣu cho phản ứng xúc tác của enzyme
nghiên cứu, dịch enzyme tinh sạch (0,002 mg protein) đƣợc ủ với cơ chất
CMC pha trong đệm 100 mM sodium acetate, pH từ 3,5-5,5 và 100 mM
potassium phosphate, pH từ 6,0-8,0, hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 50C trong
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
34
20 phút.
Để đánh giá độ bền pH của enzyme nghiên cứu, trƣớc hết
endoglucanase (0,002 mg protein) đƣợc ủ trong các đệm có pH thay đổi trong
khoảng 3,5-8,0, trong 2 giờ ủ ở 37C. Sau đó, chọn ra khoảng pH thích hợp
để tiếp tục xác định độ bền pH theo thời gian: 6, 12, 24, 36, 48, 60, 72 giờ.
3.2.6.4 Ảnh hưởng của dung môi hữu cơ
Để đánh giá ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính
endoglucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với 10-30% các loại dung môi hữu cơ:
acetone, ethanol, isopropanol, methanol và n-butanol ở nhiệt độ 37C. Sau
2 giờ ủ, hoạt tính còn lại của enzyme đƣợc xác định.
3.2.6.5 Ảnh hưởng của một số chất tẩy rửa
Dịch enzyme (0,002 mg protein) đƣợc ủ với 0,5-2% chất tẩy rửa tween
20, tween 80, SDS và triton X-100 ở nhiệt độ 37C. Sau 2 giờ, hoạt tính còn
lại đƣợc xác định để đánh giá ảnh hƣởng của chúng lên hoạt tính
endoglucanase.
3.2.6.6 Ảnh hưởng của ion kim loại
Để đánh giá tính chất và mức độ ảnh hƣởng của ion kim loại lên
hoạt tính endoglucanase, dịch enzyme (0,002 mg protein) đƣợc ủ cùng với muối của các ion kim loại: Ag+, Ca2+, Co2+, Cu2+, Fe3+, K+, Mg2+, Ni2+, Zn2+
và EDTA ở các nồng độ từ 5-15 mM ở 37C. Sau 2 giờ, hoạt tính còn lại của
enzyme đƣợc xác định.
3.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số
Hàm lƣợng protein đƣợc xác định theo phƣơng pháp Bradford.
Phƣơng pháp này dựa trên nguyên tắc: các protein khi phản ứng với
Coomassie Brilliant Blue sẽ hình thành phức hợp màu có khả năng hấp thụ
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
35
ánh sáng mạnh nhất ở bƣớc sóng 595 nm, cƣờng độ màu tỉ lệ thuận với
nồng độ protein trong dung dịch. Hàm lƣợng protein tổng số đƣợc xác định
dựa vào đồ thị chuẩn protein từ dung dịch albumin huyết thanh bò (Hình 2.3).
Hình 2.3. Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn
3.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử
3.2.8.1 Tách chiết DNA tổng số của nấm sợi
Tế bào nấm sợi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng Czapek ở 30C, lắc
200 vòng/phút, sau 72 giờ dịch canh trƣờng đƣợc ly tâm 10.000 vòng/phút
trong 10 phút. Tủa tế bào đƣợc nghiền nhanh, nhẹ trong cối sứ chứa nitrogen
lỏng, sau đó đƣợc bổ sung 600 l đệm cell lysis và lắc nhẹ. Bổ sung 65 l
lysozyme, ủ ở 37C trong 45 phút, cho 25 l protease K ủ ở 55C
trong 2-3 giờ. Bổ sung tiếp hỗn hợp chloroform/isoamyl alcohol (24:1) với
thể tích tƣơng đƣơng, trộn đều trong 5 phút, sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút
trong 15 phút. Hút 500 l dịch nổi chứa DNA sang ống eppendorf mới và
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
36
bổ sung 500 l isopropanol. Hỗn hợp đƣợc đảo nhẹ và tủa DNA ở -20C
trong 2-3 giờ. Tủa sau khi ly tâm đƣợc làm khô bằng giấy thấm và bổ sung
500 l 70% ethanol để rửa DNA, loại muối và isopropanol. Sau khi ly tâm
12.000 vòng/phút trong 10 phút, tủa đƣợc làm khô, hòa trong 40 l đệm TE
và bảo quản ở -20C [54].
3.2.8.2 Khuếch đại gene bằng PCR
Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc
khuếch đại bằng kỹ thuật PCR, sử dụng cặp mồi NL1 (5-GCATATCAA
TAAGCGGAGGAAAAG-3); NL4 (5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3).
Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm: 1 l DNA khuôn; 0,5 l mồi
mỗi loại; 1,2 l 25 mM MgCl2; 1 l Taq polymerase; 1,6 l 2,5 mM dNTP;
2 l đệm PCR, bổ sung nƣớc cất lên tổng thể tích 20 l. Phản ứng thực hiện
theo chu trình nhiệt: 95C/5 phút; 35 chu kỳ: 95C/1 phút, 50C/1 phút,
72C/1 phút; 72C/10 phút. Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel
0,8% agarose.
3.2.8.3 Gắn dính DNA
Phản ứng gắn dính sản phẩm PCR vào vector tách dòng pJET 1.2/blunt
đƣợc thực hiện theo protocol của hãng Fermentas. Hỗn hợp bao gồm:
2 l H2O; 5 l đệm gắn dính 2x; 0,5 l DNA blunting enzyme; 1,5 l
sản phẩm PCR. Hỗn hợp đƣợc trộn đều và ủ ở 70C trong 15 phút. Sau
đó, lấy ra bổ sung tiếp 0,5 l vector pJET 1.2/blunt và 0,5 l T4-DNA
ligase. Phản ứng gắn dính đƣợc thực hiện ở 22C trong 2-3 giờ để tạo plasmid
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
37
tái tổ hợp.
3.2.8.4 Biến nạp plasmid hóa học
Plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5 theo
phƣơng pháp sốc nhiệt và hóa học. Một khuẩn lạc E. coli DH5 đƣợc cấy
chuyển vào 3 ml môi trƣờng LB, lắc 200 vòng/phút ở 37C qua đêm. 100 ml
môi trƣờng LB đƣợc tiếp giống với 1 ml dịch tế bào đã nuôi qua đêm,
nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37C. Khi OD600 nm đạt 0,4-0,6 (khoảng 2-3 giờ
nuôi cấy), dịch nuôi cấy đƣợc thu lại và đặt vào trong đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm
6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4C. Tủa tế bào đƣợc hòa đều trong 100 ml
dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh vô trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm nhƣ trên.
Tủa tế bào lại đƣợc hòa đều trong 40 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh vô
trùng, ủ đá khoảng 1 giờ và ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút. Tủa
tế bào đƣợc hòa vào 500 l dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh, vô trùng chứa
15% glycerol. Dịch hỗn hợp tế bào và glycerol đƣợc chia nhỏ 40 l vào các
ống eppendorf, dùng biến nạp ngay hoặc bảo quản ở -80C.
Năm l plasmid tái tổ hợp đƣợc trộn với 40 l dịch tế bào khả biến, ủ
20-30 phút ở 4C. Hỗn hợp đƣợc gây sốc nhiệt 45 giây ở 42C. Sau đó
đặt ngay vào đá lạnh, để 5 phút rồi bổ sung 250 l môi trƣờng LB đã khử
trùng. Sau khi nuôi lắc hỗn hợp 200 vòng/phút trong khoảng 45-60 phút ở
37C với 50-200 l dịch tế bào đã biến nạp đƣợc cấy chải trên môi trƣờng LB
đặc có chứa chất kháng sinh ampicillin, ủ qua đêm ở 37C.
3.2.8.5 Tách chiết DNA plasmid
Mỗi khuẩn lạc biến nạp phát triển trên đĩa thạch đƣợc cấy vào ống
nghiệm chứa 1,5 ml LB lỏng đã bổ sung 0,1% (v/v) ampicillin, nuôi lắc
qua đêm ở 37C, 200 vòng/phút. Tủa tế bào từ 1,5 ml dịch nuôi cấy (ly tâm
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
38
6000 vòng/phút trong 5 phút) đƣợc lắc rung khoảng 30 giây trong 150 l
dung dịch I thành dịch đồng nhất, ủ 15-20 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó,
thêm 150 l dung dịch II vào hỗn hợp và đảo trộn nhẹ, tiếp tục bổ sung
150 l dung dịch III vào hỗn hợp và đảo trộn nhẹ. Hỗn hợp đƣợc bổ sung
450 l dung dịch chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc rung và ly tâm
13.000 vòng/phút trong 10 phút. 450 l pha trên đƣợc hút sang ống mới,
bổ sung 320 l isopropanol, lắc nhẹ và ủ 5 phút ở -80C để tủa DNA plasmid.
Tủa DNA plasmid (ly tâm 15 phút với 13.000 vòng/phút) đƣợc rửa với 500 l
70% ethanol ở 4C để loại muối và isopropanol và đƣợc làm khô trong không
khí ở nhiệt độ phòng. Cuối cùng tủa DNA plasmid đƣợc hòa trong đệm TE
pH 8,0 hoặc nƣớc khử ion vô trùng, phân tích điện di, cắt bằng enzyme
cắt hạn chế để kiểm tra phân đoạn chèn hoặc bảo quản ở -20C [54].
Sau đó, plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene cần tách dòng đƣợc biến
nạp lại vào tế bào E. coli DH5, tách chiết và đƣợc tinh sạch theo protocol:
bổ sung 0,25 l RNase vào dịch chứa plasmid, ủ ở 37ºC trong 1-2 giờ, lấy ra
bổ sung 450 l H2O khử ion và đảo đều hỗn hợp. Tiếp đó, bổ sung 450 l
chloroform/isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 5 phút. Sau khi ly tâm
13.000/phút trong 15-20 phút, dịch nổi đƣợc hút sang ống eppendorf mới và
bổ sung 500 l isopropanol cùng với 30 l dung dịch 3 M CH3COONa.
Hỗn hợp đƣợc ủ ở -20ºC trong 15-20 phút, sau đó lấy ra ly tâm
13000 vòng/phút trong 20 phút để thu tủa. Tủa đƣợc rửa lại 2 lần bằng
70% ethanol. Sau khi tủa đƣợc rửa sạch và làm khô sẽ đƣợc hòa trong 40 l
H2O. Mẫu plasmid tinh sạch đƣợc sử dụng để giải trình tự nucleotide [54].
3.2.8.6 Cắt DNA bằng enzyme cắt hạn chế
DNA plasmid tái tổ hợp đƣợc cắt bằng cặp enzyme cắt hạn chế XbaI và
XhoI trong 2 giờ ở 37C để kiểm tra phân đoạn chèn. Hỗn hợp phản ứng
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
39
gồm: 3 l DNA plasmid tái tổ hợp; 0,25 l enzyme cắt hạn chế mỗi loại; 2 l
đệm Tango Y+; bổ sung nƣớc khử ion đến tổng thể tích 10 l. Sau phản ứng,
sản phẩm cắt đƣợc điện di trên gel 0,8% agarose để kiểm tra.
3.2.8.7 Điệ n di gel agarose
Nguyên lí của phƣơng pháp này là dựa vào đặc tính của DNA là
đại phân tử tích điện âm, dó đó trong môi trƣờng có điện trƣờng, các phân tử
DNA có kích thƣớc khác nhau di chuyển từ cực âm sang cực dƣơng với
tốc độ khác nhau. Bản gel agarose thích hợp cho việc làm giá đỡ phân tách
các phân tử DNA. Điện di DNA hoặc plasmid đƣợc thực hiện trên gel
0,8% (w/v) agarose. Agarose đƣợc pha trong đệm 1x TBE, vi sóng cho
agarose tan hoàn toàn. Sau đó để nguội xuống khoảng 60C và đổ vào khay
điện di đã cài lƣợc sẵn. Khi gel đã đông ổn định thì gỡ lƣợc ra, đặt vào buồng
điện di và tra mẫu. Sau khi chạy điện di xong, bản gel đƣợc lấy ra khỏi khuôn
và nhuộm trong EtBr khoảng 3-5 phút, EtBr có thể cài xen vào trong DNA và
phát sáng dƣới ánh sáng tia cực tím, do đó có thể phát hiện ra sự hiện diện
của DNA.
3.2.8.8 Giải trình tự nucleotide
Sau khi tinh sạch plasmid tái tổ hợp, phân đoạn chèn đƣợc giải trình tự
nucleotide theo nguyên lý của phƣơng pháp Sanger cải tiến dựa trên các
dideoxynucleotide. DNA polymerase xúc tác gắn các deoxynucleotide vào đầu 3‘-OH mạch đơn DNA đang tổng hợp, khi gặp dideoxynucleotide đánh dấu huỳnh quang không có nhóm 3’-OH phản ứng tổng hợp sẽ bị dừng
lại. Kết quả là hỗn hợp sản phẩm sau phản ứng bao gồm các polynucleotide
có kích thƣớc hơn kém nhau một nucleotide và đƣợc phát hiện bằng mẫu dò
huỳnh quang trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3100
Avant Genetic Analyzer. Kết quả đọc trình tự đƣợc phân tích, xử lý
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
40
bằng phần mềm DNAStar để so sánh trình tự nucleotide.
3.2.9 Phƣơng pháp xử lý số liệu
Phần mềm Microsoft Excel đƣợc sử dụng để xử lý số liệu thu đƣợc
trong quá trình thực nghiệm và tính giá trị của các tham số thống kê.
Chƣơng trình DNAstar đƣợc sử dụng để phân tích trình tự nucleotide,
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
41
so sánh trình tự nucleotide và xây dựng cây phân loại chủng nấm nghiên cứu.
4 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS
AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO
4.1.1 Tuyển chọn
Hai mƣơi sáu chủng A. awamori đƣợc nuôi cấy chìm trong môi trƣờng
nuôi cấy cơ bản cho sinh tổng hợp endoglucanase, ở 30ºC, lắc 200 vòng/phút,
sau 96 giờ thu dịch enzyme thô. Sử dụng phƣơng pháp khuếch tán enzyme
trên đĩa thạch để định tính hoạt tính endoglucanase và phƣơng pháp đo hoạt
độ endoglucanase đã chọn đƣợc chủng A. awamori VTCC-F-099 có khả năng
sinh tổng hợp endoglucanase cao nhất trong số 26 chủng A. awamori
nghiên cứu (Hình 3.1, Bảng 3.1). Nhƣ vậy, chủng A. awamori VTCC-F-099
đƣợc chọn để tối ƣu các điều kiện nuôi cấy và tinh sạch, đánh giá tính chất
lý hóa của endoglucanase.
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
42
Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu
Hoạt tính
Hoạt tính
Chủng
Chủng
IU/ml Dhalo (mm)
IU/ml Dhalo (mm)
A. awamori VTCC-F-014
0,42
12,5 A. awamori VTCC-F-261
0,33
27,0
A. awamori VTCC-F-020
0,38
12,5 A. awamori VTCC-F-262
0,33
19,0
A. awamori VTCC-F-061
0,45
15,0 A. awamori VTCC-F-269
0,23
15,5
A. awamori VTCC-F-062
0,46
13,5 A. awamori VTCC-F-270
0,38
9,5
A. awamori VTCC-F-063
0,38
15,0 A. awamori VTCC-F-296
0,34
4,0
A. awamori VTCC-F-064
0,42
18,0 A. awamori VTCC-F-311
0,40
13,0
0,39
14,0
Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori
A. awamori VTCC-F-099 0,51
29,0 A. awamori VTCC-F-312
A. awamori VTCC-F-100
0,45
17,5 A. awamori VTCC-F-347
0,41
15,5
A. awamori VTCC-F-135
0,43
15,5 A. awamori VTCC-F-350
0,48
26,0
A. awamori VTCC-F-207
0,33
15,0 A. awamori VTCC-F-353
0,36
19,0
A. awamori VTCC-F-229
0,47
18,5 A. awamori VTCC-F-356
0,39
15,0
A. awamori VTCC-F-245
0,49
28,0 A. awamori VTCC-F-401
0,46
16,0
A. awamori VTCC-F-259
0,44
14,0 A. awamori VTCC-F-406
0,46
14,5
4.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA
Sản phẩm tách chiết DNA tổng số của chủng A. awamori VTCC-F-099
đƣợc điện di kiểm tra trên gel 0,8% agarose. Kết quả hình 3.2A cho thấy
DNA tƣơng đối sạch, không bị gãy và đủ lƣợng đảm bảo cho các nghiên cứu
nhân dòng và đọc trình tự. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi NL1 và
NL4, sau khi điện di kiểm tra, sản phẩm thu đƣợc có kích thƣớc khoảng hơn
600 bp (Hình 3.2B).
Sản phẩm PCR sau khi đƣợc gắn vào vector pJET 1.2 và biến nạp vào
tế bào E. coli DH5 đã đƣợc tách plasmid và cắt kiểm tra bằng cặp enzyme
cắt hạn chế XbaI và XhoI. Kết quả đã nhận đƣợc một đoạn DNA có
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
43
kích thƣớc khoảng hơn 600 bp (Hình 3.2C).
1
bp bp 1500 1500 1000 1000 750 750 500 500
250 250
614 bp
3000 2000 1500 1000 750 500 250
A
B
C
Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn
DNA tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái
tổ hợp bằng XbaI và XhoI (C). M: Marker.
Plasmid tái tổ hợp có mang đoạn gene mong muốn đã đƣợc tách với số
lƣợng lớn và làm sạch theo protocol của Sambrook và Russell (2001) để đọc
trình tự nucleotide. Đoạn gene 28S rRNA của các chủng nấm sợi nghiên cứu
đƣợc xác định trình tự nucleotide trên máy giải trình tự tự động ABI PRISM
3100 Avant Genetic Analyzer. Đoạn gene 28S rRNA của chủng A. awamori
VTCC-F-099 có chiều dài 614 bp (Bảng 3.2).
So sánh trình tự đoạn gene 28S rRNA của chủng nấm nghiên cứu với
một số trình tự gene 28S rRNA của nấm sợi đã công bố trên GenBank cho
thấy, chủng A. awamori VTCC-F-099 có quan hệ họ hàng gần gũi với một số
đại diện thuộc chi Aspergillus. Phân tích số liệu bằng phần mềm DNAStar
cho thấy chủng A. awamori VTCC-F-099 có độ tƣơng đồng 99,5% với chủng
A. awamori VTCC-F-296 (GQ903327), 96,9% với chủng A. flavus IFM
54306 (AB363745), 96,6% với chủng A. flavus UWFP 570 (AY216669),
96,1% với chủng A. flavipes UWFP 1022 (AY216668). Trình tự đoạn gene
28S rRNA của chủng A. awamori VTCC-F-099 đã đƣợc đăng ký trong
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
44
Genbank với mã số là GQ892590.
Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099
Af 45: Aspergillus flavus IFM 54306 (AB363745); Af 69: A. flavus UWFP
570 (AY216669); Aa 27: A. awamori VTCC-F-296 (GQ903327); Aa 90:
A. awamori VTCC-F-099 (GQ892590); Af 68: A. flavipes UWFP 1022
(AY216668)
4.2 TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE
4.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian
Để đánh giá khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian,
chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 ở
30C, lắc 200 vòng/phút. Dịch canh trƣờng nuôi cấy đƣợc thu ở các thời gian
khác nhau để xác định hoạt tính endoglucanase. Kết quả cho thấy, khả năng
sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 tăng dần từ
24 giờ đến 96 giờ nuôi cấy. Tại thời điểm 96 giờ chủng này sinh tổng hợp
endoglucanase mạnh nhất, hoạt tính đạt 0,55 IU/ml. Sau đó, hoạt tính
endoglucanase giảm dần trong các khoảng thời gian nuôi cấy tiếp theo. Sau
120 giờ nuôi cấy hoạt tính là 0,39 IU/ml, đạt 71% và đến 240 giờ hoạt tính là
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
45
0,33 IU/ml, đạt 60% so với hoạt tính cực đại (Hình 3.4, Bảng 3.3).
Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của
chủng A. awamori VTCC-F-099
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với một số kết quả
nghiên cứu trong nƣớc cũng nhƣ trên thế giới. Theo kết quả nghiên cứu của
một số tác giả trƣớc đây cho thấy, các chủng thuộc Trichoderma harzianam,
Trichoderma spp, Phanerochaete chrysosporium và A. niger sinh tổng hợp
endoglucanase cao nhất sau 96 giờ nuôi cấy với hoạt tính enzyme tƣơng ứng
là 1,88; 1,53; 2,40 và 0,096 IU/ml [18], [41]. Các chủng nấm sợi phân lập từ
rác thải sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 144 giờ nuôi cấy [8], còn ba
chủng nấm sợi thuộc các loài Penicillium pinophinum, P. persicinum,
P. brasilianum có khả năng sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 110-140
giờ nuôi cấy với hoạt tính khoảng 0,4 IU/ml [33], chủng Penicillium sp.
DTQ-HK1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 120 giờ nuôi cấy [10].
Tăng Thị Chính và cs (1999) khi nghiên cứu một số chủng vi khuẩn và
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
46
xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng vi khuẩn
sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48 giờ nuôi cấy, còn các chủng
xạ khuẩn sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất sau 48-72 giờ nuôi cấy [5].
Nhƣ vậy, các chủng nấm sợi thƣờng sinh tổng hợp endoglucanase chậm hơn
so với các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn.
4.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy
Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1,
lắc 200 vòng/phút trong 96 giờ, ở các nhiệt độ khác nhau: 25, 28, 30, 32 và
37C để đánh giá ảnh hƣởng của nhiệt độ môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng
sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm này và tìm ra nhiệt độ nuôi cấy
tối ƣu. Kết quả trên hình 3.5 cho thấy, hoạt tính endoglucanase tăng dần trong
dải nhiệt độ 25C-30C, nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu là 30C, hoạt tính đạt 0,56 IU/ml.
Ở các nhiệt độ cao hơn, hoạt tính endoglucanase lại giảm dần, ở 37C chỉ còn
0,44 IU/ml, đạt 78% so với hoạt tính cực đại (Hình 3.5, Bảng 3.4).
Khi nghiên cứu trên các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt
phân lập từ bể ủ rác thải, Tăng Thị Chính và cs (1999) thấy rằng, các chủng
này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45-55C và có thể
chịu đƣợc nhiệt độ 65-80C [5]. Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hƣơng và cs
(1999) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợp
cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50C [9]. Chủng xạ khuẩn thuộc Actinomyces
griseus có khả năng sinh tổng hợp cellulase tối ƣu ở nhiệt độ 58C [13].
Theo Acharya và cs (2008), các chủng A. niger sinh tổng hợp cellulase mạnh
nhất khi lên men trong điều kiện 28C, pH 4,0-4,5 [18]. Kết quả nghiên cứu
của Trịnh Đình Khá (2006) trên chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 cho thấy,
chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi nuôi cấy trong điều kiện
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
47
30C [10]. Nhƣ vậy, chủng A. awamori VTCC-F-099 là một chủng ƣa ấm và
trong các nhiệt độ khảo sát, nhiệt độ tối ƣu cho khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase là 30C.
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099
4.2.3 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng
Cơ chất với một nồng độ nhất định thƣờng đóng vai trò là chất cảm ứng
cho quá trình sinh tổng hợp một loại enzyme tƣơng ứng. Để xác định khả
năng cảm ứng của cơ chất CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase,
chủng nấm nghiên cứu đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng cơ bản cho sinh tổng
hợp endoglucanase, CMC đƣợc bổ sung với các nồng độ khác nhau:
từ 0,2-4%, sau 96 giờ thu dịch canh trƣờng và xác định hoạt tính
endoglucanase. Kết quả cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase
của chủng A. awamori VTCC-F-099 thay đổi rõ rệt khi nồng độ CMC trong
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
48
môi trƣờng thay đổi. Hoạt tính endoglucanase tăng dần trong dải nồng độ
từ 0-2% CMC, đạt cực đại tại nồng độ 2% (0,81 IU/ml). Sau đó, khi nồng độ
CMC tiếp tục tăng vƣợt quá 2% thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở
nồng độ 3% CMC thì hoạt tính endoglucanase còn khoảng 61% (0,49 IU/ml)
và ở nồng độ 4% hoạt tính chỉ còn 0,42 IU/ml, đạt khoảng 52% so với
hoạt tính khi đạt cao nhất (Hình 3.6, Bảng 3.5). Nhƣ vậy, CMC với nồng độ
2% có vai trò cảm ứng tốt nhất khả năng sinh tổng hợp endoglucanase ngoại
bào của chủng A. awamori VTCC-F-099.
Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099
Khi nghiên cứu chủng Penicillium sp. DTQ-HK1, Trịnh Đình Khá
(2006) thấy rằng, chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 0,5%
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
49
CMC đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy [10].
4.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon
Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MT1
chứa 2% CMC, cao nấm men đƣợc thay thế bằng một số nguồn carbon khác,
ở 30C, lắc 200 vòng/phút, sau 96 giờ. Kết quả cho thấy, khả năng
sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm nghiên cứu khi sử dụng các
nguồn carbon khác nhau có sự sai khác đáng kể. Trong đó, hoạt tính enzyme
này cao nhất khi lõi ngô đƣợc sử dụng làm nguồn carbon thay cho cao nấm
men (0,87 IU/ml), tiếp theo là bã mía (0,75 IU/ml) và glucose (0,70 IU/ml)
(Bảng 3.6). Nhƣ vậy, với mục đích tìm nguồn nguyên liệu sắn có, nhất là
nguồn phế phụ phẩm nông nghiệp thì lõi ngô đƣợc xem là nguồn carbon
thay thế thích hợp cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp
endoglucanase.
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon
Hoạt tính endoglucanase
Nguồn carbon
IU/ml
%
Bã mía
0,75 ± 0,146
86
Cao nấm men
0,65 ± 0,166
74
Glucose
0,70 ± 0,134
80
Lactose
0,28 ± 0,084
32
Lõi ngô
0,87 ± 0,158
100
Mùn cƣa
0,39 ± 0,101
45
Xơ dừa
0,54 ± 0,129
62
Sucrose
0,60 ± 0,019
69
Vỏ cà phê
0,64 ± 0,127
74
Vỏ cám trấu
0,57 ± 0,052
65
Vỏ lạc
0,51 ± 0,026
59
Vỏ quýt
0,65 ± 0,166
74
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
50
Theo một số nghiên cứu trƣớc đây, các chủng nấm mốc sinh tổng hợp
các enzyme thuộc nhóm cellulase mạnh trong những môi trƣờng có
nguồn carbon tự nhiên nhƣ mùn cƣa, bã mía, lõi ngô [18], [50]. Ở một số
chủng Penicillium có khả năng sinh tổng hợp endoglucanase và -glucosidase
mạnh trong môi trƣờng có nguồn cơ chất cellulose tự nhiên còn đối với
nguồn cơ chất là xylan yến mạch và birchwood xylan thì hoạt tính rất thấp
[33]. Chủng Penicillium sp. DTQ-HK1 sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi
Sau khi tìm đƣợc nguồn carbon thay thế thích hợp là lõi ngô, chúng tôi
0,6% rơm đƣợc sử dụng nhƣ một nguồn carbon [10].
tiến hành tối ƣu nồng độ nguồn carbon thay thế trên. Kết quả nghiên cứu cho
thấy, hoạt tính endoglucanase có sự thay đổi đáng kể khi thay đổi nồng độ
lõi ngô trong môi trƣờng nuôi cấy. Trong dải nồng độ khảo sát (0,5-5%) thì
nồng độ lõi ngô thích hợp nhất cho khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của
chủng nấm nghiên cứu là 3%, hoạt tính đạt 0,90 IU/ml (Hình 3.7, Bảng 3.7).
Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
51
endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099
Theo nghiên cứu của một số tác giả thì lõi ngô không chỉ thích hợp cho
khả năng sinh tổng hợp các enzyme thuộc nhóm cellulase mà còn là nguồn cơ
chất cảm ứng cho một số loài vi sinh vật sinh tổng hợp một số enzyme khác
nhƣ xylanase [16], [17].
4.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen
Kết quả khảo sát ảnh hƣởng của các nguồn nitrogen trong môi trƣờng
nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng
A. awamori VTCC-F-099 cho thấy, khả năng sinh tổng hợp endoglucanase
của chủng nấm nghiên cứu khi nuôi trong môi trƣờng có chứa các nguồn
nitrogen khác nhau có sự khác nhau đáng kể. Trong số các nguồn nitrogen
đƣợc khảo sát thì ammonium acetate đƣợc xem là nguồn nitrogen thích hợp
nhất cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase
(4,88 IU/ml) (Bảng 3.8). Đây là một nguyên liệu khá dễ kiếm nên đƣợc chọn
là nguồn nitrogen để thay thế cho các nguồn nitrogen có trong môi trƣờng
cơ bản MT1.
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen
Hoạt tính endoglucanase
Nguồn nitrogen
IU/ml
%
Ammonium acetate Ammonium nitrate Ammonium sulphate Bột cá Bột đậu tƣơng Casein Peptone Urea
4,88 ± 0,129 3,91 ± 0,104 4,19 ± 0,124 4,10 ± 0,118 3,51 ± 0,115 3,44 ± 0,128 3,67 ± 0,105 3,87 ± 0,077
100 80 86 84 72 71 75 79
Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cũng cho thấy, các nguồn
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
52
nitrogen hữu cơ (peptone, cao nấm men và bột đậu tƣơng) thích hợp cho
quá trình sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn
chịu nhiệt [5]. Bột đậu tƣơng cũng là nguồn nitrogen ảnh hƣởng mạnh tới
khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng A. niger RNNL-363 [11]. Nghiên
cứu của Trịnh Đình Khá (2006) cho thấy, chủng Penicillium sp. DTQ-HK1
sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất khi 1,6% bột đậu tƣơng đƣợc sử dụng nhƣ
nguồn nitrogen trong quá trình lên men [10].
Sau khi tìm đƣợc nguồn nitrogen thay thế thích hợp là ammonium
acetate, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ nguồn
nitrogen này đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng nấm
nghiên cứu.
Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh
tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase của chủng nấm
nghiên cứu có sự thay đổi đáng kể khi thay đổi lƣợng amonium acetate trong
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
53
thành phần môi trƣờng. Hoạt tính enzyme tăng nhẹ trong dải nồng độ
0,1-0,25%, sau đó tiếp tục tăng mạnh và đạt cực đại tại 0,3% amonium acetate
(4,97 IU/ml). Tiếp theo, khi nồng độ amonium acetate tiếp tục tăng vƣợt quá
0,3% thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nồng độ 0,35% ammonium
acetate thì hoạt tính endoglucanase là 4,03 IU/ml, đạt 81% và ở nồng độ
0,5% ammonium acetate thì hoạt tính chỉ còn 3,51 IU/ml, đạt 71% so với
hoạt tính enzyme khi đạt cực đại (Hình 3.8, Bảng 3.9).
4.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu
pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu là một trong những yếu tố có ảnh
hƣởng lớn đến tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp các enzyme của
các loài vi sinh vật. Chủng A. awamori VTCC-F-099 đƣợc nuôi cấy trong môi
trƣờng MT1 chứa 2% CMC, 3% lõi ngô, 0,3% ammonium acetate đƣợc điều
chỉnh pH từ 3,0 đến 8,0 bằng các dung dịch HCl/NaOH, lắc 200 vòng/phút, ở
30C, trong 96 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện nhƣ hình 3.9 và bảng 3.10.
Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
54
sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099
Kết quả trên hình 3.9 và bảng 3.10 cho thấy, khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase tăng dần trong dải pH 3,0-6,5, đạt cực đại tại pH 6,5
(5,22 IU/ml). Sau đó, khi pH tiếp tục tăng vƣợt qua pH 6,5 thì hoạt tính
enzyme bắt đầu giảm dần. Ở pH 7 hoạt tính là 4,84 IU/ml, đạt 93% và đến
pH 8 thì hoạt tính enzyme chỉ là 4,57 IU/ml, đạt 88% so với hoạt tính cực đại.
Nhƣ vậy, pH 6,5 là tối ƣu cho chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp
endoglucanase.
Nghiên cứu của Đặng Minh Hằng (1999) trên một số chủng nấm sợi
cho thấy, khả năng sinh tổng hợp cellulase của chúng mạnh nhất trong khoảng
pH 4,5-6,0 [8]. Các chủng A. niger sinh tổng hợp endoglucanase mạnh nhất
trong khoảng pH môi trƣờng ban đầu từ 6,0-7,0 [19]. Trong khi đó, các chủng
vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH
môi trƣờng ban đầu là 8,0 [5].
4.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE
4.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100
Dịch enzyme sau khi đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, đƣợc
đƣa lên cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 với tổng thể tích là 10 ml. Tốc độ
dòng chảy là 25 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi phân đoạn 2 ml.
Kết quả kiểm tra hoạt tính endoglucanase của các phân đoạn (Bảng 3.11)
cho thấy, endoglucanase tập trung ở các phân đoạn từ 6 đến 16. Điện di đồ
hình 3.10 cho thấy, ở các phân đoạn vẫn còn khá nhiều băng protein,
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
55
tuy nhiên xuất hiện một băng protein đậm có khối lƣợng dƣới 35 kDa.
kDa 166
66 45 35
Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch
endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100
(1-5: các phân đoạn 7-11 qua cột sephadex G-100; 6: Marker; 7: dịch
enzyme thô)
4.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE
Những phân đoạn qua cột sephadex G-100 có hoạt tính endoglucanase
cao (phân đoạn 6-16) đƣợc đƣa tiếp lên cột sắc kí trao đổi ion DEAE với tổng
thể tích 12 ml. Tốc độ dòng chảy là 20 ml/giờ. Thu 20 phân đoạn, thể tích mỗi
phân đoạn 2 ml. Kết quả kiểm tra hoạt tính endoglucanase của các phân đoạn
cho thấy, các phân đoạn từ 3 đến 7 có hoạt tính riêng cao hơn hẳn so với các
phân đoạn khác (Bảng 3.12). Các phân đoạn có hoạt tính cao: từ phân đoạn 3
đến phân đoạn 7 đƣợc điện di kiểm tra trên gel 12,5% polyacrylamide.
Điện di đồ hình 3.11 cho thấy, enzyme thu đƣợc ở các phân đoạn trên là
khá sạch. Các phân đoạn trên đều có duy nhất một loại protein có khối lƣợng
phân tử khoảng 32 kDa. Enzyme thu đƣợc có độ sạch 3,08 lần so với
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
56
dịch enzyme thô ban đầu (Bảng 3.13).
Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng
Bƣớc tinh sạch
Hoạt tính endoglucamase
Protein tổng số (mg protein/ml)
Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất thu hồi (%)
IU/ml
IU/mg protein
Dịch thô
16,69
21,19
0,79
1
100
6,30
22,44
0,28
1,06
76
Sắc kí lọc gel Sephadex G-100
0,02
1,19
65,30
3,08
7
Sắc ký trao đổi ion DEAE
kDa 66
Endoglucanase (32 kDa)
45 35 25 18 14
A. awamori VTCC-F-099
Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel
polyacrylamide (1: dịch enzyme thô; 2: marker; 3-7: các phân đoạn 3-7
qua cột DEAE).
4.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE
4.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất
Khi tăng nồng độ cơ chất thì vận tốc phản ứng tăng theo nghĩa là
hoạt tính của enzyme tăng. Tuy nhiên, vận tốc phản ứng đạt cực đại ở một
giới hạn nồng độ cơ chất nhất định, nếu tiếp tục tăng nồng độ cơ chất, có thể
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
57
vận tốc phản ứng lại giảm xuống [4].
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase
từ chủng A. awamori VTCC-F-099
Để khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất CMC đến hoạt tính xúc tác
của endoglucanase, phản ứng đƣợc thực hiện ở nhiệt độ 50C, pH 6,5 với
nồng độ cơ chất từ 0,2-2% CMC. Kết quả cho thấy, hoạt tính endoglucanase
tăng tuyến tính khi tăng nồng độ cơ chất trong dải từ 0,2 đến 1,2% CMC, đạt
cực đại ở nồng độ 1,2% CMC. Sau đó, nồng độ cơ chất tiếp tục tăng vƣợt quá
1,2% CMC thì hoạt tính endoglucanase lại giảm, chỉ đạt 75% so với hoạt tính
cực đại ở nồng độ 1,4% CMC và ở nồng độ 2% CMC thì hoạt tính chỉ bằng
43% so với hoạt tính cực đại (Hình 3.12, Bảng 3.14). Nhƣ vậy, nồng độ
cơ chất 1,2% CMC là tối ƣu cho phản ứng xúc tác của endoglucanase từ
chủng A. awamori VTCC-F-099.
4.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu
Nhiệt độ phản ứng ảnh hƣởng mạnh mẽ đến hoạt tính xúc tác của
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
58
enzyme, mỗi enzyme có một nhiệt độ phản ứng thích hợp. Trong giới hạn
nhiệt độ chƣa làm biến tính enzyme, hoạt tính enzyme tăng khi nhiệt độ tăng.
Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng quá giới hạn thì hoạt tính của enzyme lại giảm.
Để khảo sát nhiệt độ tối ƣu của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-
F-099, phản ứng đƣợc thực hiện ở các nhiệt độ khác nhau từ 30-70C với
nồng độ cơ chất tối ƣu 1,2% CMC pha trong đệm 100 mM potassium
photphate, pH 6,5.
Khi tăng nhiệt độ từ 30 đến 50C, hoạt tính tƣơng đối của
endoglucanase cũng tăng dần từ 42% đến 100%. Sau đó, khi nhiệt độ tiếp
tục tăng vƣợt quá 50C thì hoạt tính endoglucanase lại giảm dần. Ở nhiệt độ
70C hoạt tính chỉ còn 32% so với hoạt tính cực đại (Hình 3.13, Bảng 3.15).
Nguyên nhân có thể do khi nhiệt độ tăng cao đã làm đứt gãy một số
liên kết yếu trong phân tử protein enzyme, làm thay đổi cấu trúc của
phân tử này, đặc biệt là cấu trúc trung tâm hoạt động của enzyme, từ đó
ảnh hƣởng tới hoạt tính xúc tác của enzyme. Nhƣ vậy, nhiệt độ thích hợp
cho phản ứng phân giải cơ chất CMC của endoglucanase từ A. awamori
VTCC-F-099 là 50C, đây là một enzyme ƣa nhiệt. Chủng A. awamori
VTCC-F-099 và endoglucanase của nó có thể đƣợc sử dụng vào một số quá
trình công nghiệp không đòi hỏi điều kiện nhiệt độ quá cao nhƣ công nghiệp
sản xuất thức ăn chăn nuôi, công nghiệp xử lý rác thải, công nghiệp giấy.
Những nghiên cứu trƣớc đây cho thấy, Cellulase của A. niger NRRL-
363 hoạt động mạnh nhất ở 50C [11]; trong khi đó cellulase của A. niger Z10
là 40C [25], còn hoạt tính xúc tác của endoglucanase III từ Trichoderma
reesei đạt cao nhất ở 55C [46]. Theo kết quả nghiên cứu của Kitamoto
và cs (1996), các endoglucanase từ chủng A. oryzae KBN616 hoạt động
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
59
tốt nhất trong dải nhiệt độ 45-55C [43].
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính
endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099
4.4.3 pH phản ứng tối ƣu
Enzyme rất nhạy cảm với pH của môi trƣờng, do đó pH có ảnh hƣởng
rất lớn với tốc độ của phản ứng enzyme. Mỗi enzyme có một trị số pH
thích hợp cho sự hoạt động của nó. Ảnh hƣởng của pH đối với phản ứng
enzyme có thể do nhiều tác dụng khác nhau: pH có thể ảnh hƣởng đến tốc độ
phản ứng enzyme do tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzyme,
nhất là các nhóm hoạt động của enzyme. Để tìm ra khoảng pH tối ƣu cho
hoạt động của endoglucanase từ A. awamori VTCC-F-099, phản ứng giữa
enzyme và cơ chất đƣợc thực hiện ở nhiệt độ tối ƣu 50C, với nồng độ cơ chất
tối ƣu 1,2% CMC pha trong các đệm sodium acetate và potassium phosphate
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
60
có pH thay đổi trong khoảng 4,0-8,0.
Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ
chủng A. awamori VTCC-F-099
Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt tính endoglucanase tăng mạnh
trong khoảng pH 4,0-5,0. Hoạt tính tƣơng đối đạt 17% ở pH 4,0 và đạt tối đa
ở pH 5,0 (4,08 IU/ml). Sau đó, hoạt tính tƣơng đối giảm dần xuống còn 82%
ở pH 5,5 và giảm mạnh xuống 37% ở pH 8,0 (Hình 3.14, Bảng 3.16).
pH thích hợp đối với cellulase từ A. niger RNNL-363 là 5,5 [11]; của
cellulase từ A. niger Z10 là 4,5 và 7,5 [25]. Nhƣ vậy, endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 hoạt động tốt trong dải pH 5,0-5,5 (100-82%),
thuộc loại endoglucanase ƣa acid yếu.
4.4.4 Độ bền nhiệt độ
Hầu nhƣ tất cả các enzyme đều bị biến tính ít nhiều và ảnh hƣởng tới
hoạt tính dƣới tác động của nhiệt độ. Nhiệt độ có thể làm cho một số liên kết
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
61
hydro trong mạng lƣới liên kết hydro tham gia vào việc giữ vững cấu trúc
của enzyme bị đứt gẫy. Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào nhiệt độ cao
hay thấp và thời gian ủ. Để đánh giá độ bền nhiệt của endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099, dịch enzyme tinh sạch đƣợc ủ ở các nhiệt độ khác
nhau trong khoảng 30-70C, sau những khoảng thời gian nhất định hoạt tính
còn lại của enzyme đƣợc xác định.
Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099. (): 30C; (): 40C; (): 50C; (): 60C;
(): 70C
Kết quả trên hình 3.15 và bảng 3.17 cho thấy, hoạt tính endoglucanase
từ chủng A. awamori VTCC-F-099 đều giảm tuyến tính theo thời gian và
nhiệt độ ủ càng cao thì hoạt tính giảm càng mạnh. Sau 24 giờ ủ ở 30C và
40C hoạt tính enzyme giảm nhẹ, hoạt tính tƣơng đối còn 94% và 85%.
Ở 50C hoạt tính tƣơng đối còn 79% sau 24 giờ ủ và giảm mạnh sau 36 giờ ủ,
còn ở 70C hoạt tính giảm mạnh chỉ sau 6 giờ ủ. Nhƣ vậy, enzyme
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
62
nghiên cứu tƣơng đối bền ở dải nhiệt độ 30-50C, có thể bảo quản ở nhiệt độ
phòng và ứng dụng trong một số quá trình công nghiệp không đòi hỏi nhiệt độ
quá cao nhƣ công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy, công nghiệp sản xuất
thức ăn cho vật nuôi, công nghiệp xử lý rác thải.
4.4.5 Độ bền pH
Do pH môi trƣờng có ảnh hƣởng đến độ bền của protein enzyme nên
việc lựa chọn đệm có pH thích hợp để bảo quản enzyme là rất quan trọng. Ở
đây, độ bền của endoglucanase đƣợc khảo sát trong các đệm sodium acetate
với dải pH 3,5-5,5 và đệm potassium phosphate với dải pH 6,0-8,0. Sau 2 giờ
ủ với đệm ở 37C, hoạt tính enzyme đƣợc xác định.
Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099
Kết quả nhƣ hình 3.16 và bảng 3.18 cho thấy, sau 2 giờ ủ,
endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 bền trong dải pH 4,0-6,0
(đệm acetate pH 4,0-5,5; đệm phosphate pH 6,0). Hoạt tính enzyme sau khi ủ
với các đệm có pH 4,0-6,0 giảm không đáng kể, thậm chí hoạt tính còn tăng
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
63
nhẹ sau khi ủ với đệm acetate pH 4,5-5,5.
Tiếp theo, đệm sodium acetate pH 4,0-5,5 và potassium phosphate
pH 6,0 trong số các pH thích hợp cho endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 đƣợc chọn để tiếp tục khảo sát độ bền pH của
enzyme nghiên cứu theo thời gian. Kết quả cho thấy, hoạt tính endoglucanase
đƣợc duy trì khá tốt trong đệm sodium acetate pH 4,5-5,5. Sau 24 giờ ủ,
hoạt tính tƣơng đối giảm không quá 20% so với nhóm đối chứng (Hình 3.17,
Bảng 3.19). Nhƣ vậy, đệm sodium acetate pH 4,5-5,5 thích hợp để duy trì
hoạt tính endoglucanase trong quá trình bảo quản.
Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 theo thời gian (): pH 4; (): pH 4,5; ():
pH 5,0; (): pH 5,5; (×): pH 6,0
4.4.6 Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ
Dung môi hữu cơ ảnh hƣởng lớn đến hoạt tính của enzyme. Khi thêm
dung môi hữu cơ vào dung dịch enzyme sẽ làm giảm hằng số điện môi
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
64
của dung dịch, làm tăng lực hút tĩnh điện giữa các phân tử protein [14].
Để khảo sát ảnh hƣởng của các dung môi hữu cơ, dịch enzyme đƣợc ủ
cùng các dung môi hữu cơ với các nồng độ khác nhau ở 37C. Sau 2 giờ,
hoạt tính còn lại đƣợc xác định. Kết quả cho thấy, cả 4 dung môi hữu cơ ở
tất cả các nồng độ khảo sát đều có ảnh hƣởng ức chế hoạt động của
endoglucanase, trong đó ethanol làm hoạt tính endoglucanase giảm mạnh
nhất. Sau 2 giờ ủ với 30% (v/v) ethanol ở 37C, hoạt tính tƣơng đối
của endoglucanase giảm chỉ còn 53% so với nhóm đối chứng (Hình 3.18,
Bảng 3.20). Nhƣ vậy, ethanol là dung môi hữu cơ làm ức chế mạnh nhất và
acetone là dung môi ức chế yếu nhất hoạt tính endoglucanase trong 4
dung môi hữu cơ khảo sát.
Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase
từ chủng A. awamori VTCC-F-099. (): 0%; (): 10%; (): 20%; (): 30%;
Act: Acetone; BtOH: n-Butanol; EtOH: Ethanol; IsoOH: Isopropanol; MtOH:
Methamol.
4.4.7 Ảnh hƣởng của ion kim loại
Để đánh giá ảnh hƣởng của các ion kim loại đến hoạt tính
endoglucanase, dịch enzyme đƣợc thêm vào các ion kim loại khác nhau
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
65
với nồng độ 5, 10 và 15 mM. Sau 2 giờ ủ ở 37C hoạt tính endoglucanase còn
lại đƣợc xác định và so sánh với mẫu đối chứng. Kết quả đƣợc thể hiện
nhƣ bảng 3.21
Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại
Kim loại
Hoạt tính endoglucanase sau 2 giờ ủ (%)
Nồng độ (mM)
5
10
15
74
70
43
97
95
90
99
96
79
Ag+ Ca 2+ Co 2+ Cu 2+
126
137
148
146
153
155
129
120
107
92
86
87
70
63
54
96
93
74
EDTA Fe 2+ K+ Mn 2+ Ni 2+ Zn 2+
94
79
78
Kết quả trên bảng 3.21 cho thấy, tính chất và mức độ ảnh hƣởng của
các ion kim loại đối với hoạt tính của endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 là khác nhau. Một số ion kim loại (Fe2+, Cu2+) và EDTA làm
tăng nhẹ hoạt tính enzyme. Khi nồng độ các ion trên thay đổi thì hoạt tính của
endoglucanase cũng thay đổi theo các chiều hƣớng khác nhau. Khi nồng độ Cu2+ và EDTA tăng từ 5 mM lên 15 mM thì hoạt tính enzyme tƣơng đối cũng tăng tƣơng ứng từ 126% lên 148% (đối với Cu2+), từ 146% lên 155% (đối với EDTA). Trong khi đó, khi nồng độ của Fe2+ tăng từ 5 mM lên 15 mM thì
hoạt tính tƣơng đối của enzyme lại giảm từ 129% xuống còn 107%.
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
66
Ngƣợc lại, các ion kim loại khác (Ag+, Ca2+, Co2+, K+, Mn2+, Ni2+, Zn2+) lại làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme nghiên cứu với các mức độ
khác nhau. Ở nồng độ thấp, các ion Ca2+, K+, Co2+, Ni2+, Zn2+ làm giảm nhẹ
hoạt tính xúc tác của endoglucanase. Khi nồng độ các ion này càng tăng, hoạt tính enzyme giảm càng mạnh. Riêng ion Ag+ và Mn2+ làm ức chế rõ rệt
hoạt tính endoglucanase. Ở nồng độ 15 mM, hoạt tính tƣơng đối chỉ đạt 43% (đối với Ag+) và 54% (đối với Mn2+) so với mẫu đối chứng.
4.4.8 Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa
Một số loại chất tẩy rửa có đặc tính hoạt động bề mặt nên khi đƣợc ủ
cùng enzyme sẽ làm ảnh hƣởng đến cấu trúc và hoạt động của enzyme.
Để đánh giá ảnh hƣởng của chất tẩy rửa tới hoạt tính endoglucanase, dịch
enzyme đƣợc ủ cùng các dung dịch chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, SDS,
Triton X-100) ở các nồng độ khác nhau từ 0,5; 1,0; 1,5; 2%. Sau 2 giờ ủ ở
37C hoạt tính còn lại đƣợc xác định.
Kết quả nghiên cứu thể hiện ở hình 3.19 và bảng 3.22 cho thấy, các
chất tẩy rửa trên đều có ảnh hƣởng ức chế hoạt động xúc tác của enzyme
nghiên cứu. tween 20 ở nồng độ 0,5-1,0% ảnh hƣởng yếu đến hoạt tính
endoglucanase. Hoạt tính tƣơng đối giảm còn 90-78% so với đối chứng sau
khi ủ enzyme cùng với 0,5-1% (v/v) Tween 20. Ở nồng độ 1,5-2% Tween 20,
hoạt tính tƣơng đối chỉ còn 75-61%. Tween 80 làm giảm hoạt tính
endoglucanase từ 83 xuống 64% khi tăng nồng độ từ 0,5 lên 2%.
Triton X-100 làm giảm mạnh hoạt tính từ 82 xuống 59% so với đối chứng khi
tăng nồng độ từ 0,5-2%. Riêng đối với SDS, thì hoạt tính endoglucanase bị ức
chế rõ rệt. Nồng độ SDS càng cao thì hoạt tính tƣơng đối càng giảm, ngay ở
nồng độ rất thấp 0,5% hoạt tính chỉ đạt 45% còn ở nồng độ cao 2%
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
67
thì hoạt tính chỉ còn 16% so với đối chứng.
Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099. (): 0%; (): 0,5%; (): 1%; (): 1,5%; (): 2%.
Thƣờng SDS ức chế rất mạnh hoạt động của enzyme nói chung do có
khả năng hình thành một lớp điện tích âm xung quanh phân tử protein enzyme
và làm thay đổi cấu trúc của phân tử enzyme. Do đó, enzyme mất khả năng
liên kết và phân giải cơ chất. Khi nghiên cứu ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa
trên tới hoạt tính xúc tác của cellulase từ chủng Penicillium sp. DTQ-HK1,
Trịnh Đình Khá (2006) cũng thấy rằng cả 4 chất trên đều là chất ức chế
hoạt động của cellulase. Trong đó, SDS là chất ức chế mạnh nhất, hoạt tính
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
68
enzyme giảm xuống còn 18% sau khi ủ với 2% SDS trong 2 giờ ở 37ºC [10].
5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
KẾT LUẬN
1. Chủng Aspergillus awamori VTCC-F-099 có khả năng sinh tổng hợp
endoglucanase cao nhất trong số 26 chủng A. awamori đƣợc khảo sát.
Chủng này đƣợc định loại bằng chỉ thị gene 28S rRNA. Trình tự
nucleotide đoạn gene 28S rRNA của chủng này đã đƣợc đăng ký
trong GeneBank với mã số GQ892590.
2. Chủng A. awamori VTCC-F-099 sinh tổng hợp endoglucanase mạnh
nhất sau 96 giờ nuôi cấy trong môi trƣờng MT1 pH 6,5, lắc
200 vòng/phút ở 30C. Nồng độ cơ chất cảm ứng tối ƣu là 2% CMC,
nguồn carbon và nitrogen thích hợp là lõi ngô (3%) và
ammonium acetate (0,3%).
3. Đã tinh sạch đƣợc endoglucanase có khối lƣợng phân tử khoảng 32 kDa
từ chủng A. awamori VTCC-F-099 bằng phƣơng pháp sử dụng kết hợp
cột sắc ký lọc gel sephadex-G100 và cột sắc ký trao đổi ion DEAE.
Hiệu suất thu hồi endoglucanase khoảng 7%, độ sạch 3,1 lần.
4. Nhiệt độ và pH phản ứng tối ƣu của endoglucanase từ chủng
A. awamori VTCC-F-099 là 50C và 5,0. Enzyme này bền trong dải
nhiệt độ 30-50C và dải pH 4,5-5,5. Ở các nồng độ 5 mM, 10 mM,
15 mM hoạt tính endoglucanase đều tăng nhẹ dƣới ảnh hƣởng của các ion kim loại: Fe2+, Cu2+ và EDTA. Ngƣợc lại, các ion Ag+, Ca2+, Co2+, K+, Mn2+, Ni2+, Zn2+ làm hoạt tính endoglucanase giảm. Đặc biệt là Ag+
làm hoạt tính endoglucanase giảm mạnh, chỉ còn 43% ở nồng độ
15 mM sau 2 giờ ủ ở 37C. Các dung môi: acetone, ethanol, methanol,
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
69
iso propanol và n-butanol đều làm giảm hoạt tính endoglucanase.
Đặc biệt, dung môi 30% methanol làm hoạt tính endoglucanase
giảm mạnh, còn 52% sau khi ủ 2 giờ ở 37C. Các chất tẩy rửa khảo sát
đều làm giảm hoạt tính xúc tác của endoglucanase. Đặc biệt là SDS
làm giảm mạnh hoạt tính enzyme, chỉ còn 20% sau khi ủ với 2% SDS
trong 2 giờ ở 37C.
KIẾN NGHỊ
1. Thử nghiệm lên men lƣợng lớn với các nguồn cơ chất sẵn có, rẻ tiền
nhƣ: lõi ngô, bột giấy, bột đầu cá, bột đỗ tƣơng.
2. Tối ƣu quy trình tách chiết lƣợng lớn endoglucanase từ môi trƣờng
nuôi cấy.
3. Nhân dòng, biểu hiện gene mã hóa endoglucanase, xây dựng quy trình
sản xuất enzyme tái tổ hợp.
4. Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi, nâng cao
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
70
chất lƣợng của vật nuôi.
6 TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê
Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc
(1999), Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose cao để nâng
cao chất lƣợng phân hủy rác thải sinh hoạt và nông nghiệp. Báo cáo
khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và
Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551.
2. Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lƣơng Thùy Dƣơng (2002),
"Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu các chủng nấm men có khả năng
phân giải cellulose nhằm ứng dụng trong xử lý bã thải hoa quả làm thức
ăn chăn nuôi." Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng, 2: 34-36.
3. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (2006), Danh mục thức ăn
chăn nuôi, nguyên liệu thức ăn chăn nuôi đƣợc nhập khẩu vào Việt
Nam. Số 01/2006/QĐ-BNN.
4. Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2006), Enzyme và ứng dụng,
Nxb Giáo dục.
5. Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999), Nghiên cứu sản xuất
cellulase của một số chủng vi sinh vật ƣu nhiệt phân lập từ bể ủ rác
thải. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 790-797.
6. Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (2003), Khảo sát quá trình cảm ứng
enzyme chitinase và cellulase của Trichoderma harzianum ảnh hƣởng
của hai enzyme này lên nấm bệnh Sclerotium rolfsii. Báo cáo khoa học,
Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật,
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
71
Hà Nội: 321-324.
7. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn
Vĩnh Phƣớc, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty
(1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật tập 2 và 3, Nxb
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội.
8. Đặng Minh Hằng (1999), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến khả
năng sinh tổng hợp cellulase của một số chủng vi sinh vật để xử lý rác.
Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa
học và Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339.
9. Nguyễn Lan Hƣơng, Hoàng Đình Hòa (2003), Hệ vi khuẩn có hoạt tính
thủy phân tinh bột, protein, cellulose hoặc dầu ô lƣu trong quá trình
phân hủy chất thải hữu cơ. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh
học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 288-291.
10. Trịnh Đình Khá (2006), Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh
tổng hợp cellulase và đánh giá tính chất lý hóa của cellulase. Luận văn
Thạc sỹ Khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học
Quốc Gia Hà Nội.
11. Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003),
Khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của Aspergillus niger
RNNL-363. Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học
toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307.
12. Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999), Tuyển chọn
một số chủng xạ khuẩn có khả năng phân giải cellulose từ mùn rác.
Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb
Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 177-182.
13. Nguyễn Đức Lƣợng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999), Khả năng sinh tổng
hợp cellulase của Actinomyces griseus. Báo cáo khoa học, Hội nghị
Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội:
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
72
804-809.
14. Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn
Xuân Sâm (2004), Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học và Kỹ thuật,
Hà Nội.
15. Hồ Sỹ Tráng (2006), Cơ sở hóa gỗ và cellolose tập 2, Nxb Khoa học và
Kỹ thuật: 7-14.
16. Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi (2008), "Tối ƣu
một số điều kiện nuôi cấy chủng nấm Aspergillus oryzae DSM1863 và
Aspergillus niger DSM1957 sinh tổng hợp xylanase", Tạp chí
Công nghệ Sinh học, 6(3): 349-355.
Tài liệu tiếng Anh
17. Achary A, Prapulla S (2008), "Corncob-Induced endo-β-D-1,4 xylanase
of Aspergillus oryzae MTCC 5154: Production and characterization of
xylobiose from glucuronoxylan", J Agric Food Chem, 56(11):
3981-3988.
18. Acharya P, Acharya D, Modi H (2008), "Optimization for cellulase
production by Aspergillus niger using saw dust as substrate",
Afr J Biotechnol, 7(22): 4147-4152.
19. Akiba S, Kimura Y, Yamamoto K, Kumagai H (1995), "Purification
and characterizationof a protease-resistant cellulase from Aspergillus
niger", J Ferment Bioeng, 79(2): 125-130.
20. Bagnara C, Gaudin C, Bélaïch JP (1987), "Physiological properties of
Cellulomonas fermentans, a mesophilic cellulolytic bacterium",
Appl Microbiol Biotechnol, 26: 170-176.
21. Bagnara C, Toci R, Gaudin C, Bélaïch JP (1985), "Isolation and
characterization of a cellulolytic microorganism, Cellulomonas
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
73
fermentans, sp. nov", J Syst Bacteriol, 35: 502-507.
22. Bergquist PL, Gibbs MD, Morris DD, Teo VSJ, Saul DJ, Morgan HW
(1999), "Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and
hemicellulolytic bacteria", FEMS Microbiol Ecol, 28: 99-110.
23. Campillo ED (1999), "Multiple endo-1,4--D-glucanase (cellulase)
genes in Arabidopsis", Curr Top Dev Biol, 46: 39-61.
24. Cheryan MS, Shah PM, Witjitra K (1997), "Production of acetic acid
by Clostridium thermoaceticum", Adv Appl Microbiol, 43: 1-33.
25. Coral G, Arikan B, Unaldi M, Guvenmes H (2002), "Some properties
of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type
Strain", Turk J Biol, 26: 209-213.
26. Dahot MU, Noomrio MH (1996), "Microbial production of cellulases
by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source",
J Islamic Acad Sci, 9(4): 119-124.
27. Das M, Prasad J, Ahmad S (1997), "Endoglucanase production by
paper-degrading mycoflora", Appl Microbiol, 25: 313-315.
28. Dürre P (1998), "New insights and novel developments in clostridial
acetone/butanol/isopropanol fermentation", Appl Microbiol Biotechnol,
49: 639-648.
29. Gao J, Weng H, Xi Y, Zhu D, Han S (2008), "Purification and
characterization of a novel endo-β-1,4-glucanase from
thermoacidophilic Aspergillus terreus", Biotechnol Lett, 30: 323-327.
30. Gielkens M, Dekker E, Visser J, Graaff L (1999), "Two
cellubiohydrolase-encoding genes from Aspergillus niger require D-
Xylose and the xylanolytic transcriptional activator XlnR for their
expression", Appl Environ Microbiol, 65(10): 4340-4345.
31. Gilkes NR, Henrissat B, Kilburn DG, Miller RC, Warren RAJ (1991),
"Domains in microbial 1,4-glycanases: sequence conservation,
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
74
function, and enzyme families", Microbiol Rev, 55: 303-315.
32. Gordon R, Haynes W, Pang C (1973), The genus Bacillus, Agriculture
handbook, Washington DC.
33. Henning J, Morkeberg A, Krogh KBR, Olsson L (2005), "Production of
cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of
substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary
electrophoresis", Enzyme Microb Technol, 36: 42-48.
34. Henriksson G, Nutt A, Henriksson H, Pettersson B, Stahlberg J,
Johansson G, Pettersson G (1999), "Endoglucanase 28 (Cel12A), a new
Phanerochaete chrysosporium cellulase", Eur J Biochem, 259: 88-95.
35. Henrissat B, Claeyssens M, Tomme P, Lemesle L, Mornon JP (1989),
"Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis", Gene,
81(1): 83-95.
36. Hong J, Tamaki H, Akiba S, Yamamoto K, Kumaga H (2001),
"Cloning of a gene encoding a highly stable endo-1,4-glucanase from
Aspergillus niger and its expression in yeast", J Biosci Bioeng, 92(5):
434-441.
37. Howard RL, Abotsi E, van Rensburg ELJ, Howard S (2003),
"Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme
production", Afr J Biotechnol, 2(12): 602-619.
38. Hsu CK, Liao JW, Chung YC, Hsieh CP, Chan YC (2004),
"Xylooligosaccharides and fructooligosaccharides\ affect the intestinal
micro biota and precancerous colonic lesion development in rats",
J Nutr, 134: 1523-1528.
39. Kang S, Ko E, Lee J, Kim S (1999), "Over production of β-glucosidase
by Aspergillus niger mutant from lignocellulsic biomass", Biotechnol
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
75
Lett, 21: 647-650.
40. Karisson J, Saloheimo M, Siika-aho M, Tenkanen M, Penttilä M,
Tjerneld F (2001), "Homologous expression and characterization of
Cel61A (EG IV) of Trichoderma reesei", Eur J Biochem, 268: 6498-
6507.
41. Khan M, Ali S, Fakhru’l-Razi A, Alam M (2007), "Use of fungi for the
bioconversion of rice straw into cellulase enzyme", J Environ Sci
Health Part B, 42: 381-386.
42. Kim BH (1987), "Carbohydrate catabolism in cellulolytic strains of
Cellulomonas, Pseudomonas, and Nocardia", Korean J Microbiol, 25:
28-33.
43. Kitamoto N, Go M, Shibayama T, Kimura T, Kito Y, Ohmiya K,
Tsukagoshi N (1996), "Molecular cloning, purification and
characterization of two endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus oryzae
KBN616", Appl Microbiol Biotechnol, 46: 538-544.
44. Laemmli U (1970), "Clevage of structure proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4", Nature, 227: 680-685.
45. Lee RL, Weimer PJ, Zyl WH, Pretorius IS (2002), "Microbial cellulose
utilization: fundamentals and biotechnology", Microbiol Mol Biol Rev,
66: 506–577.
46. Macarrón R, Acebal C, Castiilón MP, Domínguez JM, Manta IDL
(1993), "Mode of action of endoglucanase III from Trichoderma
reesei", Biochem J, 289: 867-873.
47. Miller G (1959), "Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination
of reducing sugars", Anal Chem, 31: 426-428.
48. Nakakuki T (2003), "Development of functional oligosaccharides in
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
76
Japan", Trends Glycosci Glycotechnol, 15(82): 57-64.
49. Narasimha G, sridevi A, Buddolla V, Subhosh C, Rajsekhar R (2006),
"Nutrient effect on production of cellulolytic enzymes by Aspergillus
niger", Afr J Biotechnol, 5(5): 472-476.
50. Ojumu T, Solomon B, Betiku E, Layokun S, Amigun B (2003),
"Cellulase production by Aspergillus flavus Linn isolate NSPR 101
fermented in sawdust, bagasse and corncob", Afr J Biotechnol, 2(6):
150-152.
51. Ole K, Borchert TV, Fuglsang CC (2002), "Industrial enzyme
applications", Curr Opin Biotech, 13: 345-351.
52. Omogbenigun OF, Nyachoti CM, Slominski BA (2004), "Dietary
supplementation with multienzyme preparations improves nutrient
utilization and growth performance in weaned pigs", J Anim Sci, 82:
1053-1061.
53. Palonen H, Tenkanen M, Linder M (1999), "Dynamic interaction of
Trichoderma reesei cellobiohydrolases Cel6A and Cel7A and cellulose
at equilibrium and during hydrolysis", Appl Environ Microbiol, 65:
5229-5233.
54. Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular Cloning: A Laboratory
Manual.
55. Sandgren M, Gualfetti PJ, Christian P, Sigrid P, Shaw A, Gross LS,
Saldajeno M, Berglund GI, Jones TA, Mitchinson C (2003), "The
Humicola grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 Å resolution and the
impact of its free cysteine residues on thermal stability", Protein Sci,
12: 2782-2793.
56. Sang JH, Yong JY, Hyen SK (1995), "Characterization of
a bifunctional cellulase and its structural gene. The cel gene of
Bacillus sp. D04 has exo- and endoglucanase activity", J Biol Chem,
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
77
270: 26012-26019.
57. Sharma VK, Hagen JC (1995), "Isolation and characterization of
Clostridium hobsonii comb. nov", Biores Technol, 51: 61-74.
58. Siddiqui K, Shemsi A, Anwar M, Rashid M, Rajoka M (1998), "Partial
and coplete alteration of surface charges of carboxymethylcellulase by
chemical modification: thermostabilization in water-miscible organic
solvent", Enzyme Microbiol Technol, 24: 599-608.
59. Takada G, Kawasaki M, Kitawaki M, Kawaguchi T, Sumitani J-I,
Izumori k, Arai M (2002), "Cloning and trascription analysis of the
Aspergillus aculeatus No. F-50 endoglucanase 2 (cmc2) gene", Biosci
and Bioeng, 94(5): 482-485.
60. Takashima S, Nakamura A, Hidaka M (1998), "Isolation of the creA
gene from the cellulolytic fungus Humicola grisea and analysis of
CreA binding sites upstream from the cellulase genes", Biosci
Biotechnol Biochem, 62: 2364-2370.
61. Wachinger G, Bronnenmeier K, Staudenbauer WL, Schrempf H (1989),
"Identification of mycelium-associated cellulase from Streptomyces
reticuli", Appl Environ Microbiol, 55: 2653-2657.
62. Watanabe H, Tokuda G (2001), "Animal cellulases", Cell Mol Life Sci,
58: 1167-1178.
63. Xu B, Janson JC, Sellos D (2001), "Cloning and sequencing of
a molluscan endo--1,4-glucanase gene from the blue mussel, Mytilus
edulis", Eur J Biochem, 268: 3718-3727.
64. Yasuda K, Roneker KR, Miller DD, Welch RM, Lei XG (2006),
"Supplemental dietary Inulin affects the bioavailability of Iron in corn
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
78
and soybean meal to young pigs", J Nutr, 136: 3033-3038.
PHỤ LỤC
Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng A. awamori
VTCC-F-099
Vị trí
Trình tự nucleotide GCATATCAAT AAGCGGAGGA AAAGAAACCA ACCGGGATTG CCTCAGTAAC GGCGAGTGAA GCGGCAAGAG CTCAAATTTG AAAGCTGGCT CCTTCGGAGT CCGCATTGTA ATTTGCAGAG GATGCTTTGG GTGCGGCCCC CGTCTAAGTG CCCTGGAACG GGCCGTCAGA GAGGGTGAGA ATCCCGTCTT GGGCGGGGTG TCCGTGCCCG TGTAAAGCTC CTTCGACGAG TCGAGTTGTT TGGGAATGCA GCTCTAAATG GGTGGTAAAT TTCATCTAAA GCTAAATACT GGCCGGAGAC CGATAGCGCA CAAGTAGAGT GATCGAAAGA TGAAAAGCAC TTTGAAAGGA GAGTTAAACA GCACGTGAAA TTGTTGAAAG GGAAGCGCTT GCGACCAGAC TCGCCCGCGG GGTTCAGCCG GCATTCGTGC CGGTGTACTT CCCCGTGGGC GGGCCAGCGT CGGTTTGGGC GGCCGGTCAA AGGCCCCTGG AATGTAGTGC CCTCCGGGGC ACCTTATAGC CAGGGGTGCA ATGCGGCCAG CCTGGACCGA GGAACGCGCT TCGGCACGGA CGCTGGCATA ATGGTCGTAA ACGACCCGTC TTGAAACACG GACC 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400 440 480 520 560 600 614
Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian
Hoạt tính endoglucanase
Thời gian (giờ)
OD1
OD2
OD3
IU/ml
% 74 89 91
24 48 72
0,30 0,39 0,39
0,31 0,38 0,39
0,31 0,41 ± 0,002 0,38 0,49 ± 0,006 0,39 0,49 ± 0,002
96 120 144 168 192 216 240
0,45 0,28 0,27 0,21 0,23 0,22 0,22
0,43 0,30 0,26 0,30 0,23 0,29 0,24
0,44 0,55 ± 0,012 100 71 0,29 0,39 ± 0,008 66 0,26 0,36 ± 0,002 64 0,25 0,35 ± 0,043 60 0,23 0,33 ± 0,001 64 0,25 0,35 ± 0,036 60 0,23 0,33 ± 0,011
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
79
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy
Hoạt tính endoglucanase
OD1
OD2
OD3
IU/ml
Nhiệt độ (C) 25 28 30 32 37
0,21 0,33 0,47 0,40 0,33
0,21 0,34 0,49 0,38 0,34
% 56 0,25 0,32 ± 0,003 78 0,35 0,44 ± 0,013 0,41 0,56 ± 0,045 100 88 0,39 0,50 ± 0,007 78 0,34 0,44 ± 0,007
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng
Hoạt tính endoglucanase
Nồng độ CMC (%) OD1
OD2
OD3
% IU/ml 0,05 0,15 ± 0,023 19 0,08 0,18 ± 0,021 22 0,16 0,27 ± 0,035 34 0,51 0,64 ± 0,020 79 0,63 0,75 ± 0,010 93 0,71 0,81 ± 0,056 100 0,48 0,58 ± 0,005 72 0,38 0,49 ± 0,006 61 0,32 0,42 ± 0,003 52 0,32 0,42 ± 0,002 52
0,09 0,11 0,16 0,52 0,63 0,62 0,47 0,38 0,32 0,32
0 0,2 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
0,05 0,07 0,22 0,55 0,65 0,73 0,47 0,39 0,32 0,32
Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô
Hoạt tính endoglucanase
Lõi ngô (%)
OD1
OD2
OD3
IU/ml
0,44 0,54 0,60 0,41 0,41 0,53 0,34 0,38 0,38 0,22
0,58 0,49 0,70 0,58 0,60 0,78 0,65 0,60 0,54 0,42
0,53 0,97 0,71 0,79 0,94 1,01 0,83 0,80 0,70 0,64
% 0,65 ± 0,067 70 0,78 ± 0,263 87 0,79 ± 0,058 88 0,71 ± 0,186 79 0,76 ± 0,269 85 0,90 ± 0,238 100 0,72 ± 0,251 81 0,71 ± 0,208 79 0,65 ± 0,159 73 0,53 ± 0,211 60
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
80
Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate
Hoạt tính endoglucanase
Ammonium acetate (%) OD1
OD2
OD3
IU/ml
% 0,28 0,21 0,25 3,44 ± 0,038 69 0,30 0,23 0,25 3,58 ± 0,039 72 0,30 0,27 0,28 3,86 ± 0,014 78 0,31 0,32 0,35 4,25 ± 0,023 85 0,39 0,34 0,44 4,97 ± 0,050 100 0,34 0,26 0,31 4,03 ± 0,040 81 0,29 0,28 0,30 3,90 ± 0,012 78 0,27 0,28 0,28 3,74 ± 0,001 75 0,24 0,26 0,27 3,51 ± 0,012 71 0,24 0,24 0,26 3,40 ± 0,011 68
0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0,50 0,55
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu
Hoạt tính endoglucanase
OD1
OD2
OD3
pH
IU/ml
0,26 0,32 0,34 0,36 0,37 0,38 0,39 0,42 0,38 0,37 0,36
0,33 0,34 0,35 0,38 0,40 0,41 0,42 0,46 0,42 0,40 0,40
0,23 0,26 0,31 0,32 0,33 0,33 0,36 0,37 0,34 0,30 0,31
% 3,67 ± 0,051 70 4,05 ± 0,042 78 4,34 ± 0,021 83 4,58 ± 0,030 88 4,71 ± 0,036 90 4,79 ± 0,040 92 4,93 ± 0,030 94 5,22 ± 0,047 100 4,84 ± 0,040 93 4,62 ± 0,051 88 4,57 ± 0,048 88
3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
Hoạt tính endoglucanase
Phân đoạn
Phân đoạn
IU/ml 1,79 1,83 2,01 4,02 4,89 4,52 4,58 7,21
IU/mg protein 213,71 169,95 183,17 330,37 288,36 149,94 78,66 109,57
IU/ml 6,66 6,81 6,57 6,46 4,03 3,70 2,70 2,14
IU/mg protein 80,07 82,83 87,70 106,64 72,49 93,57 103,29 224,31
11 12 13 14 15 16 17 18
3 4 5 6 7 8 9 10
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 Hoạt tính endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase
Phân đoạn
Phân đoạn
IU/ml 0,76 0,73 0,82 1,53 1,30 1,13 1,07 1,78
IU/mg protein 79,74 56,86 55,75 71,65 62,10 57,80 56,16 57,59
3 4 5 6 7 8 9 10
IU/ml 2,01 1,91 1,91 1,62 1,01 0,98 0,60 0,49
IU/mg protein 48,75 43,89 40,60 34,68 23,12 30,99 24,09 24,49
11 12 13 14 15 16 17 18
Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE
Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase
CMC (%)
(IU/mg protein) 84,15 ± 0,005 119,71 ± 0,007 179,43 ± 0,008 260,87 ± 0,010 295,95 ± 0,013 377,49 ± 0,060 283,28 ± 0,021 232,33 ± 0,009 173,19 ± 0,006 163,45 ± 0,006
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
% 22 32 48 69 78 100 75 62 46 43
Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase
Nhiệt độ
(IU/mg protein) 45,37 ± 0,005 60,67 ± 0,025 93,11 ± 0,004 95,35 ± 0,001 109,09 ± 0,004 64,95 ± 0,006 50,85 ± 0,001 45,76 ± 0,003 34,65 ± 0,004
30 37 40 45 50 55 60 65 70
% 42 56 85 87 100 60 47 42 32
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
82
Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase
Nhiệt độ
4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
% 17 64 100 82 52 42 40 36 37
(IU/mg protein) 37,87 ± 0,009 144,65 ± 0,002 226,68 ± 0,002 184,88 ± 0,007 118,54 ± 0,005 95,25 ± 0,004 90,58 ± 0,003 82,20 ± 0,072 84,54 ± 0,010
Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase
Nhiệt độ Thời gian (giờ)
(IU/mg protein)
%
ĐC 30
0 6 12 24 36 48 60 72 6 12 24
410,23 ± 0,005 399,02 ± 0,001 388,99 ± 0,008 385,77 ± 0,004 382,75 ± 0,002 285,43 ± 0,004 258,34 ± 0,001 236,23 ± 0,006 368,43 ± 0,007 355,86 ± 0,001 346,61 ± 0,005
40
100 97 95 94 93 70 63 58 90 87 84 77 68 62
36 48 60 72 6 12 24
314,85 ± 0,006 277,92 ± 0,006 254,15 ± 0,007 228,53 ± 0,005 361,13 ± 0,001 324,98 ± 0,004 302,38 ± 0,025
56 88 79 74
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
83
36
210,12 ± 0,001
50
51 37 32 30
60
48 60 72 6 12 24 36 48 60
150,88 ± 0,024 130,33 ± 0,005 124,09 ± 0,006 255,61 ± 0,014 179,33 ± 0,009 131,79 ± 0,006 91,36 ± 0,001 65,83 ± 0,008 59,60 ± 0,001
70
72 6 12 24 36 48 60 72
38,94 ± 0,001 202,22 ± 0,002 143,77 ± 0,010 112,50 ± 0,007 54,92 ± 0,002 26,57 ± 0,003 23,94 ± 0,001 23,35 ± 0,000
62 44 32 22 16 15 9 49 35 27 13 6 6 6
Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase
Đệm
pH
(IU/mg protein)
% 100 24 114
6,5 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5
234,57 ± 0,008 56,48 ± 0,028 266,53 ± 0,008 322,93 ± 0,020 347,29 ± 0,004 285,43 ± 0,004
Đối chứng Acetate
138 148 122 103 98 105 95 90
6,0 6,5 7,0 7,5 8,0
241,78 ± 0,011 229,21 ± 0,008 245,38 ± 0,020 223,27 ± 0,004 210,21 ± 0,004
Phosphate
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
84
Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase
pH Thời gian (giờ)
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
0 6 12 24 36 48 60 72 0 6 12 24 36 48 60 72 0 6 12 24 36 48 60 72 0 6 12 24 36 48 60 72 0 6 12 24 36 48 60 72
(IU/mg protein) 259,02 ± 0,002 217,52 ± 0,031 166,28 ± 0,005 105,38 ± 0,001 73,33 ± 0,001 67,88 ± 0,004 54,24 ± 0,004 36,70 ± 0,002 322,35 ± 0,016 310,56 ± 0,014 269,06 ± 0,005 267,21 ± 0,006 264,19 ± 0,004 185,66 ± 0,000 122,34 ± 0,009 104,90 ± 0,004 310,76 ± 0,008 301,21 ± 0,002 281,14 ± 0,004 277,53 ± 0,001 275,00 ± 0,004 202,42 ± 0,006 149,52 ± 0,008 116,68 ± 0,003 253,47 ± 0,004 244,02 ± 0,001 217,62 ± 0,008 210,02 ± 0,005 203,59 ± 0,004 174,26 ± 0,006 175,82 ± 0,002 173,58 ± 0,007 209,43 ± 0,001 198,72 ± 0,001 192,58 ± 0,000 143,09 ± 0,008 137,73 ± 0,006 136,56 ± 0,005 125,45 ± 0,005 115,42 ± 0,010
% 100 84 64 41 28 26 21 14 100 96 83 83 82 58 38 33 100 97 90 89 88 65 48 38 100 96 86 83 80 69 69 68 100 95 92 68 66 65 60 55
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
85
Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase
Dung Môi Nồng độ (%)
0 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30 10 20 30
% 100 94 89 87 77 60 57 62 53 53 98 74 69 82 73 72
Đối chứng Acetone n- Butanol Ethanol isopropanol Methanol
(IU/mg protein) 372,91 ± 0,016 349,04 ± 0,031 333,75 ± 0,004 325,95 ± 0,004 287,28 ± 0,003 225,12 ± 0,025 213,53 ± 0,003 229,60 ± 0,001 198,52 ± 0,001 195,79 ± 0,002 365,02 ± 0,050 276,27 ± 0,044 258,24 ± 0,004 307,64 ± 0,001 271,30 ± 0,011 266,82 ± 0,004
Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase
Hoạt tính endoglucanase
Chất tẩy rửa Nồng độ (%)
Đối chứng
Tween 20
Tween 80
SDS
Triton X-100
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 1,0 1,5 2,0 0,5 1,0 1,5 2,0
(IU/mg protein) 213,53 ± 0,004 191,22 ± 0,008 167,83 ± 0,004 160,43 ± 0,006 131,30 ± 0,008 177,48 ± 0,001 160,43 ± 0,004 144,55 ± 0,003 136,56 ± 0,001 97,01 ± 0,005 83,17 ± 0,001 51,70 ± 0,001 33,48 ± 0,004 175,73 ± 0,004 147,67 ± 0,002 134,32 ± 0,003 125,56 ± 0,010
% 100 90 79 75 61 83 75 68 64 45 39 24 16 82 69 63 59
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
86
Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
87
![Luận văn Thạc sĩ: Tổng hợp và đánh giá hoạt tính chống ung thư của hợp chất lai chứa khung tetrahydro-β-carboline và imidazo[1,5-a]pyridine](https://cdn.tailieu.vn/images/document/thumbnail/2025/20250807/kimphuong1001/135x160/50321754536913.jpg)
