Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng bố, mẹ phục vụ công tác chọn tạo giống lúa lai 2 dòng kháng bệnh bạc lá

Chia sẻ: Leon Leon | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:9

Thêm vào BST

Báo xấu

111
lượt xem 7
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Bệnh cháy lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzea pv. oryzea là một trong những bệnh nghiêm trọng nhất trong khu vực trồng lúa của Việt Nam. Để ngăn chặn căn bệnh này, việc sử dụng giống kháng cung cấp hiệu quả kinh tế nhất. Để nuôi kháng hai dòng giống lúa lai, các dòng bố mẹ có chứa gen kháng đóng rất vai trò quan trọng. Trong nghiên cứu này, đánh dấu D A? Được sử dụng cho các gen kháng sàng lọc để cháy lá vi khuẩn trong dòng lúa mẹ. ? pb 181, RG556, P3 và pT818 đánh dấu được sử dụng để chọn...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng chỉ thị phân tử DNA chọn lọc gen kháng bệnh bạc lá ở các dòng bố, mẹ phục vụ công tác chọn tạo giống lúa lai 2 dòng kháng bệnh bạc lá

NG D NG CH TH PHÂN T DNA CH N L C GEN KHÁNG B NH B C LÁ CÁC DÒNG B , M PH C V CÔNG TÁC CH N T O GI NG LÚA LAI 2 DÒNG KHÁNG B NH B C LÁ Phan H u Tôn1, T ng Văn H i1, guy n Văn Giang1, H H u h 2, guy n Trí Hoàn2 SUMMARY Application of D A marker for screening resistance gen to bacterial leaf bligh in parents lines of hybrid rice Bacterial leaf blight disease caused by Xanthomonas oryzea pv. oryzea is one of the most serious diseases in rice -cultivating areas of Vietnam. To prevent this disease, the use of resistant varieties offers the most economic efficiency. In order to breed resistant two line hybrid rice varieties, the parental lines containing resistance genes plays a very important role. In this study, D A markers were used for screening resistance gene to bacterial leaf blight in parent rice lines. pb 181, RG556, P3 and pT818 marker were used to select Xa4, Xa5 Xa7 and Xa21 respective. The results shown that, the resisitance genes homozygote types were selected in 11 mother and 14 father populations. Three strains of bacterial leaf blight were used innoculation on the individuals that contain resistance genes homozygotes were resistant. Keywords: D A marker, resistance gene, Bacterial leaf blight, Hybrid rice. gi ng nh p n i t Trung Qu c. Hư ng ch n I. §ÆT VÊN §Ò t o gi ng kháng b nh ư c coi là có hi u M t trong nh ng hư ng tăng năng qu nhi u m t, v a gi m chi phí, b o v su t lúa g o là s d ng ưu th lai. Hi n nay môi trư ng l i t o ra s n phNm s ch. chúng ta ang s d ng hai h th ng: H i v i lúa lai 2 dòng, ch n t o ra t th ng lúa lai 1 i; 2 Vi n Khoa h c N ông nghi p Vi t N am hai dòng và Trư ng i h c N ông nghi p Hà N lúa lai ba h p có kh năng kháng b nh b c lá ch c n dòng, trong ó lúa lai hai dòng vư t tr i và m t trong hai b m ph i ch a gen kháng chi m ưu th hơn h n. n u ó là gen tr i, ho c c b m u ch a Theo sè liÖu th ng kê hàng năm năng gen n u ó là gen l n. Các t¸c gi cũng ã su t lúa toàn th gi i ư c tính gi m t 10- xác nh ư c gen Xa4, Xa5, Xa7 và Xa21 20% vì các b nh vi khuNn, trong ó có t i kháng ư c h u h t các ch ng b nh b c lá ë 50% là do b nh b c lá gây nên. mi n B c mi n B c Vi t N am (Bïi Träng Thuû v cs, Vi t N am b nh tr nên nghiêm tr ng và phá 2007). ưa gen kháng h u hi u vào m t ho i n ng c hai v , c bi t ®èi víi các gi ng, phương pháp truy n th ng là lai
Backcross, ch n cây có gen kháng lai l i Ch th N pb181 phát hi n gen Xa4 v i gi ng lúa t t ho c tr ng F2 sau ó ch n (Yoshimura et al., 1992) v i primer F5’- cá th ch a gen. ATC-GAT-CGA-TCT-TCA-CGA-GG- N gày nay v i s phát tri n c a công 3’vàR5’-GTG-CTA-TAA-AAG-GCA- TTC-GGG-3’,ch th RG556 ch n l c gen ngh sinh h c, k thu t di truy n phân t kháng Xa5 (McCough et al., 1991) v í ngư i ta ã nh v ư c chính xác các gen trình t m i R5’-AAT-ATT-TCA-GTG- v chØ thÞ liên k t v i chóng. ây các tác TGC-ATC-TC-3’ và F5’-TAG-CTG-CTG- gi ã xác nh gen Xa4 liên k t v i RFLP CCG-TGC-TGT-GC-3’,ch th P3 ch n locus XN pb181 và XN pb78 trên N ST s l c gen kháng Xa7 (Taura et al.,) v i m i 11, v i kho ng cách liên k t u là 1,7 cM R5’-CAT-CAC-GGT-CAC-CGC-CAT- (Yoshimura et al., 1992); Gen Xa5 liên k t ATC-GGA-3’ và F5’-CAG-CAA-TTC- v i ch th RZ390, RG556 và RG207 trên ACT-GGA-GTA-GTG-GTT-3’v ch th N ST s 5, v i kho ng cách liên k t 0-1 cM pTA818 ch n l c gen kháng Xa21 (Ronald (Mc Couch et al., 1991); Gen Xa7 n m trên et al., 1992) v i trình t m i F5’ ATA GCA N ST s 6 liên k t v i ch th Mp3 v i ACT GAT TGC TTT GC 3’ và R5’ CGA kho ng cách di truy n 2,5 cM; Gen Xa21 TCG GTA TAA CAG CAA AAC 3’. liên k t v i ch th pTA818 và pTA248 v i kho ng cách di truy n 0-1cM (Ronal et al., 2. Phương pháp nghiên c u 1992)... Quy trình chi t tách DNA theo N hư v y ch c n dùng k thu t PCR N. Furuya và c ng s , 2003: M u lá cña chúng ta có th phát hi n ư c s hi n di n dßng bè,mÑ ®−îc lÊy ngÉu nhiªn 10 c¸ thÓ c a các gen kháng bÖnh b¹c l¸ trong các th ư c c t và nghi n nh trong 800 l dung h phân ly nhÊt l các dòng có ch a gen d ch chi t tách DNA (tính cho 10ml h n kháng d ng ng h p tö phôc vô tèt h¬n h p dung d ch: 50mM Tris-HCl pH = 8.0; cho c«ng t¸c chän gièng lóa lai 0.25mM EDTA pH = 8.0; 300mM NaCl; 1% SDS còn l i là H2O), thêm 400 l dung II. VËT LIÖU V PH¦¥N G PH¸P N GHI£N d ch 25:24:1 (Phenol: Chlorofom: CøU Isoaminalchohol) ly tâm 13000 vòng/phút 1. V t li u nghiên c u trong 5 phút hút ph n d ch phía trên. Thêm vào ng nghi m 400 l dung d ch 24:1 - 11 dòng m TGMS ã ư c ch n ra t các t h p lai gi a các dòng TGMS v i (Chlorofom:Isoaminalchohol) và ly tâm gi ng ch a gen kháng b nh h u hi u: 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu d ch phía V102; V115; V121; V122; V123; V125; trên. K t t a DNA t ng s b ng 800 l V128; V130; V133; V138; V140. ethanol ho c isopropanol, sau ó ly tâm 5 phút v i t c 13000 vòng/phút, ph n - 14 dòng b l n lư t ch n t 14 t h p: dung d ch phía trên, gi l i ph n k t t a BB5/R23; BB4/RTQ5; BB11/RTQ5; Ch t C t/RTQ5; Ch t c t/R838; BB11/R23; dư i áy ng nghi m. i c n bay hơi, hoà BB21/ c thanh; Chùm bông/ c thanh; tan k t t a b ng 50 l dung d ch TE r i b o BB8/4492; BB5/Q99 BB13/Qu . qu n nhi t -200C ho c 40C.
Ph n ng PCR phát hi n gen kháng b c ch n l c gen Xa4. tr ng thái ng h p t lá Xa4, Xa5 Xa7 và Xa21 tr i i n di s n phNm PCR th y xu t hi n 1 Thành ph n 20µl dung d ch ph n ng v t băng sáng kích thư c 150bp, tr ng thái PCR g m có: 12.24µl nư c c t, 0.1µl Taq ng h p t l n là 130bp và tr ng thái d h p DNA Polymerase, 2.0µl 10X buffer, 1.5µl xu t hi n 2 v t băng 130bp, 150bp. of 50 mM MgCl2, 0.16µl of dNTPs 25 mM, Phân tích 11 qu n th dòng b ã ch n 1µl m i m i, 1µl DNA nguyên b n. PCR ư c d ng ng h p t gen kháng Xa4 3 c a gen Xa4 và Xa 7 và Xa21 ư c th c qu n th . Qu n th BB4/RTQ5 ch n ư c 2 hi n theo chu kì nhi t như sau: 94ºC trong 4 cá th s 4 và 5. Qu n th BB4/4492 ch n phút, 30 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 56ºC ư c 3 cá th , là các cá th s 2, 3 và 4. trong 1 phút, 72º trong 2 phút và 72ºC trong Qu n th BB4/R242 ch n ư c 2 cá th 1 8 phút. PCR c a gen Xa5 ư c th c hi n và 2. N h ng cá th này mang gen kháng theo chu kì nhi t: 94ºC trong 4 phút, 34 chu Xa4 không phân ly qua các th n a. kỳ: 94ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, Tương t như dòng b ch n l c gen 72ºC trong 1 phút 50 giây và 72ºC trong 7 kháng Xa4 11 qu n th dòng m ch n phút. Sau ó, s n phNm PCR ư c c t b ng ư c 4 qu n th ch a gen ng h p t ó là enzyme DraI như sau: 15µl ph n ng g m qu n th V115 cây s 6, qu n th V122 cây có 10µl s n phNm PCR, 0,3µl enzyme DraI s 3 và 4, qu n th V123 cây s 2, 3 và 5, 10unit/µl, 1,5µ buffer B và 3,2µl nư c. H n qu n th V138 cây s 2. Hai qu n th h p ư c 37ºC trong ít nh t 6 gi . S n không ch n ư c gen Xa4 ng h p, ch phNm PCR ư c i n di trên gel agarose ch n ư c d ng d h p t (Rr) ó là các 1,5%. B n gel ư c nhu m b ng Ethidium qu n th V102 và V130. N h ng cá th ch a bromide, ch p nh dư i tia UV. gen kháng d h p này ư c tr ng theo dâi tiÕp ë vô sau. III. KÕT QU¶ V TH¶O LUËN 1. K t qu ch n l c gen Xa4 Gen kháng Xa4 là gen tr i, theo Phan H u Tôn và c ng s (2005) thì gen này kháng ư c 6/10 ch ng b nh b c lá chính c a mi n B c Vi t Nam. Chúng tôi ã s d ng ch th Npb181 (Yoshimura et al., 1992)
Hình 1. i n di s n phNm PCR phát hi n và ch n l c gen kháng Xa4 Lane 1: Marker, lane 2 IR24 ( /C âm tr ng thái ng h p l n), lane 3 BB4 ( /C dương tr ng thái ng h p tr i), lane 4, 6 và 7 các cá th ch a gen kháng ng h p, lane 5 và 9 cá th ch a gen kháng ng h p l n, lane 8 và 10 tr ng thái d h p t 2. K t qu ch n l c gen kháng Xa5 mang gen l n Xa5 sau khi c t b ng enzyme Gen kháng Xa5 là gen kháng l n v s xu t hi n v ch băng kép t i kích thư c kho ng 450bp (hình 2). kháng ư c 10 ch ng/10 ch ng b nh b c lá ë mi n B c Vi t N am. Vì vËy mu n s d ng i v i qu n th dòng b , t ng s 10 ư c gen này thì c b và m u mang gen qu n th ch n l c không ch n ư c cây nào tr ng thái ng h p t l n. S d ng ch th d ng ng h p t l n t c ng h p kháng RG556 ch n l c gen Xa5. i v i ch th (k t qu t ng h p b ng 1), ch có 2 t h p này v t băng ch a gen tr ng thái ng h p ch n ư c cây mang gen d h p t ó là tr i, ng h p l n cũng như d h p u cho qu n th BB5/R23 cây s 3 và t h p k t qu như nhau. phân bi t chúng tôi s BB5/Qu 99 cây s 4, nh ng cá th này d ng enzym DraI, s n phNm PCR c a m u tr ng theo dâi tiÕp ë vô sau Hình 2. i n di s n phNm PCR phát hi n và ch n l c gen kháng Xa5 1. marker; 2. IR24 ( /C âm gen tr ng thái ng h p tr i); 3. BB5 ( /C gen tr ng thái ng h p l n kháng); 4-9. Các cá th trong t h p BB5/R23 l n lư t t cây 1-6; 10-18. Các cá th trong t h p BB5/Qu 99 l n lư t t cây 1-9 i v i qu n th dòng m , 11 qu n th th ch a gen ng h p kháng. Qu n th phân tích ch n ư c 4 qu n th ch a có cá V121 cây s 2, qu n th V122 cây s 8, 9
và 10, qu n th V128 cây s 3 và 4, qu n F1 cũng có th kháng ư c các ch ng b nh th V133 cây s 3 và 4. N goài các cá th b c lá. Gen Xa7 kháng ư c 9/10 ch ng b nh ng h p t kháng chúng tôi còn ch n ư c chính ang t n t i mi n B c Vi t N am. d ng d h p t 4 qu n th trên. Các t h p ch n l c gen kháng Xa7 ã s d ng còn l i gen Xa5 ng h p kháng hay d h p ch th P3. o n DN A nhân lên có kích không ư c tìm th y. thư c v t băng n u m u ch a gen Xa7 ng 3. K t qu ch n l c gen kháng Xa7 h p t tr i là 297bp, ng h p l n Xa7 là 262bp, d h p bao g m c hai v t (hình 3). Gen kháng Xa7 là gen tr i, do vËy ch c n m t trong hai b m ch a gen này thì con lai Hình 3. i n di s n phNm PCR phát hi n và ch n l c gen kháng Xa7qu n th V140 1. Marker; 2. IRBB7 ( /C dương ch a gen ng h p tr i); 3. IR24 ( /C âm không ch a gen ng h p l n) 4-11. Các cá th c a t h p V140 l n lư t t cây s 1-8 Phân tích 7 qu n th dòng b ch n pTA818. V i ch th này v t băng nhân lên l c gen kháng ng h p t tr i nhưng c 7 c a gen Xa21 ng h p tr i là 1100bp, t h p không ch n ư c cá th nào mang ng h p l n 980bp, d h p có c 2 v t gen ng h p tr i. T t c các cá th u băng (hình 4). mang gen ng h p t l n. (b ng 1) i v i các qu n th dòng b ® s ng Tương t , phân tích 11 qu n th dòng l c ®−îc 1 t h p cã cây d h p t , ó là m gen kháng Xa7 ng h p tr i cũng không tìm th y. Tuy nhiên chúng tôi ã BB21/ c thanh víi cây s 1 và 3. ch n ư c các cá th d ng d h p t các Trong 11 qu n th dòng m không tìm qu n th V115, V123 và V140. ây là th y ki u gen ng h p t tr i. Tuy nhiên ngu n v t li u quý ch n ư c dòng m d ng d h p thì ã ư c tìm th y qu n th ch a gen kháng Xa7 nh ng v ti p theo. V135 cây s 2, 3 và 4. Qu n th V120 cây s 2, 3 và 4, qu n th V133 cây s 1, 2 và 4. K t qu ch n l c gen kháng Xa21 10, qu n th V138 cây s 1, 2 và qu n th Gen Xa21 là gen tr i, kháng ư c 7 V140 cây s 4, 5, 6 và 7. Các qu n th còn ch ng trong s 10 ch ng bÖnh b¹c l¸ l i gen u tr ng thái ng h p l n. xác nh và ch n l c gen kháng Xa21 trong các t h p ã s d ng ch th
Hình 4. i n di s n phNm PCR phát hi n và ch n l c gen kháng Xa21 1. Marker; 2. BB21 ( /C ch a gen); 3. IR24 ( /C không ch a gen) 3-11. Các cá th trong qu n th BB21/ c thanh cây t 1-8 B ng 1. T ng h p k t qu ch n l c gen kháng b c lá các qu n th dòng b S cây Gen Xa4 Gen Xa5 Gen Xa7 Gen Xa21 T h p phân tích - -+ + - -+ + - -+ + - -+ + BB5/R23 6 5 1 BB4/RTQ5 10 8 2 BB11/RTQ5 6 6 6 6 6 Ch t C t/RTQ5 7 7 7 7 7 Ch t c t/R838 8 8 8 8 8 BB11/R23 7 7 7 7 7 BB21/Đ c thanh 8 6 2 Chùm bông/Đ c thanh 6 6 6 6 6 BB8/4492 8 7 1 8 8 8 BB5/Q99 9 6 3 BB13/Qu 99 7 7 7 7 7 BB4/4492 9 4 2 3 BB4/R242 10 7 1 2 BB15/Tr c 64 8 8 8 8 8 Ghi chú: -: Không ch a gen +: Ch a gen-+: D ng d h p t . B ng 2. T ng h p k t qu ch n l c gen kháng b c lá các qu n th dòng m S cây Gen Xa4 Gen Xa5 Gen Xa7 Gen Xa21 T h p phân tích - -+ + - -+ + - -+ + - -+ + V102 10 7 3 10 10 10 V115 9 6 2 1 9 8 2 9 V121 7 7 4 2 1 7 7 V122 10 5 3 2 5 2 3 10 10 V123 11 6 2 3 11 8 3 11
V125 6 6 6 6 3 3 V128 10 10 6 2 2 10 10 V130 7 5 2 7 7 4 3 V133 10 10 5 3 2 10 7 3 V138 5 1 3 1 5 5 3 2 V140 11 11 11 5 6 7 4 Ghi chú: -: Không ch a gen +: Ch a gen-+: D ng d h p t
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam IV. KÕt luËn Trên cơ s k t qu s d ng ch th phân t sàng l c m t s qu n th ã ch n ư c các dòng b , m mang gen kháng b c lá sau: Có 7 dòng b mang gen kháng b c lá Xa4 d ng ng h p t là dòng s 4, 5 thu c t h p BB4/RTQ5; Dòng s 2, 3, 4 thu c t h p BB4/4492 và dòng s 1, 2 thu c t h p BB4/R242. Có 2 dòng b mang gen kháng b c lá Xa21 là các dòng s 1, 2 thu c t h p lai BB21/ c thanh, ng th i cũng ã ch n l c ư c m t s cá th ch a hai gen kháng tr ng thái d h p t trên các qu n th dòng m như: Cây s 4 ch a hai gen tr ng thái d h p Xa4 và Xa7 thu c qu n th V115; Cây s 6 ch a 2 gen Xa4 và Xa5 tr ng thái d h p thu c qu n th V122. Qu n th V123 cây s 1 ch a gen kháng Xa4 và Xa7 d h p. Qu n th V130 và V138 cây s 2 ch a gen Xa4 và Xa21 d h p. Qu n th V140 cây s 5, 6 và 7 ch a gen Xa7 và Xa21. Nh ng cá th ch a 2 gen khác nhau tr ng thái d h p là ngu n v t li u vô cùng quý giá t o ra gi ng ch a a gen kháng, ph c v c l c trong công tác ch n t o gi ng lúa lai kháng b nh b c lá. TÀI LI U THAM KH O 1. Phan H u Tôn, 2005. Phân b , c i m gây b nh các ch ng vi khuNn b c lá lúa và phát hi n ngu n gen kháng b ng k thu t PCR. Khoa h c Công ngh và Phát tri n nông thôn 20 năm i m i, t p 1, tr 311-325. 2. Bùi Tr ng Th y, Furuya, ., Taura, S., Yoshimura, A., Lê Lương T , Phan H u Tôn, 2007. M t s nh n xét v s a d ng c a các nhóm nòi vi khuNn Xanthomonas oryzae pv. oryzae gây b nh b c lá lúa mi n B c Vi t Nam (2001- 2005). T p chí BVTV, ISSN 0868-2801, s 3(213)-2007. tr 19-26. 3. Furuya, ., Taura, S., Bui Trong Thuy, Phan Huu Ton, guyen Van Hoan & Yoshimura, A., 2003. “Experimental technique for Bacterial Blight of Rice”. HAU- JICA ERCB Project, Hanoi, 2003, 42 pages. 4. aruto Furuya, Bui Trong Thuy, Matsaru Matsumoto, Seint San Aye & Phan Huu Ton, 2002. “Isolation and preservation of Xanthomonas oryzae pv. oryzae from Vietnam in 2001-2002”. Kyushu Uni. Institute of Tropical Agricaltural, Bull. Vol.25,pp.43-50, Japan. 5. McCouch, S.R., Abenes, M.L., Angeles, R., Khush, G.S. & Tanksley, S.D., 1991. Molecular tagging of a recessive gene Xa5, for resistance to bacterial blight of rice. Rice Genet. Newsl., 8: 143-145. 6. Ronald, P.C., Albano, B., Tabien, R., Abenes, L., Wu, K., McCouch, S.R. & Tanksley, S.D., 1992. Genetic and physical analysis of the rice bacterial blight resistance locus, Xa21. Mol. Gen. Genet., 236: 113-120. 7. Yoshimura, S., Yoshimura, A., Saito, A., Kishimoto, ., Kawase, M., Yano, M., akagahra, M., Ogawa, T. & Iwata, ., 1992. RFLP analysis of introgressed chromosomal segments in three near-isogenic lines of rice bacterial blight resistance genes, Xa1, Xa3 and Xa4. Jpn. J. Genet., 67: 29-37 gư i ph n bi n: 8
T¹p chÝ khoa häc vµ c«ng nghÖ n«ng nghiÖp ViÖt Nam PGS. TS. Nguy n Văn Vi t 9