Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống bạch đàn lai (E. urophylla x E. exserta)

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:107

Thêm vào BST

Báo xấu

37
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài tiến hành thu thập các thông tin về các cặp mồi SSR với trình tự xuôi và trình tự ngược; sàng lọc các mồi SSR để tìm ra các cặp mồi SSR đa hình; xác định 01 – 02 cặp mồi liên quan đến sinh trưởng nhanh và chậm. Mời các bạn cùng tham khảo nội dung chi tiết.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn Thạc sĩ Sinh học: Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống bạch đàn lai (E. urophylla x E. exserta)

i VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ LINH ĐAM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRONG CHỌN GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI (EUCALYPTUS UROPHYLLA x E. EXSERTA) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội, 2017
ii VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ LINH ĐAM NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR TRONG CHỌN GIỐNG BẠCH ĐÀN LAI (EUCALYPTUS UROPHYLLA x E. EXSERTA) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 \ NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS. Nguyễn Việt Cƣờng Hà Nội, 2017
i LỜI CẢM ƠN Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Việt Cường – Trưởng bộ môn Lai giống và sinh học hạt phấn đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn lãnh đạo Viện Nghiên cứu Giống và Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, phòng đào tạo sau đại học Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật – Viện hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam, các thầy cô giáo cùng toàn thể anh chị em đồng nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt chương trình học và luận văn của mình. Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè và các đơn vị công tác đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn của mình. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Linh Đam
ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN…………………………………………………………...…….i MỤC LỤC ........................................................................................................ ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ..................................................................... iv DANH MỤC HÌNH ẢNH ............................................................................... v DANH MỤC BẢNG BIỂU ............................................................................ vi ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................. 1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3 A. Ngoài nƣớc .................................................................................................. 3 1.1. Những nghiên cứu về chọn giống bạch đàn ............................................... 3 1.2. Giới thiệu về chỉ thị SSR và một số ứng dụng trong chọn giống .............. 5 1.2.1. Giới thiệu về chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) ........................... 5 1.2.2. Ưu điểm của chọn giống bằng chỉ thị phân tử ...................................... 7 1.2.3. Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống ........................ 9 B. Trong nƣớc ................................................................................................ 15 1.3. Những nghiên cứu về chọn giống bạch đàn ở Việt Nam ......................... 15 1.4. Ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống ở Việt Nam................... 17 CHƢƠNG II. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................................................... 20 2.1. Mục tiêu.................................................................................................... 20 2.2. Nội dung ................................................................................................... 20 2.3. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 20 2.3.1. Vật liệu sử dụng để sàng lọc các cặp mồi SSR đa hình ...................... 20 2.3.2. Vật liệu sử dụng để phân tích sự liên quan của các cặp mồi SSR với tính trạng sinh trưởng của bạch đàn lai ........................................................... 21 2.3.3. Các cặp mồi SSR sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 24 2.4. Hóa chất và thiết bị .................................................................................. 24
iii 2.4.1. Hóa chất .............................................................................................. 24 2.4.2. Thiết bị................................................................................................. 25 2.5. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 25 2.5.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu lá ................................ 25 2.5.2.Phương pháp đo nồng độ bằng quang phổ kế ...................................... 26 2.5.3. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................... 26 2.5.4. Phương pháp điện di trên gel agarose 1%........................................... 27 2.5.5. Phương pháp điện di trên gel polyacrylamide 5%. ............................. 27 2.5.6. Phương pháp phân tích và xử lý số liệu. ............................................. 29 CHƢƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................. 32 3.1. Thu thập thông tin về trình tự từ các mồi SSR có liên quan đến loài bạch đàn ................................................................................................................... 32 3.2. Sàng lọc các cặp mồi SSR để tìm ra các cặp mồi SSR đa hình ............... 34 3.2.1. Tách chiết ADN tổng số và điện di kiểm tra ...................................... 34 3.2.2. Xác định điều kiện PCR tối ưu cho việc nhân đoạn SSR ................... 36 3.2.3. Kết quả phân tích sự đa hình bằng điện di trên gel polyacrylamide ... 38 3.3. Xác định các cặp mồi SSR liên quan đến sinh trưởng nhanh .................. 47 3.4. Kiểm chứng các chỉ thị có liên quan đến tính trạng sinh trưởng ............. 53 CHƢƠNG IV. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................ 59 1. Kết luận ....................................................................................................... 59 2. Kiến nghị ..................................................................................................... 59 PHỤ LỤC ....................................................................................................... 67
iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Giải thích 1 ADN Acid Deoxyribonucleic 2 AFLP Amplified Fragments Length Polymorphism 3 ARN Acid Ribonucleotide 4 bp Cặp base (base pair) 5 C:I Chloroform : Isoamyl Alcolhol 6 CTAB Cetyl trimethylammonium bromide 7 dNTPs Deoxynucleotide triphosphate 8 EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetate 9 OD Optical density 10 PCR Polymerase Chain Reaction 11 RAPD Random Amplified Polymorphic ADN 12 QTL Quantative trait locus 13 RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism 14 SSR Simple sequence repead 15 TAE Tris acetic EDTA 16 TBE Tris boric EDTA 17 UV Tia tử ngoại (Ultraviolet) 18 UC Bạch đàn lai giữa Uro và Camal 19 UE Bạch đàn lai giữa Uro và Eserta
v DANH MỤC HÌNH ẢNH Bảng Nội dung Trang Hình 3.1 Kết quả điện di ADN tổng số các mẫu lá bạch đàn lai 35 Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi SSR ở 56°C 37 Hình 3.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi SSR ở 58°C 37 Hình 3.4 Mức độ đa hình của một số cặp mồi EMBRA 39 Hình 3.5 Kết quả điện di sản phẩm PCR các mẫu với chỉ thị 46 EMBRA39 Hình 3.6 Kết quả điện di 9 dòng bạch đàn lai với EMBRA229 55 Kết quả điện di 9 dòng bạch đàn lai với EMBRA78 trên gel Hình 3.7 56 polyacrylamide 5% Kết quả điện di 9 dòng bạch đàn lai với EMBRA209 Hình 3.8 56 trên gel polyacrylamide 5%
vi DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng Nội dung Trang 2.1 Danh mục 22 mẫu được sử dụng để sàng lọc cặp mồi SSR đa hình 20 Các dòng bạch đàn lai sinh trưởng nhanh và chậm ở Bầu Bàng 2.2 21 Bình Dương (2002-2012) 2.3 Các dòng bạch đàn lai được sử dụng trong nghiên cứu 22 2.4 Thành phần phản ứng PCR 26 3.1 Kết quả đo OD các mẫu ADN tổng số 35 Nhiệt độ bắt cặp của 205 cặp mồi EMBRA sau khi tối ưu sử dụng 3.2 38 trong nghiên cứu (chi tiết ở phụ lục 2) 3.3 Số alen và hệ số PIC của 106 cặp mồi có đa hình 40 53 chỉ thị SSR có độ đa hình cao được sử dụng để sàng lọc chỉ thị 3.4 42 SSR liên kết với sinh trưởng nhanh 3.5 Các kiểu gen của 104 cây được phân tích bởi chỉ thị EMBRA39 43 3.6 Kết quả điện di của 8 cặp mồi liên quan đến sinh trưởng với 60 dòng 47 3.7 Tương quan của các cặp mồi EMBRA với năng suất bạch đàn lai 50 Các dòng bạch đàn lai thể hiện năng suất cao và thấp tại các hiện 3.8 54 trường khảo nghiệm Bầu Bàng Bình Dương (2002-2010) 3.9 Sự liên kết giữa các chỉ thị SSR với tính trạng (NS - năng suất) 54
1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cải thiện sinh trưởng (năng suất) cây rừng là một mục tiêu chọn giống quan trọng trong nhiều chương trình nghiên cứu lâm nghiệp, tuy nhiên năng suất có hệ số di truyền thấp. Năng suất là một tính trạng số lượng phức tạp thể hiện qua các thông số đường kính và chiều cao, về cơ bản nó là tổng hợp của nhiều tính trạng khác nhau, ảnh hưởng lớn bởi các yếu tố môi trường. Sự khác biệt về năng suất không phải do sự phân li của một hoặc hai gen mà là do sự phân li của rất nhiều gen, với ảnh hưởng của mỗi gen là nhỏ. Tính trạng số lượng không phân li thành các nhóm cụ thể, do đó ta không thể đơn giản chỉ sử dụng các nguyên lí di truyền Mendel để nghiên cứu. Các nghiên cứu về chọn giống cây trồng lâm nghiệp trong nước và quốc tế có sự trợ giúp của công nghệ sinh học đã có những thành công nhất định, như nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống bạch đàn (E. globulus, E. nitens) đã được Bundock và cộng sự 2008; Freeman và cộng sự 2009 cho thấy các chỉ thị SSRs, RAPDs có tương quan đến sinh trưởng về đường kính cây với mức đóng góp biến dị kiểu hình từ 3,8 đến 17,9%, ngoài ra tác giả cũng chỉ ra một số tính trạng về chất lượng như mật độ gỗ, hàm lượng xenlulô, lignin cũng đóng góp cho mức biến dị từ 5,6 - 12,3% [20] [28]. Theo Brondani và cộng sự, (2006) trên bản đồ liên kết cho loài E. grandis, trong số 172 chỉ thị có 153 (89%) chỉ thị giữ nguyên vị trí trên bản đồ chung cho Eucalyptus. Trong khi đó trên bản đồ liên kết cho loài E. urophylla có 140 trên 152 (92%) chỉ thị giữ nguyên vị trí trên bản đồ chung [19]. Anand Raj Kumar Kullan và cộng sự (2012) đã nghiên cứu về sự di truyền của các tính trạng tăng trưởng, tỷ trọng gỗ và biểu hiện của gen ở trong hai gia đình lai trở lại giữa loài Bạch đàn urô và Bạch đàn grandis đã xác định được 2 QTL đường kính thân và 12 QTL cho tỷ trọng gỗ. Các QTLs cho đường kính và tỷ trọng gỗ cho thấy mức đóng góp biến đổi kiểu hình là 3,1 -
2 12,2%. Như vậy cả tính trạng chất lượng lẫn số lượng ở các nghiên cứu chỉ đóng góp dưới 18% biến dị cho các tính trạng nghiên cứu. Một gợi ý của Bala R. Thumma và cộng sự 2010 là nghiên cứu chọn giống truyền thống có sự trợ giúp của công nghệ sinh học (chỉ thị phân tử liên kết với tính trạng sinh trưởng) để tăng hiệu quả lựa chọn cho những tính trạng số lượng có di truyền thấp, như là năng suất vẫn là cách tiếp cận có hiệu quả. Đây chính là hướng đề tài“ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử SSR trong chọn giống bạch đàn lai (E. urophylla x E. exserta)” được đề xuất và thực hiện [41]. Luận văn này là một phần của đề tài “Nghiên cứu chọn giống bạch đàn lai bằng chỉ thị phân tử” giai đoạn 2012-2016, do TS. Nguyễn Việt Cường làm chủ nhiệm đề tài và tôi là cộng tác viên đề tài.
3 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU A. Ngoài nƣớc 1.1. Những nghiên cứu về chọn giống bạch đàn Các loài bạch đàn (Eucalyptus) có nguồn giống từ Australia và Indonesia đã được gây trồng rộng rãi trên thế giới và đóng vai trò hết sức quan trọng trong trồng rừng cung cấp nguyên liệu giấy, ván dăm, gỗ xây dựng và đồ nội thất. Tổng diện tích rừng trồng bạch đàn trên thế giới đến năm 2000 là 17,9 triệu ha, tập trung chủ yếu ở các nước như Braxin, Công Gô, Trung Quốc, Ấn Độ, Nam Phi. Chỉ riêng các nước khu vực Đông Nam Á và Nam Trung Quốc (gồm có 2 tỉnh Quảng Đông và Quảng Tây), diện tích trồng rừng keo và bạch đàn lên tới khoảng 7 triệu ha (Harwood và Nambiar, 2014) [30]. Nghiên cứu chọn giống bạch đàn là một khâu quan trọng trong chiến lược cải thiện giống nhóm loài bạch đàn. Mặc dù, nhiều loài bạch đàn có biên độ sinh thái rộng nhưng khi được trồng trên nhiều quốc gia khác nhau thì bạch đàn có sự phân hóa mạnh về sinh trưởng. Các chương trình khảo nghiệm bạch đàn ở một số quốc gia đã và đang được chú trọng như Công Gô (1970 - 1981) đã khảo nghiệm trên 100 xuất xứ của loài Bạch đàn urô. Hafeez. M, Seikh M.I. (Pakistan) (1972) đã khảo nghiệm 22 xuất xứ của loài Bạch đàn caman với nguồn hạt giống được nhập từ Úc, qua khảo nghiệm tác giả đã chọn ra được 6 xuất xứ thích hợp và nhập nội hạt giống để trồng trên quy mô lớn [29]. Chew T.K. (1980) đã khảo nghiệm 10 loài tại 3 nơi khác nhau trên bán đảo Malaysia. Sau 10 năm trồng, tác giả nhận thấy sinh trưởng tốt nhất là loài Bạch đàn caman (2 xuất xứ Bắc Úc) và Bạch đàn degluta, các loài triển vọng khác là Bạch đàn brassiana, Bạch đàn urô và Bạch đàn tere [25]. Tại Nam Phi từ năm 1973 - 1974 đến năm 1980, Darrow W.K. (1983) đã tiến hành 9 khảo nghiệm phối hợp của 26 xuất xứ Bạch đàn caman và 23 xuất
4 xứ của Bạch đàn tere. Kết quả cho thấy: ở những vùng ẩm thì Bạch đàn grandis cho năng suất cao nhất, sau đó đến Bạch đàn tere, còn ở những vùng khô hạn và có sương giá thì Bạch đàn caman lại cho năng suất cao hơn. Rao D.V. (1984) tiến hành khảo nghiệm nhiều xuất xứ khác nhau của Bạch đàn caman, Bạch đàn tere tại các vùng Pradesh, Maharastra và Haryana của Ấn Độ. Qua điều tra sinh trưởng cho thấy có 10 xuất xứ Bạch đàn caman và 5 xuất xứ Bạch đàn tere sinh trưởng tốt [34]. Ngoài ra, các năm 80 - 90 của thế kỷ XX còn có nhiều tác giả nghiên cứu về chọn loài và xuất xứ bạch đàn ở nhiều nước khác nhau như: Agpaoa A.C (1986) khảo nghiệm loài và xuất xứ bạch đàn tại Philippine. Watanabe H. (1987) tiến hành khảo nghiệm các xuất xứ của loài Bạch đàn caman tại Thái Lan [43]. Sun D., Dickinson G.R. (1997) thí nghiệm tuyển chọn 28 loài trên đất mặn và đất không mặn tại miền Đông bắc nhiệt đới khô ở Úc [40]. Năm 1975 Viện nghiên cứu lâm nghiệp Quảng Tây (Trung Quốc) đã lai giữa Bạch đàn saligna với Bạch đàn liễu tạo ra được một số tổ hợp lai có khả năng vượt trội hơn loài Bạch đàn liễu tới 82% về thể tích thân cây, trong đó tổ hợp lai nghịch Bạch đàn liễu x Bạch đàn saligna có sinh trưởng nhanh hơn tổ hợp lai thuận Bạch đàn saligna x Bạch đàn liễu (Shuxiong, 1989) [39]. Hiện các giống lai được trồng chủ yếu ở các vùng ven biển vì chúng có khả năng chịu gió bão tốt đồng thời sinh trưởng nhanh. Từ năm 1989 Viện lâm nghiệp nhiệt đới của Trung Quốc cũng tạo ra 204 cây lai từ các cặp bố mẹ giữa Bạch đàn urô với các loài Bạch đàn tere, Bạch đàn caman, Bạch đàn liễu, Bạch đàn grandis, Bạch đàn saligna và Bạch đàn pellita. Trong đó một số cá thể cây lai từ các tổ hợp Bạch đàn urô x Bạch đàn tere và Bạch đàn urô x Bạch đàn caman đã có ưu thế lai rõ rệt về sinh trưởng so với bố mẹ của chúng, cây lai có thể tích vượt bố mẹ với các trị số tương ứng là 120,7% và 89,4% (Xiang & Wang, 1996; Shen, 2000) [38], [44] .
5 Các tổ hợp lai thuận nghịch giữa Bạch đàn urô và Bạch đàn grandis cũng đã được tạo ra ở Trung Quốc (Wang ADN Yang, 1996, Rezende, G. và Rezende, M., 2000; Bouvet và Combes, 1997), ở Brazil và ở Indonesia (Hardlyanto & Tridasa, 2000) [15], [35], [42] . Hiện các giống này đang được trồng phổ biến tại Trung Quốc, năng suất các giống này gấp rưỡi các giống Bạch đàn urô thuần. Trong những năm gần đây ở các nước Đông Nam Á và Nam Trung Quốc (Quảng Tây và Quảng Đông) ngoài 3 loài keo còn có 5 loài bạch đàn (Bạch đàn grandis, Bạch đàn urô, Bạch đàn pellita, Bạch đàn globulus, Bạch đàn dunnii) và bạch đàn lai là cây trồng chủ đạo và các chương trình cải thiện giống cường độ cao cũng chỉ tiến hành với 2 nhóm loài này, với diện tích trồng rừng lên tới 7 triệu ha (Hawood & Nambiar, 2014) [30]. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc lựa chọn các cặp bố mẹ trong lai giống có tác động nhiều đến biểu hiện của ưu thế lai, thường các cặp bố mẹ có sinh trưởng tốt cho ưu thế lai mạnh hơn các cặp bố mẹ có sinh trưởng kém. Ngoài ra các nghiên cứu cũng cho thấy ảnh hưởng của việc chọn loài để lai cũng tác động đến biểu hiện ưu thế lai, các loài có quan hệ di truyền xa nhau cho ưu thế lai mạnh hơn những loài có quan hệ gần gũi (Brawner và cộng sự, 2012) [23]. Nhìn chung, các công trình khảo nghiệm trên đều cho thấy các loài Bạch đàn urô, Bạch đàn caman, Bạch đàn liễu... có nhiều xuất xứ tốt, thích nghi cao với điều kiện hoàn cảnh gây trồng khác nhau. Đây cũng là những loài mà đề tài sẽ chọn sử dụng làm vật liệu nghiên cứu lai giống với sự trợ giúp của chỉ thị phân tử (MAS). 1.2. Giới thiệu về chỉ thị SSR và một số ứng dụng trong chọn giống 1.2.1. Giới thiệu về chỉ thị SSR (Simple Sequence Repeat) SSR còn được gọi là Microsatellite được Litt và Luty phát triển thành một kỹ thuật chỉ thị phân tử năm 1989 (Litt M., Luty J. A. (1989) [32]. Microsatellite có chứa các trình tự ADN, hiện nay đã có những nghiên cứu về
6 vai trò chức năng của chúng trong hệ gen của cây bạch đàn. Chỉ thị microsatellite đóng một vai trò quan trọng trong cây bạch đàn ở các cấp độ khác nhau của sự cải thiện di truyền. Các chỉ thị microsatellite có tiềm năng phân tích được sự liên quan chặt chẽ giữa các cá thể và ngày càng phát hiện được nhiều hơn nữa các SSR trên các nhóm liên kết và các nghiên cứu di truyền khác. Hiện nay, đã phát hiện được một số lượng lớn các microsatellite có mối liên hệ từ nhóm liên kết (LG) đến vị trí vật lý (Murugan Sumathi and Ramasamy Yasodha, 2014). Gần đây, 223 marker microsatellite mới đã được khảo sát về đa dạng alen và được bổ sung vào bản đồ bạch đàn SSR hiện có, nâng tổng số các lôcut SSR đến hơn 400 và giúp nâng cao việc so sánh bản đồ hệ gen (Grattapaglia et al, 1996) [27]. Sự thay đổi các alen xảy ra ở lôcut SSR là kết quả của sự thay đổi số lần lặp lại của các đơn vị. Sự khác nhau về độ dài ở lôcut SSR được phát hiện bởi sự nhân đoạn ADN nhờ PCR dùng một cặp mồi oligonucleotide có trình tự bổ sung với SSR. Kích thước của sản phẩm PCR được xác định một cách chính xác bằng điện di trên gel polyacrylamide. Sự khác nhau về độ dài có thể rất nhỏ (2bp). SSR thích hợp cho lập bản đồ, nghiên cứu QTL và in dấu ADN (ADN fingerprinting). SSR cho thấy mức độ đa hình cao ở hầu hết các loài thực vật, thậm chí trong các kiểu gen có quan hệ gần gũi, với số lượng lớn các alen tìm thấy ở mỗi lôcut và dị hợp tử được đánh giá thường lớn hơn 0,7. Di truyền đồng trội được quan sát ở các alen này ở nhiều loài khác nhau (Dow và cộng sự., 1995; Rongwen và cộng sự., 1995) [26], [36]. Vì SSR được phân tích nhờ PCR, chỉ đòi hỏi một lượng nhỏ ADN mẫu, phản ứng có thể hoàn thành (từ chuẩn bị mẫu đến phân tích kiểu gen) chỉ trong hai ngày. Mỗi mồi có từ 1 đến 12 lôcut được tổ hợp trong một phản ứng PCR cho phép đồng thời ghi nhận các kiểu gen nhiều lôcut, điều này tiết kiệm đáng kể thời gian và hoá chất.
7 Có thể tóm lại một số ưu điểm của chỉ thị SSR được các nhà di truyền và chọn giống thực vật quan tâm là: Chúng có tính đa hình rất cao cho phép phân biệt một cách chính xác các cá thể có quan hệ họ hàng gần; Là chỉ thị “đồng trội” (có thể phân biệt được đồng hợp tử AA, hay BB, hoặc dị hợp tử AB); Kỹ thuật đơn giản, tiện lợi; Chúng tồn tại rất nhiều và phân bố đều trong bộ gen thực vật; Một trong những ưu điểm đặc biệt là số liệu khi phân tích chỉ thị SSR có tính lặp lại rất cao và có thể dễ dàng chia sẻ giữa các nhóm nghiên cứu và phòng thí nghiệm (Brondani và cộng sự 1998) [16]. Chính vì những ưu điểm trên đây mà chỉ thị SSR đã ứng dụng rất nhiều trong các nghiên cứu chọn giống cây trồng theo hướng chọn lọc các tính trạng có lợi như chống chịu sâu bệnh, trong các nghiên cứu phân tích sự đa dạng bộ gen, trong các nghiên cứu lập bản đồ gen (Yasodha và cộng sự 2008) [45]. Hạn chế của chỉ thị SSR là đòi hỏi công sức và giá thành cao trong việc xây dựng các cặp mồi đặc hiệu cho mỗi lôcut đa hình, bao gồm việc tách dòng và đọc trình tự một số lượng lớn các đoạn ADN hệ gen chứa SSR. Tuy nhiên, nhiều thành công đạt được trong lĩnh vực này khiến giá thành của chỉ thị có thể được làm giảm đi (Brown và Kresovich, 1996) [19]. So sánh giữa ưu nhược điểm của từng phương pháp cộng với mục đích của vấn đề nghiên cứu, đề tài chọn chỉ thị SSR để nghiên cứu chọn giống bạch đàn lai và RADP trong nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các bố mẹ tham gia lai giống. 1.2.2. Ưu điểm của chọn giống bằng chỉ thị phân tử Các cá thể trong cùng một quần thể của một loài sinh sản hữu tính sẽ có một mức độ của sự biến đổi di truyền gây ra bởi đột biến, chèn/mất (INDELS), đảo đoạn, trùng lặp, và đảo vị trí. Biến đổi như vậy có thể được
8 phát hiện và sàng lọc bằng cách sử dụng chỉ thị phân tử, hoặc di truyền. Theo định nghĩa, chỉ thị phân tử là lôcut gen có thể dễ dàng theo dõi và định lượng trong một quần thể và có thể được liên kết với một gen hoặc đặc điểm đặc biệt quan tâm (Alice C. Hayward và cộng sự, 2014). Kiểu gen của các lôcut chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất kỳ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể. Số lượng các chỉ thị phân tử là cực lớn, trong khi số lượng của các chỉ thị hình thái là hạn chế. Các alen của chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội - lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai. Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp. Sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS phụ thuộc vào các yếu tố: Bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các vùng tương đồng (uniformly-spaced polymorphic markers) để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm. - Mối liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen hay các QTLs. Có 3 kiểu quan hệ giữa chỉ thị và gen quan tâm: + Chỉ thị phân tử được định vị ngay trong gen được quan tâm. Đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm thấy loại chỉ thị này. + Chỉ thị có mối liên kết không cân bằng (linkage disequilibrium - LD) với gen được quan tâm. Đây là nhóm chỉ thị có khuynh hướng di truyền cùng nhau. Mối quan hệ này tìm thấy khi gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau.
9 + Chỉ thị có mối liên kết cân bằng (linkage equilibrium - LE) với gen được quan tâm. Đây là trường hợp khó cho việc ứng dụng MAS. - Mức độ chính xác của MAS phụ thuộc rất lớn vào mối liên kết chặt giữa gen quan tâm và chỉ thị phân tử. Mặc dù chỉ thị và gen có mối quan hệ về di truyền, nhưng mối liên kết này có thể bị phá vỡ do có sự tái tổ hợp giữa chúng. Mối liên kết giữa chỉ thị phân tử và gen quan tâm được tính bằng khoảng cách di truyền, phản ánh tỷ lệ tái tổ hợp giữa gen quan tâm và chỉ thị. Vì thế, để có độ tin cậy cao, làm giảm sự tái tổ hợp giữa gen quan tâm và chỉ thị chỉ áp dụng MAS với những chỉ thị cách gen quan tâm không quá 5 cM và với những nhóm chỉ thị nằm cả 2 phía của gen. Theo lý thuyết, với những chỉ thị cách gen trong khoảng 5cM, độ chính xác thu được khi sử dụng MAS là 99,75% hoặc có thể cao hơn. 1.2.3. Một số ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống Chỉ thị phân tử có thể được sử dụng để nghiên cứu các mô hình di truyền, biến đổi gen, hiện tượng tiến hóa và chọn lọc, mối liên kết alen-alen, và các liên kết giữa alen và kiểu hình. Các ứng dụng của chỉ thị phân tử có thích hợp hay không phụ thuộc vào tính chất vật lý của nó và vị trí của bộ gen, các chi phí liên quan, dễ sử dụng, và hiệu suất cần thiết. Marker phân tử đã được áp dụng thành công trong khoa học thực vật theo hướng di truyền và lập bản đồ vật lý của bộ gen, xác định các gen kiểm soát quá trình khác nhau và kiểu hình, đa dạng di truyền và phân tích tiến hóa, trợ giúp cho cải thiện giống cây trồng (Bala Thumma và cộng sự 2015) [24]. Trước đây, vị trí của một chỉ thị gen thường không rõ và không cần thiết cho mục đích của sự đa dạng và phân tích và ứng dụng giống tiến hóa. Với những tiến bộ trong công nghệ gen, sử dụng chỉ thị phân tử khi biết vị trí gen và điều kiện môi trường đang trở nên phổ biến hơn và được áp dụng ngày càng phổ biến với phạm vi mục tiêu ngày càng đa dạng.
10 Chỉ thị phân tử cung cấp các ứng dụng phong phú trong nghiên cứu di truyền phân tử và chọn giống. Mặc dù ngày nay khả năng tiếp cận và cải tiến các công nghệ gen ngày càng phát triển, nhưng chỉ thị phân tử vẫn là thành phần thiết yếu của tất cả các phân tích di truyền quy mô lớn, không chỉ bằng việc lắp ráp bộ gen mà còn chứng minh được giá trị của chúng trong kiểu gen, so sánh và tiến hóa gen, lập bản đồ tính trạng, chọn giống. Chỉ thị phân tử đó có khả năng tiếp tục được phát triển và áp dụng thành công đối với tiến bộ gen thực vật trong nhiều năm tới (Alice C. Hayward và cộng sự, 2014). Chỉ thị phân tử thường được phân thành chỉ thị dựa trên cơ sở phép lai ADN và các chỉ thị dựa trên cơ sở phản ứng PCR. Chỉ thị phân tử được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu lập bản đồ gen phục vụ cho chọn tạo giống cây trồng ở nhiều đối tượng khác nhau. Tính ưu việt của các chỉ thị phân tử không những ở tiềm năng nghiên cứu về đa dạng di truyền giữa các giống trong cùng một loài mà còn theo dõi được sự di truyền bền vững và ổn định của những chỉ thị này trong các thế hệ sau. Sự xuất hiện của các chỉ thị còn cho phép dự đoán khả năng di truyền của những tính trạng quan trọng liên kết với nhau trên cùng một nhiễm sắc thể. Khác với các tính trạng về hình thái, sinh lý dễ bị ảnh hưởng bởi môi trường, các chỉ thị phân tử không bị biến đổi dưới tác động ngoại cảnh, có mặt trong tất cả các giai đoạn sinh trưởng của cây. Sử dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống cây rừng đã được thực hiện tại nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt các nước có nền lâm nghiệp phát triển mạnh và mang tính hàng hóa cao như Thụy Điển, Braxin, Australia, Trung Quốc... Việc chọn lọc có sự trợ giúp của chỉ thị phân tử là công cụ tiềm năng giúp tăng cường hiệu quả công tác chọn tạo giống. Khoa Tế bào sinh học của trường Đại học Brasilia (Brazil) đã nghiên cứu phát triển lập bản đồ gen liên kết sử dụng chỉ thị SSR cho Bạch đàn grandis và Bạch đàn urô. Nghiên cứu này xây dựng một số lượng lớn các chỉ thị SSR
11 có thể sử dụng được đối với các loài bạch đàn, các chỉ thị SSR này chứa đựng rất nhiều thông tin hữu ích cho việc thiết lập bản đồ và xác định các đặc điểm cá thể và đã chứng minh được khả năng xây dựng một bản đồ liên kết dựa vào các chỉ thị SSR một cách hoàn thiện. Họ đã xây dựng được một bộ bao gồm 70 chỉ thị SSR ký hiệu từ EMBRA1 đến EMBRA70 (Eucalyptus microsatelites from Brazil) với tính đa hình cao khi sử dụng với Bạch đàn grandis và Bạch đàn urô (Brondani và cộng sự 1998, 2002) [16], [17]. Một nghiên cứu tiếp tục của nhóm tác giả Brondani và cộng sự (2006), đã mô tả sự phát triển của một bộ mới bao gồm 230 chỉ thị SSR, ký hiệu EMBRA 71... EMBRA395 cho bạch đàn. Từ 380 chỉ thị ban đầu được nghiên cứu đánh giá, có 230 chỉ thị có tính đa hình cao, có thể dễ dàng dùng để giải thích cho các kiểu gen, các kiểu gen này có thể sử dụng để đánh dấu các cá thể độc lập và lập bản đồ gen liên kết. Trong số các chỉ thị SSR này, đã có 48 chỉ thị phát triển riêng cho Bạch đàn globulus (đặt tên là EMCRC), 8 chỉ thị phát triển cho Bạch đàn nitens (ký hiệu EMEn), 8 chỉ thị cho Bạch đàn sieberi (ký hiệu EMEs), 13 chỉ thị cho Bạch đàn leucoxyon (ký hiệu EMEl). Và gần đây đã có thêm 35 chỉ thị SSR được phát triển dựa vào chuỗi ADN lục lạp (cp-ADN) của Bạch đàn globulus. Tại trường Đại học Tasmania, Úc, Bundock và cộng sự (2000) cũng đã nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử RAPD và SSR để lập bản đồ liên kết của cho cây Bạch đàn globulus. Trong nghiên cứu này nhóm tác giả đã sử dụng các chỉ thị SSR phát triển cho loài Bạch đàn urô và Bạch đàn grandis để lập bản đồ liên kết cho cây Bạch đàn globulus. Các chỉ thị SSR được sử dụng như EMBRA17, EMBRA18, EMBRA5, EMBRA12, EMBRA16, EMCRC7, EMCRC6,... Kết quả nghiên cứu đã lập được các bản đồ sử dụng chỉ thị RAPD và chỉ thị SSR cho cả nhóm cây bố và cây mẹ. Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các chỉ thị SSR phát triển cho các loài bạch đàn có quan hệ
12 gẫn gũi với nhau như các loài bạch đàn trên đều có thể sử dụng để lập bản đồ liên kết [21]. Năm 2002, tại Mỹ, Agrama và cộng sự (2002) công bố đã lập bản đồ gen liên kết cho Bạch đàn caman, nhóm tác giả đã sử dụng các dữ liệu phân ly từ 92 cây con Bạch đàn trắng có quan hệ gần gũi với nhau, kỹ thuật để xây dựng bản đồ gen liên kết dựa vào các chỉ thị phân tử RAPD, RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) và SSR. Các dữ liệu được phân tích mối liên kết sử dụng phần mềm lập bản đồ gen JOINMAP. Phân tích mối liên kết đã xác định được 168 chỉ thị phân tử bao phủ bộ gen của Bạch đàn caman với độ dài 1.236 cM. Số lượng các nhóm liên kết được xác định tương đương với số lượng chromosomes (n=11) của loài bạch đàn. Bản đồ gen này được sử dụng để xác định các vùng hay các đoạn gen của loài Bạch đàn caman liên quan đến một số tính trạng quan trọng như xác định chất lượng gỗ, tinh dầu. Trong số 18 chỉ thị SSR sử dụng để nghiên cứu phân tích đã có tới 14 chỉ thị là EMBRA1, EMBRA2, EMBRA3, EMBRA5, EMBRA8, EMBRA9, EMBRA10, EMBRA11, EMBRA14, EMBRA15, EMBRA16, EMBRA17, EMBRA19 và EMBRA20 được dùng để lập bản đồ gen liên kết. Với 14 chỉ thị SSR này mang lại thông tin rất có ý nghĩa trên bản đồ gen của bạch đàn Bạch đàn caman [14]. Chọn lọc gián tiếp dựa trên liên kết chỉ thị phân tử với lôcut tính trạng số lượng (QTL) có thể kể đến công trình nghiên cứu của Verhaegen và cộng sự (1997) về giống bạch đàn lai (Bạch đàn urô x Bạch đàn grandis) đã sử dụng chỉ thị RAPDs xác định được 4 QTL có liên quan đến độ thẳng thân với mức đóng góp cho biến dị kiểu hình là 5,1-11%. Tiếp đến là nghiên cứu của Byrne và cộng sự, (1997) đã ứng dụng chỉ thị RFLPs cho sinh trưởng của Bạch đàn nitens cho thấy đã xác định được 3 QTL có mức đóng góp biến dị kiểu hình là 10,3-14,7%. Còn nghiên cứu Bundock và cộng sự, (2008) về ứng dụng chỉ thị RAPDs và SSRs cho sinh trưởng về đường kính của Bạch đàn globulus, đã